益生菌连续传代1000代过程

1、摘 要：以益生菌 Lactobacillus 基中连续传代 1 000 代期间细胞定性进行了初步评价。结果表明，益生菌在常规培养条件下连续传代1000 代过程中稳定性研究casei Zhang 为研究对象，通过观察该菌株在普通MRS培养形态 、菌落形态 、活菌数、浊度和菌株活力的变化对其稳L.casei Zhang 在 1000 代期间细胞形态与菌落形态没有发 生变化；活菌数、浊度均和菌株活力随培养代数的增加呈现波动性变化，但波动幅度较小， 总数基本维持不变。 上述研究结果初步表明 L. caseiZhang 具有良好的稳定性， 暗示其可用 于产业化生产。关键词：益生菌； Lactobacil

2、lus casei Zhang ；连续传代；稳定性Study on the stability of the probiotic Lactobacillus casei Zhang during continuous subculturing in normal condition for 1000 generationsAbstract: In this study, we selected probiotic Lactobacillus casei Zhang as the research object, and its stability was assessed by monitor

3、ing thechange of cell morphology, colony morphology, viable counts, growth (OD600) and activity during the 1 000 generations. The results showedthat bacterial cell and colony morphology of L. casei Zhang had no change, and the viable counts, growth and bacterial activity of L. caseiZhang fluctuated

4、mildly. In a word, L. casei Zhang was stable during long-term contiuous subculturing, which can be further applied in industry.Key words: Probiotic; L. casei Zhang; Continuous Subculturing; Stability116Vol.41 ， No.11 2013(total 276)Research Papers研究报告0引言益生菌是指通过摄入适当量从而对宿主产生有 益作用的活性微生物， 对人体主要具有免疫调节、调

5、整肠道菌群、防止腹泻、降低粪便中某些酶活性及抗突变抗癌的医疗保健作用1-4。 通常益生菌都要经过严格的筛选，还要经过动物实验和人体临床实验的综合 评价5-6。 此外，它们还应具备优良的遗传稳定性能7从微生物应用的角度来看，这也是菌株实现产业化生 产的必备条件。益生菌 Lactobacillus casei Zhang 来源于草原蒙古族 几前年流传下来的原生态发酵乳饮料酸马奶8。 经过 多年系统的基础研究，我们自主解决了其产业化的关 键技术问题。本文通过观察该菌株在普通MRS培养基中连续传代 1 000 代期间细胞形态、活菌数、浊度和菌 株活力的变化对其稳定性进行了评价，以期为后续试 验提供参考

6、。1 实验1.1 材料1.1.1 菌株来源 益生菌 L. casei Zhang 原始菌株（ 0 代）是由内蒙古 农业大学提供， LABCC编号 IMAU10048。1.1.2 试剂与仪器 试剂：法国梅里埃合成无糖 MRS培养基，纽西兰 超特级脱脂乳粉，葡萄糖、盐酸、氢氧化钠、氯化钠、琼 脂粉等常用试剂均为国产分析纯试剂。仪器： NSC-A-1200 无菌工作台， 恒温培养箱（LRH -500F ）， 台 式 高 速 冷 冻 离 心 机 （Eppendorf ， 5810R型 ）， pH计 （SJ-3F 型 ）， 超纯水系统 （MUL- 9000），HITACHI U-2000 型紫外可见分光

7、光度计 ， HIRAYAMA HA-300M全自动高压灭菌器等。1.2 实验菌株的连续传代培养及培养代数计算 将 0 代益生菌 L. casei Zhang 按体积分数为 1%接种 量进行长期连续传代培养至 1 000 代。 在每个传代周 期（24 h ）内，菌体菌数约增长 100倍，生长代数约为 6.64 代9。1.3 细胞形态学观察 在菌株 L. casei Zhang 连续传代过程中，培养至 1 000 代时对菌株进行革兰氏染色、油镜观察、照相， 观察培养周期末菌株细胞形态。1.4生长周期末活菌数变化 在菌株传代过程中， 每培养 200 代测定各个菌株 在培养周期末（ 24 h ）的活菌

8、数。 样品经倍比稀释到合 适梯度后，采用 MRS固体培养基平皿倾注法， 37 厌 氧培养 72 h 后计菌落总数， 选取菌落数在 30300 之间 的平板作为活菌总数测定的指标。1.5生长周期末浊度变化 在菌株传代过程中，每培养 培养周期末的培养液浊度。 基适当稀释，采用比浊法于200 代测定连续 3 天的 传代培养液用未接菌培养600 nm 处测定其浊度。1.6菌株活力的测定在菌株传代过程中， 每培养 200 代测定各个菌株 的菌体产酸活力。各菌株以 110 mL -1接种于 10 mL 灭菌脱脂乳中， 37 C 恒温培养 24 h， 取出后立即放入冰 浴，每样加 30 mL 蒸馏水稀释后，

9、以酚酞作指示剂，以 浓度为 0.1 mol/L 的 NaOH滴定至微红色 30 s 不退色为 止， 记录消耗 NaOH的体积以计算出样品中的乳酸浓 度，再换算为活力单位。1.7数据处理采用 DPS软件对数据进行方差分析， 各项指标均 做 3 个平行。2结果与分析2.1细胞形态学观察 形态学观察是微生物研究最基本的方法。L. caseiZhang 0 代和 1 000 代显微镜照相照片如图 1 所示。 由图 1 可以看出， L. casei Zhang 原始菌株细胞典型形态为呈 对或呈链杆状排列。 在 MRS培养基中连续传代以后， 1000 代菌株细胞形态没有发生大的变化，与原始菌株 形态基本保

