一个新的具有特殊结构和潜在趋化活性

1、一个新的具有特殊结构和潜在趋化活性的人细胞因子趋化素样因子 1 的克隆和特性研究韩文玲 娄雅欣 唐军民 张颖妹 陈英玉 马大龙 等细胞因子是在免疫和炎症反应中起重要作用的小分子蛋白质。 近年来， 越来越多的细胞因子得以发现。 本文介绍一种新的细胞因子趋化素样因子1（CKLF1）的发现和特性研究。 CKLF1全长 cDNA序列包括 530 个碱基，有一个编码 99 个氨基酸的完整开放读码框架。 CKLF1与已发现的其它细胞因子没有明显的序列同源 性。CKLF1在 PHA刺激的 U937细胞中的表达可被 IL-10 所部分抑制。重组的 CKLF1能够明显趋化嗜中性细 胞、单核细胞和淋巴细胞，同时，

2、它能够刺激小鼠骨骼肌细胞的增殖。以上结果表明 CKLF1 可能在炎症和 骨骼肌再生过程中发挥重要作用。关键词：白细胞介素 10；骨骼肌细胞；剪切；抑制性减数杂交前言 细胞因子是一群在免疫和炎症反应中起重要作用的小分子蛋白质。总的来说，细胞因子在细胞被活化 后呈一过性诱导表达，其表达受多种因素调控。细胞因子包括白细胞介素、肿瘤坏死因子、生长因子和趋 化因子等 （1）。其中，趋化因子是结构相似的小分子蛋白质，在吸引和活化白细胞过程中起重要作用。趋化 因子在蛋白质水平上含有 4 个保守的半胱氨酸， 根据前两个半胱氨酸的相对位置不同， 趋化因子可分为 CXC （）、CC（）、C（）和 CX3C（）4

3、个亚家族， C代表半胱氨酸， X 代表任一氨基酸 （2）。以前的研究表明：人前单核细胞系 U937 细胞在 PHA 刺激下，能够产生多种细胞因子；而白细胞介素10 能抑制多种细胞因子的产生 （3）（4）。基于以上研究结果， 我们设计了一条新的技术路线来发现新的细胞因 子。利用抑制性减数杂交技术，从 PHA刺激的 U937 细胞中克隆到能被 IL-10 所抑制的 cDNA序列，其中一 个序列编码一个新的分泌性细胞因子，含有CC家族趋化因子所具有的特征性结构即两个连续的半胱氨酸，并对多种白细胞具有趋化作用，该因子被命名为趋化素样因子1（ CKLF1）。但是，该因子与其它 CC家族趋化因子有如下区别

4、： （ 1）CKLF1成熟蛋白质只有一个连续的 CC结构，其羧基端没有其它的半胱氨酸； （ 2） CKLF1与已发现的其它 CC家族趋化因子没有明显序列上的同源性；（ 3）CKLF1至少存在其它三种不同的RNA剪切形式；（ 4）它对骨骼肌细胞有刺激作用。 CKLF1可能代表一个新的家族的趋化因子。因此，我们将 其命名为趋化素样因子 1，其相应的变异体命名为 CKLF2，CKLF3和 CKLF4。材料和方法抑制性减数杂交（ SSH）SSH 的操作方法按 Diatchenko 报道的进行操作(5)用 CLONTECH公司的 PCR-Select TM cDNASubtraction Kit 。 S

5、SH技术把抑制性 PCR(Suppression PCR)和传统的减数杂交方法相结合 (16) ，可用于比较 两个群体的 mRNA，得到在一组 mRNA中表达，而在另一组 mRNA中低表达或不表达的基因。先将mRNA反转录为 cDNA，其中含有特异表达基因的样本为 tester ，另一组为 driver ， tester 和 driver cDNA 杂交，去 除杂交体 cDNA，没有形成杂交体的 cDNA即是在 tester 中特异表达或高表达的基因，而在 driver 中不表 达或低表达的基因。抑制性 PCR在选择性扩增特异基因的同时，抑制自身的扩增，使杂交阳性率更高。在 SSH操作过程中，

