液相色谱进阶讲座之梯度洗脱

1、主题：液相色谱进阶讲座之梯度洗脱简介：通过实例详细介绍梯度洗脱”的意义、应用领域、操作方法以及优化，相信能够使广大网友的液相色谱技术有一些崭新的提高欢迎参及交流和讨论梯度洗脱gradient elution 1简介通常情况下，液相色谱操作中的流动相组成和比例是恒左的，这种洗脫 化合物的方式被称为等度洗脱；但是为了改善分析结果，某些操作需要连续改变流动相中各溶剂组分的比例以 连续改变流动相的极性，使每个分析组分都有合适的容疑因子k,并使样品种的所有组分可在最短时间内实现 最佳分离，这种洗脱方式称为梯度洗脱。2梯度洗脱的应用梯度洗脱可在下列情形中发挥重要作用：A在等度 下具有较宽k值的多种样品分析

2、。B大分子样品分析。C样品含有强保留的干扰物，在目标化合物出峰后设置 梯度洗脱，将干扰物洗脱出来，以免英影响下一次分析。D单组份化合物方法建立时，不知道其洗脱情况，使用梯度洗脱，找出英较优的洗脱条件。（1）多组分分析时，这些组分往往具有很宽的值范闱。假如使用等度洗脱，这些化合物的&值无法同时落在110之间，结果就是，无法同时得到较好的分离度、较短的分离时间、较高的响应值。图Tl、T2、T3是笔者不同条件下分析邻苯二甲酸酯类化合物得到的色谱图。图TL（等度，流动相：80%乙脂水溶液）12101 120401 1 160r80T 1100i1120Time (min)1L1LJ一|IIIiIiII

3、I（等度,流动相：100%乙睛）图T212I 110Time (min)T1 1 f 123图T3 (梯度，0-5 min,乙惰由70%上升到90%, 5-10 min乙睛由90%上升到100%, 10-18min,乙M 100%)英他色谱条件：色谱柱：Diamonsil C182), 250*4.6 mm, 5 pm 流速：1.0 ml/min 检测器：UV254 nm 1邻苯二甲酸二甲酯(DMP)2邻苯二甲酸二乙酯(DEP)3邻苯二甲酸二正丙酯(DPrP)4邻苯二甲酸丁基节基酯(BBP)5邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)6邻苯二甲酸二戊酯(DPP)7邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)8邻苯二甲酸二

4、己酯(DHP)9邻苯二甲酸(2-乙基己基)(DEHP)三种洗脱方式对比条件最小分离度分析时间灵敏度等度KT1)4100 min,灵敏度逐渐降低，8 检出等度2(T2)=0.811 min-9,灵敏度逐渐降低，梯度(T3)325 min-9,灵敏度相差不大，由该分析案例可知，在多组分分析时，只要能够选出合适的梯度条件，就能够实现“较好的分离度、较短的分 离时间、较髙的响应值”。(2)样品溶液中同时含有目标化合物和强保留化合物，目标化合物流出后使用梯度洗脱将强保留化合物洗 下来，以避免强保留化合物污染色谱柱或在后续的分析中流出干扰分析。T4某分析项目末端梯度洗脱以洗掉过剩的衍生试剂(末端梯度：39

5、-40 min,有机相含量由38%升高到80%, 保持10min)由T4可以看出，40min左右，最晚岀邮的组分已经被洗下来，然而却把有机相在1 min内由38%升高到80%, 目的就是为了洗脱衍生反应剩余的衍生试剂（50 min处的色谱峰）。前而的杂质稣为样品基质中的强保留干扰物, 末端的梯度洗脱同样也将其洗了下来，这就避免了这些化合物在随后的分析中缓慢流岀造成的基线起伏。（3） 当遇到新的化合物需要分析，我们没有文献可以参考，只能初步圈左分析模式（反相、正相等等），此时确定不 了等度洗脱的流动相组成和比例，只好借助梯度洗脱。3梯度洗脱的原理（以反相色谱为例）梯度洗脱的实质就是，样品随梯度起

6、点的流动相进入色谱柱入口， 由于起点流动相中强洗脱溶剂B含量较低，化合物C1（保留性适中）和化合物C2（保留较强）因k值较高而滞留于 色谱柱入口附近（几乎未移动）。一段时间后，B增加到一左数值，C1的k值达到足够小（比如小于10）,英在柱 中的移动速率明显增大，并且随着B的增加，英移动速率愈加快速，直到J时流岀色谱柱，被检测器检测到并 被记录成色谱峰C1,匕虽然比等度时的保留时间长很多，但C1的的平均k值却很小，因而色谱峰并未展宽， 灵敏度仍处于较髙水平。B持续增加，任随后的某个时间点，C2的k值也降到10以下，C2的移动速率也开始变快，以及C1类似的方 式于心被洗脱岀色谱柱，英平均值同样很小

