无内毒素质粒大提取试剂盒中文操作指南(1)

1、自无内毒素质粒大提取试剂盒中文操作指南(omega)详细内容： Fastfiler Endo-free Plasmid Maxiprep Protocol无内毒素 质粒大抽提)1. 在1-4升的培养瓶中加入200-500ml LB培养基，然后加入菌种于 37C摇床培养12-16小时；Tip:为获得最好的结果，请接种1ml培养过夜的菌种(12-16hr)。并强 烈推荐使用E.coli(endA )品系用于常规的质粒提取，如DH5a和JM109。 注意：菌液的培养时间不能超过16小时；2. 收集200ml培养基至适当的离心管，室温下，3,500-5,000xg离心10 分钟沉淀；3. 吸尽并去除培

2、养基，用干净的吸水纸吸尽壁上多余的液体。加12.0ml Solution I/RNase A到细菌培养物中，涡旋和枪头抽打细菌以重悬细胞；注：充分重悬细菌沉淀物对获得高产量的质粒是相当关键的。充分重悬 后溶液是均匀的，不存在小块物质；请尽量吸弃残余的培养基以防止稀 释加入的溶液；4. 加入12.0ml Solutionll,轻轻颠倒旋转混匀7-10次至获得澄清的裂 解液；室温放置3-5分钟可以有是必须的。避免剧烈振荡混匀而打断染 色体DNA,降低质粒的纯度。(Solution II使用后请盖紧盖子且于室温 保存)；5. 将取出Lysate Clearance Filter Syrine活塞，将

3、其放置于架子上；6. 加入12 ml Neutralization Buffer,轻轻颠倒混匀几次至岀现絮状沉 淀。这可能需要放置2-3分钟并间断颠倒混匀；7. 立即将裂解液转移到lysate Clearance Filter Syrine中，垂直放置5 分钟。这时口色的絮状沉淀物会漂上溶液的上层，裂解液可能开始流出 过滤器，用新的50ml管子收集细菌裂解液，并将活塞轻轻插入过滤器 中；8. 握住过滤器，轻轻推动活塞将裂解液打到收集管中；注意不要将任 何杂质打到收集管中；9. 加入01体积的ETR Solution （蓝色）到收集液中，轻轻颠倒旋转 混匀710次，冰浴放置20分钟；注意：加入E

4、RT Solution后，洛液应 变得浑浊，但冰浴静置后溶液应是澄清的。10. 379孵育5分钟，溶液重新变为浑浊。室温下，3,000xg离心5分 钟，ERT Solution （蓝色）分层于离心管底部。H. 把上面的水相（上清液）转移到新的50ml离心管中，加入1/3体 积的GBT Buffer,轻轻颠倒旋转混匀12次。注意：转移上清液时不 要吸到任何ETR溶液，因为其含有高浓度的内毒素；12. 平衡DNA柱子：用HiBind DNA Maxi Column套在收集管中，加入 10ml Buffer GPS 至 HiBind DNA Maxi 柱子中，室温下 3000xg 离心 2 分 钟；

5、去除滤过液并重复使用收集管；13. 加入23ml澄清的裂解液至DNA柱子中，3,000xg离心2分钟。去 除滤过液并重新收集管；14. 将剩余的裂解液加到柱子上，按上述条件离心，去除滤过液并重新 使用收集管；15. 加入10ml Buffer HB至柱子中，3000xg离心2分钟，去除滤过液并 重新使用收集管；16. 加入15ml DNA Wash buffer（已用乙醇稀释）至柱子中，3000xg离心 2分钟，去除滤过液并重新使用收集管；17. 加入10ml DNA Wash buffer至柱子中，3000xg离心5分钟，去除 滤过液和收集管；18. 将柱子套在新的50ml离心管中，加入1

6、-3ml DNA Elution Buffer或 水至柱子的基质。室温下,3000xg离心洗脱DNAo Fastfilter Endo-free Plasmid Maxiprep Protocol（Vacuum Protocol）I. 按111步骤准备澄清的裂解液；2. 平衡柱子：将HiBind DNA Maxi Column同真空装置相连接，加入 10ml Buffer GPS至柱子中，提供真空1分钟至裂解液完全滤过膜；3. 将澄清的裂解液至HiBind DNA Maxi柱子中，提供真空让所有的溶 液滤出柱子；加入10ml HB Buffer至柱子，提供真空吸尽液体；4. 加入15ml DNA Wash buffer （已经用无水乙醇稀释）至柱子中，提 供真空让溶液滤出柱子；5. 重用15ml DNA Wash buffer至柱子中，提供真空让溶液