6、人前单核细胞系 U937 细胞由本室长期传代培养。细胞培养在含10%胎牛血清 ，100U/ml青链霉素的 RPMI1640培养基中。用于 SSH操作的 U937 细胞批量培养至 2107细胞，离心收集细胞 , 用 Hanks液洗三遍后悬于含 10ng/mlPHA 的 10% FCS RPMI1640中, 其中一半即 1107 细胞作为 tester, 另 一半细胞中加入终浓度为 100ng/ml 的 IL-10 作为 driver 。继续培养 8 小时后收集细胞， 提取 mRNA，取 2 gmRNA合成双链 cDNA，用 RsaI 切后，将 tester 分为两组，在 T4 DNA连接酶作用下

7、，分别连上 Adapter1 和 Adapter2 ，进行两轮杂交，杂交产物用作 PCR 扩增的模板。将杂交产物稀释 1000 倍，利用试剂盒提供 的 PCR引物，进行第一轮 PCR，扩增 27 轮，然后将第一轮 PCR产物稀释 10 倍，分别以 NESTED PCR引物 1 和 NESTED PCR引物 2R 进行第二轮 PCR，扩增 15 轮，得到的扩增产物即为差异基因片段， Glassmilk 回收 2001600bp 的片段，克隆到 pGEM-T easy 中，连接产物转化 XL-Blue 菌，选白色克隆。得到约 100 个克 隆，随机筛选 15 个变大明显的克隆，纯化质粒 DNA，用

8、 ALF 快速测序仪进行序列分析，并在NCBI中进行序列同源性比较。生物信息学将来自 PHA刺激的 U937 细胞文库的 EST片段与 GenBank TBLASTN的 EST数据库进行比较。将与 CKLF1 片段有高度同源性的序列(50 个以上碱基，95%以上同源性)，通过 EST Assembly Machine (http:/www.tigem.it). 进行 EST拼接( 6)。用于 CKLF1拼接的 EST 片段的登记号为 W38899, N95062, AA429945, AA987264, AA927461, W19056, N89912, AA516431, AA479657,

9、 AA455042, AA989129, AF151058， NM-016951，W52820。在 PHA刺激的 U937 细胞中得到 CKLF1的全长序列，测序证明 EST 拼接正确。 CKLF1 可 能 的 信 号 肽 切 割 位 点 分 析 用 PcGene 、 Prosite 软 件 和 Signal P server (http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP) 进行分析。 CKLF1 的染色体定位用HTGS 数据库分析()。包含 CKLF1基因的两个染色体片段的登录号为 AC010542和 AC0

10、18557。Northern Blot 分析我们对目的基因的表达情况进行了 Northern Blot 分析，细胞总 RNA的提取用生命公司的 TRIZ0LTM试剂提取。分别取 20 g tester 或 driver RNA ，在 1.5%的甲醛变性胶中电泳，通过毛细管吸引法将RNA转到尼龙膜上。探针的标记和杂交操作参照DUPONT公司 Random Primer Fluorescein Labeling kit withAntifluorescein-HRP （DuPont NENNELMGC-803）试剂盒说明书。标记探针的核苷酸均为来源于SSH杂交得到的全长 EST片段（ CKLF1全

11、长 cDNA片段中的 53-530 位碱基）。寡核苷酸用于扩增 CKLF1及其变异体的全长 cDNA片段的引物为： P1 5 GCA, AGA, AGC,GGG, AAG, CCG, A 3和 P2 5 GGA, AGA, ATA, CAG, AAA, TAT, GTT, TAA, TAC 3； 用于扩增 CKLF1及其变异体的编码区 cDNA片段以构建 pCDI-CKLF1的引物为： P3 5 ATG, GAT, AAC, GTG, CAG, CCG, AAA, AT 3 和 P4 5 TTA, CAA, AAC, TTC, TTT, TTT, TTC, ATG, C3； 用于扩增不含终止密

12、码的 CKLF1及其变异体的 cDNA片段，以构建 pEGFP-N1-CKLF1,p EGFP-N1-CKLF2 和 pEGFP-N1-CKLF4的下游引物为： P5 5 CGG GATC CA AAA CTT CTT TTT TTT CAT GC 3CKLF1表达谱分析用巢式 PCR的方法对 CKLF1 及其变异体在各种不同组织中的表达水平进行分析，用Clontech 公司Multiple Tissue cDNAP anels 试剂盒提供的单链 cDNA文库作模板，利用 P1，P2 和 P3，P4 引物，进行 PCR 扩增。在第一轮 PCR反应中，取 1lcDNA文库作模板，反应体系为 25