7、，色谱峰亦未展宽，灵敏度处于较高水平。T5梯度洗脱过程中 的峰迁移10010g642黑色虚线代表B比例的变化（对应左侧上方纵轴）红色曲线代表化合物k值随流动相改变而发生的变化（对应右侧纵轴） 绿色曲线代表化合物化合物在柱中的位程变化（对应左侧下方纵轴） 紫色曲线为色谱图4梯度分离的建立梯度洗脱可以按下列步骤建立;A选择初始条件：色谱柱（类型和规格）、流动相组成、 流速、柱温等等B根据A的分析结果升髙起始流动相中的B%并降低结朿流动相中的B%,以去除色谱图中第一 个稣出现前的和最后一个邮出现后的无意义时间C当稣分离较差或运行时间过长的时候，应通过调整强洗脱溶 剂B、B升高速率或使用分段梯度等方式

8、予以解决D考察不同仪器对梯度分离的影响。（1）选择梯度条件流动相：选择一种强洗脱溶剂和一种弱洗脱溶剂，反相中常用强洗脱溶剂为乙備和甲醇，弱洗脱溶剂为水，（由 于反相中分离的化合物许多具有解离性，所以水相往往有酸、缓冲盐等，这些不在本讲座讨论范圉以内，本讲 座提到的水相可能包括纯水、缓冲盐水溶液等，具体事例会明确写岀）。正相中常用的强洗脫溶剂为甲基叔丁基 陋、异丙醇等，弱洗脱溶剂为正己烷。流速：对于4.6 mm内径的色谱柱一般把流速设左为1.01.5 ml/min,苴他内径的色谱柱可以以此标准进行换算: 柱温：如有柱温箱，设左柱温3545 C为宜：初始变化速率：可以按下而的公式计算确左%B20F

9、fGv菽F为流速，单位为ml/min： Vm为色谱柱死体积，单位为ml： k*为 期望的平均保留因子；为强洗脱溶剂的变动值；心为梯度时间，单位为min。该公式适用于相对分子量处 于50-500之间的化合物。对于150*4.6 mm的色谱柱，约为1.2 ml：流速通常设定为1.0 ml/min： k*为5是 比较好的选择：因此%Bg应为3.3,也就是B的改变速率设定为3.3%是适宜的，当梯度范用为5%-100%, 梯度时间可以设为29 min。梯度范围：为避免峰遗漏，初始梯度范国最好设置为强洗脱溶剂变动范用为5%-100%,在反相中可以把乙腊的 变动范围设置在5%-100%,如果是能够耐受纯水的

10、色谱柱，也可以设左在0%-100%.梯度形状：在初始梯度实验中，梯度可设巻成线性（不分段），在后续的调整中则可以设置分段梯度，每一段梯 度的B变动斜率存在差别。（2）调整强洗脱溶剂B、梯度变化速率或使用分段梯度等方式以优化梯度条件流动相对选择性起着至关重 要的作用，流动相组成或比例的改变均会显著改变分离度，在梯度中亦然。反相模式梯度的初试中，强洗脱溶 剂往往选择乙腊，但乙腊只是在某些项目中具有较好的选择性，而另一些项目甲醇或许更合适。乙腊、甲醇洗 脱能力相近，但二者的选择性则具有互补性。T6、T7 T8是PITC柱前衍生反相液相色谱分析18种氨基酸的色谱图。T6以乙腊作为强洗脱溶剂，丙氨酸和

11、脯氨酸（7和8）分离度不足1.5： T7以甲醇作为强洗脱溶剂，9后而的组分分离很差。上述表明，甲醇对前而一 组峰的分离较好，儿乙膳则更适合后而一组峰，因此笔者把甲醇乙尉混合液作为强洗脱溶剂，T8证明这种混合 溶剂的确能够将18种天然氨基酸、内标物正亮氨酸以及NHs的的分离度达到2.0以上。rrt/为80%乙200-100-LJUuL I寸-L1JL-YLU w W 15.0W-015.02(J.O25.0一 7l30.0 mn0T7750500250-LL水甲溶80% I * I *30.036.0r严q6Lw4j A_1 I ； I I I i I *:15.020.025.000i I I