13、l ，进行 25个循环；在第二轮 PCR 反应中，取 1l 第一轮 PCR产物作模板，反应体系为 25l ，进行 20 个循环。取 10l 第二轮 PCR产物，在 5%SDS-PAG胶E 中电泳。质粒构建为了对 CKLF1， CKLF2 和 CKLF4 的亚细胞定位进行研究，将去终止码的相应序列克隆到表达载体 pEGFP-N1中。用 P3和P5引物，从PHA刺激的 U937细胞 cDNA文库中，扩增 CKLF1，CKLF2和CKLF4的cDNA 序列，在 P5 引物中，终止码被去除，并引入 BamH1酶切位点。 PCR产物用 Klenow 酶处理为平端，然后用 BamH1酶切。 pEGFP-N

14、1载体先用 EcoRI 酶切，再用 Klenow 酶处理为平端，然后用 BamH1酶切。酶切处理后 的载体片段和 目的基因片 段 回收后，连接 得到重组 质粒 pEGFP-N1-CKLF1， pEGFP-N1-CKLF2和 pEGFP-N1-CKLF。4 用 P3和 P4引物从 PHA刺激的 U937 细胞 cDNA文库中，扩增 CKLF1的 ORF片段，克隆入 pGEM-T载体中，测序。用 EcoRI 将插入片段释放出来，连接至经 EcoRI 切后，并用 CIP 处理后的 pcDI 载 体中，经酶切鉴定可得到 CKLF-1 的正义表达载体 pcDI-CKLF1。pcDI 是将 pcDNA3的

15、 BglI-kpnI 片段与 pCI 的 BglI-KpnI 片段置换后得到的一个真核表达载体 （ 7）。转染和转染试剂在瞬时转染中， COS-7 细胞在 10%胎牛血清的 DMEM中培养。用 SuperFect 转染试剂，根据说明转染COS-7细胞。 48 小时后，收集转染上清，用于活性分析和Western blot 分析。细胞用 PBS 洗，甲醛固定30 分钟，再用 PBS洗，荧光显微镜观察。CKLF1-EGF，P CKLF2-EGFP， CKLF3-EGFP在 COS-7细胞上清中的 Western blot 分析将 pEGFP-N1， pEGFP-N1-CKLF1, pEG FP-N1

16、-CKLF2 和 pEGFP-N1-CKLF4四种质粒分别转染 COS-7细胞，48 小时后，各取 70l 细胞上清，进行 SDS-PAGE电泳，电转至尼龙膜上，与抗 EGFP多克隆抗体反应，再 与 HRP标记的二抗反应，用化学发光的方法进行检测。趋化实验按照以前报道的方法 （ 8），从健康成年志愿者外周血中分离嗜中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞。纯化 的嗜中性粒细胞重悬于 HBSS缓冲液中，细胞密度为 1X106/ml ；淋巴细胞和单核细胞重悬于含 0.5%低内毒 素 BSA和 20mM Hepes的 1640 培养液中，细胞密度分别为 5X106/ml 和 2X106/ml 。细胞趋化实验用

17、 48 孔趋 化小室，按照文献报道的进行 （9）。小孔的下面装满 COS-7 细胞的转染上清，上面是各种不同类型的细胞。 用于嗜中性细胞的聚炭膜孔径为 3m，趋化时间为 30 分钟；用于单核细胞和淋巴细胞的聚炭膜孔径为5m，趋化时间为 90 分钟。DNA注射和肌肉切片分析所有的实验动物均购自北京大学医学部实验动物部。将 100gpcDI-CKLF1 或 pcDI 分别溶于 100l 生理盐水中，取 6-8 周龄 BALB/c 小鼠，分别注射 pcDI-CKLF1 或 pcDI 于骨胳肌中，同时用 40ms， 80V 电刺激， 以提高质粒的摄取量 （ 10）。10 天后，处死小鼠，将注射质粒部位

18、的肌肉取出。标本分为两部分，一部分用于 常规组织学处理，分别进行 Feulgen ，ANAE，POX和 HE染色。 另外一部分用于提取 RNA，进行 RT-PCR分析。结果差异显示 cDNA片段的获得利用 SSH技术，我们从 PHA刺激的 U937 细胞中得到了能被 IL-10 所抑制表达的 cDNA序列。筛选了 15 个插入序列大于 200个碱基的克隆， 测序，并在 Genbank公共数据库中检索， 发现其中 6 个克隆包括 CKLF1 为新基因。 Northern blot 分析再次证明白细胞介素 10 能够抑制 CKLF1的表达， CKLF1约为 600 个碱基（见 图 1） 图 1.