12、 I I I I5.010.0mnT8B=20:60:2020Time (min)其他色谱条件 色谱柱：Diamonsil AAA氨基酸分析柱，250*4.6 mm, 5 pm：流动相B：见谱图上方的描述流动相A： 0.05 mol/L乙酸钠水溶液（pH=6.5）流速：1.0 ml/min检测器：UV 254 nm柱温：35摄氏度 具体化合物：1 Asp（天冬氨酸）:2Glu（谷氨酸）；3 Ser（丝氨酸）；4Gly（甘氨酸）;5 His（组氨酸）;6 Arg（精氨酸）；7Thr（苏氨酸）：8 Ala（丙氨酸）：9 Pro（脯氨酸）：10 NH3: HTyr（酪氨酸）；12 Vai（缠氨酸）；

13、13 Met（蛋氨酸）:14 Cys（胱氨酸）；15 lle（异 亮氨酸）:16 Leu（亮氨酸）；17Nle（正亮氨酸）:18 Phe（苯丙氨酸）;19 Trp（色氨酸）;20 Lys（赖氨酸）化合物列表及T8上的峰号严格对应。梯度变化速率梯度变化速率及平均保留因子八是成反比关系的，梯度变化速率降低，疋值增加，并会产 生如下结果：其一，各组分间的分离度R提高；其二，色谱峰的区域宽度增加，灵敏度下降；苴三，分析时间 延长。第一点是积极的，第二、第三点是消极的。所以应在分离度能满足要求的前提下，控制梯度变化速率不 要过低。下而是梯度变化速率的影响：测试项目为15种农药，唯一变量为梯度变化速率。T

14、9甲醇变化速率20%/min,中=4a1020时间（aiin）Til =15时间ruin)英他色谱条件色谱柱：C18,25O*4.6 mm, 5 pm流动相：甲醇，水流速：1.7 ml/min柱温：室温由T9、T10、T11可知，随着强洗脱溶剂变化速率降低，各组分的分离度逐渐增大，分析时间也逐渐延长。 如果改变溶剂、调整梯度变化速率仍不能较好分离则需要改成非线性梯度。下而是偶氮释放的24种芳香 胺分析：T12偶氮释放的24种芳香胺分析的梯度设置B为甲醇，A为0.005 mol/L磷酸二氢鞍+0.005mol/L磷酸氢二钠水溶液90右/minT14色谱图0204060Time (min)结合梯度

15、和色谱图可知，1-6是由第一段梯度（蓝色虚线）洗脱下来，B升髙速率为0.5%； 7-16由第二段梯度（粉 色虚线）洗脱下来，B升髙速率为0.27%,色谱峰宽度较大：17-24由第三段梯度（绿色虚线）洗脱下来，B升高 速率为1.85%,因而峰形最为尖锐。（3）不同仪器对梯度分析结果的影响以及消除影响的办法及等度分析不同，梯度分析时，色谱柱入口的流动相状态并不能及梯度曲线上的流动相状态在时间上准确对应。 比如，0 min流动相比例已经开始变化了，这种变化首先由泵或比例阀做岀动作，而此刻柱入口处的流动相组 成仍是初始流动相，变化的流动相穿过泵或比例阀到柱头之间的空间后才能传达到柱入口，所以色谱柱入口

16、的 流动相状态始终滞后于时间程序上的流动相状态。滞后时间tD=VD/F, VD是泵或比例阀到柱头之间的体枳，F 为体积流速。不论是高压梯度还是低压梯度，滞后体积通常处于28mL之间，滞后体积的不同会导致下列现象：其一，在不同款式仪器上使用相同梯度，保留时间会发生变化：英二，在一种款式的仪器上开发的梯度洗脱方法换到另一款仪器上，可能会出现分离度下降、峰位置变化等现 象可用用下而的办法消除上述不利影响：在A仪器上（VD=V1）开发梯度方法，在开发的梯度程序前预先加入5 min等度洗脱（比例及初始流动相比例相 同），并确左这5 min的等度为影响分离，这就可以作为最终的梯度条件；等换到B仪器上（VD=V2）,若V2=V1,梯度程序不需改变：若V2大于V1,那么应把前而的等度时间调小，减小值应为(V 2-V1)/F；若V2小于V1, 那么应把前而的等度时间调大，增加值应为(V1-V2)/Fo说到这