19、CKLF 表达的 Northern blot 分析第2和第 4泳道的 RNA来自 PHA刺激的 U937细胞；第1和第 3泳道的 RNA来自 PHA刺激同时 IL-10 抑制的U937细胞。 CKLF1在 PHA刺激的 U937细胞中的表达可被 IL-10 部分抑制（第 1 和第 2泳道）。 CKLF1全长 DNA序列克隆及其编码蛋白质的特征通过 SSH技术从 PHA刺激的 U937 细胞中获得的 CKLF1片段含有多聚腺苷酸尾巴和相对少见的加尾信号 ATTAAA，人趋化因子 Eotaxin 和 TARC的加尾信号也是 ATTAAA（11，12 ）。这表明该片段包含完整的 3 非翻译区 （13

20、，14）。该片段有一个编码 99个氨基酸的完整开放读码框架， 96-98 位为翻译起始密码 ATG，其周边序列为 GCGATG，G符合 Kozak规律（15）。在 Genbank数据库中检索发现， CKLF1为一个新基因；但是 EST数据库检索 发现, 来自不同 cDNA文库的多条 EST序列与我们得到的序列部分相同或高度同源。通过EST延伸技术，在CKLF1原有 cDNA序列基础上，向 5 非翻译区延长了 52 个碱基。 Northern blot 显示 CKLF1与预期的大小 基本相符。 为证明 EST拼接是否正确， 我们设计了引物 P1 和 P2，从 PHA刺激的 U937细胞中成功得到

21、 CKLF1 的全长 cDNA序列， DNA序列分析表明我们的 EST拼接是正确的。 CKLF1的全长 cDNA序列及其编码的蛋白质序列如图 2A所示（ CKLF1在 GenBank中的登录号为 AF096895）TARC和 STCP-1的序列比较图 2. CKLF1 的核酸和相应的蛋白质序列及其与A）CKLF1的核酸和蛋白质序列。核酸序列为正义链，从5 到 3 方向。核酸序列下为相应的蛋白质序列， 终止码用星号表示。 （ B） CKLF1的蛋白质序列与 CC家族趋化因子 TARC和 STCP-1的比较。加深的为保守的 氨基酸。CKLF1编码的蛋白质含有 99 个氨基酸，分子量为 10.9KD

22、a，为高度碱性的疏水性蛋白质。 CKLF1 蛋白 没有 N糖基化位点， SignalP 分析发现没有典型的信号肽切割位点 （16 ，17），转基因分析和 Western blot 分析 发现， CKLF1可被分泌到细胞上清中。其他实验室的研究发现，一些没有前导序列的蛋白质能被分泌出来， 如乳腺来源的生长抑制因子，白细胞介素 1和巨噬细胞移动抑制因子 2等（18）。因此， CKLF1可能利用另外 一种分泌机制。 CKLF1在蛋白质水平上仅与线虫的 amino acid permease 蛋白有低水平的同源性，与其它 蛋白质没有明显的同源性。 CKLF1蛋白具有两个结构特性： （1）CKLF1仅有

23、三个半胱氨酸，最后两个连续排 列，具有 CC家族趋化因子的结构特征； （2）BLAST检索发现， CKLF1与其它 CC家族趋化因子之间没有明显同源性。但是，手工排列发现， CKLF1与两个位于 16号染色体上 CC家族趋化因子 TARC和 STCP-1在CC附 近有数个关键的氨基酸相同（图 2B 所示）。CKLF1三个变异体的克隆化通过 RT-PCR技术，我们从 PHA刺激的 U937 细胞中得到 CKLF1的全长 cDNA序列，同时，得到了其它三条片段，经克隆化和序列分析后，发现它们为CKLF1的三种变异体，分别命名为 CKLF2（AF135380），CKLF3（AF135381）和 CK

24、LF4（ AF145216）。在 PHA刺激的 U937 细胞中， CKLF1比 CKLF2， CKLF3和 CKLF4的表达 水平高，且该基因的表达可被 IL-10 所抑制，因此 Northern Blot 检测时只看到一条带，可能因为其它变 异体丰度较低， Northern Blot 敏感度不够而未能检测到。读码框架分析表明： CKLF-2 、CKLF-3和 CKLF-4 分别编码 152个氨基酸， 67个氨基酸和 120个氨基酸，它们与 CKLF1有相同的氨基端和羧基端， 中间 27-112 为氨基酸不同， 但都有 CC结构。用编码最多氨基酸的 CKLF2作参照， CKLF1， CKLF

25、3和 CKLF4分别缺失 27-79 ，27-111 ，80-111 位氨基酸（图 3 所示）。图 3. CKLF1 、 CKLF2、 CKLF3和 CKLF4的蛋白质序列图 4. 人 CKLF基因内含子和外显子交界处序列及 CKLF1，2，3，4 结构示意图（A）人 CKLF基因内含子和外显子交界处序列。外显子序列用大写字母表示；内含子序列用小写字母表示。（B）CKLF对外显子的选择性应用及 CKLF1，2， 3， 4 的结构示意图。 CKLF1与其变异体有相同的氨基端和羧基端。在 CKLF2蛋白质的基础上， CKLF1，CKLF3和 CKLF4选择性用 27-79 ，27-111 和 80

26、-111 位氨基酸。下划线序列指 CKLF2和 CKLF4可能的穿膜区序列CKLF基因定位和结构16通过检索 HTGS数据库，将 CKLF2全长 cDNA序列与人类基因组工作草图相比较，我们发现两个位于号染色体上的片段与其有高度同源性。 CKLF基因包括 4个外显子和 3 个内含子。内含子和外显子交界处的序列符合真核细胞剪接规律 （图 4A）（19）。CKLF基因与 cDNA序列比较发现， 外显子 1，2，3，4分别编码 1-26 ，27-79 ，80-111 ，112-152 位氨基酸（图 4B）。 CKLF1， 2，3， 4有共同的外显子 1和 4，选择性拥有外显子 2和 3。因此，它们为

27、同一基因的不同剪接形式。CKLF1 mRNA在不同组织中的表达CKLF1 mRNA在 PHA刺激的 U937 细胞中存在不同的变异体形式。我们用RT-PCR技术分析了 CKLF1及其变异体在成年及胚胎组织中的表达情况，结果发现：CKLF1 及其变异体在脾脏、肺、睾丸、卵巢、外周血白细胞、胎盘、胰腺、胎脑、胎儿骨胳肌和心脏中高表达；成年人骨胳肌、肝脏、胸腺、结肠、前列腺、 胎脾和胎肝中表达水平较低；而在成年人脑组织、肾脏、心脏、小肠、胎肺和胎肾中的表达几乎检测不到。 在绝大多数组织中， CKLF1和 CKLF2的表达水平相类似，均比 CKLF4的表达水平高，而 CKLF3的表达水平 最低（图 5

28、 所示）。图 5. 人 CKLF1及其变异体在各种组织中的分布（A）CKLF及其变异体在胚胎组织中的表达。 （B） CKLF及其变异体在成年组织中的表达。左边显示的分子 量标准。CKLF1，CKLF2和 CKLF4的亚细胞定位为了研究 CKLF1，2，4 的细胞定位，我们构建了 CKLF-EGFP融合表达载体， EGFP在 CKLFcDNA序列的COS-7细胞。荧光显微镜下观察荧下游，二者位于同一读码框架。将融合表达载体和空载体对照分别转染光的分布。表达对照 EGFP的细胞有分布均匀的亮绿色荧光，在细胞内没有特异性亚细胞定位（图6A）；而转染 CKLF1-EGFP的细胞，细胞内荧光很弱（图 6

29、B）。基于 CKLF1的结构特征，可以推测大部分 CKLF1-EGFP 蛋白可能被分泌到细胞培养上清中。相反，CKLF2-EGFP和 CKLF4-EGFP主要位于细胞边缘，在细胞的其它位置，仅有很少的荧光分布（图 6C 和 6D）。转染 HEK-293细胞，也得到相似的结果，这表明 CKLF1，CKLF2 和 CKLF4的亚细胞定位不仅局限于 COS-7细胞。图 6.EGFP、 CKLF1-EGFP、 CKLF2-EGFP和 CKLF4-EGFP融合蛋白的亚细胞定位EGFP位于 CKLF1，CKLF2 和 CKLF4的羧基端，它们在同一读码框架上，瞬时转染COS-7细胞，荧光显微镜观察。（ A

30、）转染 EGFP对照。（B）转染 CKLF1-EGFP。（C）转染 CKLF2-EGFP。（D）转染 CKLF4-EGFP。放大倍 数为 400 倍。CKLF1为分泌性表达从 CKLF1的亚细胞定位结果来看，我们推测CKLF1可能为分泌性表达。为证明这一点，收集COS-7 细胞转染上清，进行 SDS-PAGE电泳和 Western blot 分析。 Western blot 表明在 pcDI-CKLF1-EGFP 转染细胞 中，有一条约 38KD的特异表达带，分子量与 CKLF1-EGFP融合蛋白相吻合（图 7）。而在其它三组转染上清CKLF1的信号肽尚有待确定，但 CKLF1中，没有检测到特

31、异的表达带。因此，我们可以得出以下结论：虽然为分泌性蛋白，在细胞上清中检测不到CKLF2-EGFP和 CKLF4-EGFP的存在。而且，计算机分析发现， CKLF2和 CKLF4的 27-79 位氨基酸为高度疏水性氨基酸，可能是穿膜蛋白。将CKLF2序列递交到 GenBank 后，发现了其他两个实验室克隆的序列，与CKLF2有相同的读码框架，其中一个的登录号为AF057306，被认为是穿膜蛋白脂，这提示 CKLF2可能是穿膜蛋白。图 7. 应用抗 EGFP多克隆抗体，在 COS-7细胞上清中检测 CKLFs/EGFP。第一泳道：高分子量蛋白质标准；第二泳道：EGFP；第三泳道： CKLF1/E

32、GFP；第四泳道： CKLF2/EGFP；第五泳道： CKLF4/EGFP重组 CKLF1在体外的趋化活性为了研究 CKLF1的生物学活性，我们构建了 CKLF1真核表达质粒 pcDI-CKLF1，该质粒包括 CKLF1的完 整读码框架。我们将 pcDI-CKLF1 和空载体 pcDI 分别转染 COS-7 细胞，收集细胞上清，进行趋化活性分析。 重组 CKLF1的趋化活性分析用穿孔移动分析法， 趋化活性用趋化指数表示 （趋化指数是指 pcDI-CKLF1 转染 细胞上清组的细胞数与空载体 pcDI 转染细胞上清组的细胞数的比值） （ 20）。与 pcDI 转染细胞上清相比较， pcDI-CK

33、LF1 转染细胞上清对人中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞有明显的趋化活性（图 8 所示）。我们在 果蝇 S2 细胞系统中得到相似的实验结果，这说明CKLF1的趋化活性不仅局限于 COS-7细胞系统。CKLF1体内趋化活性我们将 pcDI-CKLF1 裸质粒注射到 BALB/c 小鼠肌肉中， 10 天后，取注射部位肌肉组织， RT-PCR分析发现 CKLF1 的表达水平较高；同时，肌肉纵切， Feulgen 染色，发现与空载体对照组相比，注射 pcDI-CKLF1裸质粒的小鼠肌肉切片中有更多的细胞浸润。这表明CKLF1能引起白细胞的聚集或能刺激干细胞的增殖或二者兼而有之。为进一步验证 CKLF1的

34、体内趋化活性，我们又对部分肌肉切片进行POX或 ANAE染色，然后用 HE复染（21 ）。如图 9D和图 9F所示，许多细胞呈 POX或 ANAE强阳性，而在图 9C和图 9E中，没有发现相 应的阳性细胞。众所周知， POX阳性细胞主要是嗜中性粒细胞，而ANAE阳性细胞主要为单核细胞和 T 淋巴细胞（22）。在细胞染色的基础上，结合形态学观察，CKLF1 在体内能够趋化嗜中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞，这与 CKLF1的体外趋化活性一致。图 8.CKLF1 对白细胞的趋化作用 将人外周血淋巴细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞置于趋化小室中，下面孔中加入不同稀释度的 COS-7 细胞 转染上清。在高倍

35、镜下，随机选 5 个视野，计数穿膜细胞的数量。 CI ：趋化指数。图 9. 小鼠肌肉内注射 pcDI-CKLF1 引起的白细胞浸润A、 C、E为注射 pcDI 组小鼠； B、 D、F为注射 pcDI-CKLF1 组小鼠。注射质粒 10天后，取肌肉组织，作组 织切片。 D和 F 中可见白细胞浸润。CKLF1在体内引起骨胳肌的形态学改变将肌肉组织固定后，分别作纵切片和横切片，HE染色。在表达 CKLF1的肌肉组织中，除了观察到多细胞浸润现象外，还发现了肌肉组织的形态学改变，如图 10 所示。在横切面中， CKLF1组有细胞核居中现象 （图 10B），而对照组没有这种现象（图 10A）；在纵切面中，

36、 CKLF1组细胞核成串珠状排列（图 10D）。这种 现象说明肌卫星细胞被活化，肌肉处于再生状态（ 23）。目前，尚需进一步的实验来证明这是CKLF1的直接作用还是由被趋化细胞产生的细胞因子导致的结果。图 10.CKLF1 对 BALB/c 小鼠骨胳肌的作用裸质粒注射后 10 天，取肌肉组织，作纵切片和横切片， HE染色， 200 倍放大后镜检。表达 CKLF1的肌组织 切片中（ B， D），可明显观察到肌纤维再生，即核居中现象。而在对照组肌肉切片中，无细胞核居中现象。讨论我们通过一种新的技术路线，成功地克隆了新细胞因子 CKLF1 及其三种变异体。应用这条技术路线，把其它的细胞因子产生细胞和

37、细胞因子合成抑制抑制因子结合起来，可发现更多新的细胞因子。CKLF1-EGFP、CKLF2-EGFP和 CKLF3-EGFP转染 COS-7细胞和 HEK-293 细胞的结果表明， CKLF1是分泌性 蛋白质，而 CKLF2和 CKLF4为穿膜蛋白。根据计算机分析结果，我们推测CKLF1的另外一个变异体 CKLF3可能与 CKLF1 相同，为分泌性表达，目前这部分工作正在研究之中。令人感兴趣的是，CKLF1的不同变异体可为分泌性表达，也可为跨膜蛋白。有人报道，新的CC家族趋化因子 Eskine ，由于选择性应用 5 外显子，而造成两种不同的变异体，其中之一为分泌性表达，另一种定位于细胞核（24

38、 ）。对 CKLF1的不同变异体而言，不同的表达形式可能是由于对 27-79 这段高疏水性氨基酸的选择性应用有关。从CKLF1的结构上来看，CKLF1有三个半胱氨酸，最后两个连续排列，呈CC家族趋化因子的特征性结构，第一个半胱氨酸可能位于信号肽内。 CKLF1与其它趋化因子的不同之处在于它的羧基端没有其它的半胱氨酸。CKLF1基因定位于16 号染色体， 与 CC家族趋化因子 TARC和 STCP-1 有低水平的同源性 （25）。在目前发现的所有 CC家族趋化因 子中，只有 TARC和 STCP-1定位于 16 号染色体上，其它绝大多数 CC家族趋化因子位于 17 染色体上。 FRN 是目前发现

39、的唯一一种 CX3C趋化因子，也是唯一一种膜结合型趋化因子，同样定位与16 号染色体 （ 25）。重组的 CKLF1在体内外均具有广谱的趋化活性，我们认为 CKLF1 可能代表一个新的家族的趋化因子，它与 TARC、STCP-1 和 FRN在进化上可能有一定的保守性。在小鼠肌肉中表达重组的 CKLF1，可刺激肌肉细胞的增殖和分化，这与 IGF-1 对成年小鼠趾长伸肌的 作用一致( 27)。我们推测 CKLF1可能通过以下几种机制来调控骨胳肌细胞的再生： 第一，与IGF-1 相同，CKLF1 本身能够调控肌卫星细胞的增殖和分裂；第二， CKLF1 趋化的白细胞能够产生多种细胞因子，这些细胞因 子

40、能够影响肌细胞的生长；第三， CKLF1与其它细胞因子具有协同作用，刺激肌细胞的再生和肌管的形成。 目前，尚需进一步的实验来证明我们的推测。总之，我们成功地克隆了一个新的细胞因子及其三种变异体。CKLF1的表达水平可被 IL-10 所部分抑制。功能实验证明， CKLF1具有广谱的趋化活性，并能刺激骨胳肌细胞的增殖和分化。致谢：感谢怀特博士对 CKLF1命名所提的建议；感谢李凌松博士协助论文修改；感谢黄大无和钟英诚 在照片处理过程中所提供的帮助； 感谢范中玉对论文的输入所做的工作。 这项研究工作是由国家 863 和 973 基金支持。参考文献1. Nicola, N. A., Walter an

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