10、持一致。 这也许可以说明在常规培养条件 下连续传代培养对细胞形态影响微乎其微。2.3 生长周期末活菌数 长期传代过程中接种量维持恒定不变，因此生长 周期末活菌数也可以认为是衡量菌株稳定性的窗口。L. casei Zhang 在连续培养 1000 代期间， 不同代数菌株 在培养周期末的活菌数变化情况如表1 所示。 由表 1 可以看出，在普通 MRS培养基中其活菌数在传代过程中 变化差异显著（ P0.05 ），但没有随培养代数的增加呈 规律性的单调递增或单调递减趋势。事实上， 3 个平行菌落间在最初开始培养时活菌数就有差异（P0.05 ），但这些差异并没有随培养代数的增加而发生变化。 菌 落 1

11、和菌落 2 在 200 代和 400 代期间也曾出现活菌数相同 的情况。 总体来看，在连续培养传代过程中 3 个独立菌 落的活菌数与菌株培养代数间并无明显线性关系，基 本稳定在一个固定区间内。2.4 生长周期末浊度 在连续培养 1 000 代过程中， L. casei Zhang 各菌株 在培养周期末的 OD600 值变化情况如表 2 所示。由表 2 可 以看出， L. casei Zhang 在连续传代过程中 OD 600 值变化 差异显著（ P0.05 ）。 与生长周期末活菌数统计分析结 果类似， OD600 值总体维持在一定范围内并且和培养代 数间没有明显的线性关系。表1 在连续培养 0

12、 1000 代期间活菌数 （ 对数值 ） 变化 mL -1 培养代数 0代 200 代400 代600 代800 代1000 代L. casei Zhang-1 +8.84 0.11y,c9.21 0.03y,a9.23 0.05y,a9.05 0.03y,b9.08 0.05y,b9.27 0.03y,aL. casei Zhang-2 +9.18 0.09x,b9.21 0.01y,b9.37 0.05x,a9.06 0.09y,c9.19 0.01x,b9.13 0.06z,bcL. casei Zhang-3 +9.05 0.04x,c9.43 0.10x,a9.34 0.06x,ab

13、9.28 0.03x,b9.15 0.05x,c9.37 0.04x,ab注：上角 +为在普通 MRS培养基中培养。 不同字母的上角数据之间差 异显著（ P0.05 ），其中字母 abcde 代表列数据分析， xyz 代表行数据 分析，下同。图1 益生菌 L. casei Zhang 传代期间细胞形态对比L. casei Zhang-1+0 L. casei Zhang-2+0L. casei Zhang-3+0 L. casei Zhang-1+1000L. casei Zhang-2+1000 L. casei Zhang-3+1000 172013 年第 41 卷第 11 期（总第 27

14、6 期）2.5 菌种活力评价 在连续传代培养 1 000 代过程中， 菌株的产酸活 力测定结果如表 3 所示。 由表 3可以看出， L. casei Zhang 在传代培养过程中产酸活力可以很好的维持在一定 范围内，侧面反映该菌株经过多次传代后仍然可以保 持筛选之初的基本特性。3 讨论 本文对益生菌 L. casei Zhang 传代 1 000 代期间的 表型特征稳定性进行了研究，结果初步表明该菌株在 普通 MRS培养基中连续传代 1 000 代期间细胞形态、 活菌数、浊度和菌株活力的变化均不显著，暗示其在 产业化流通过程中具有良好的稳定性。类似地， 周朝晖等利用 RAPD标记技术和高效液

15、相色谱指纹图谱对昂立植物乳杆菌连续传代 15 代以 后的稳定性进行了检测10。 与此相反，刘衍芬等利用 RAPD标记技术和聚丙烯酰胺凝胶电泳（ Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS- PAGE） 技术对直投式发酵剂中分离出的乳酸菌传代 次数和保存方法进行了探讨11-12 ，结果表明乳杆菌在 传代过程中连续转管次数不同时基因组和蛋白质均 有变化。 刘晓辉等于 2008 年研究了乳酸菌 Q26 菌株传 代过程中转管不同次数时的形态变化和蛋白差异， 结果发现受试菌株在第 40 代时蛋白表达开始发生变 化13。 这

16、些研究为揭示益生乳酸菌传代过程中变异产 生的分子机理奠定了基础，也用数据证明遗传稳定性 在产业化生产过程中不容忽视的地位。 与此同时，这 些研究结果也说明关于益生菌稳定性的研究有待于 进一步深入。参考文献1 SUDARSHAN R, SREE VIJAYABALA G, RAJKS D. Probiotics the Promising Future-A review J. Journal of Case Report and Review,2013, 2(1): 98-105.2 TUO Y, ZHANG Q, CHU F, et al. Immunological Evaluation o

17、fLactobacillus casei Zhang: a Newly Isolated Strain from Koumiss in InnerMongolia, ChinaJ. BMC Immunol, 2008, 9: 68.3 KOLADER M E, VINH H, NGOC TUYET P T, et al. An Oral Preparation of Lactobacillus acidophilus for the Treatment of Uncomplicated acute Watery Diarrhoea in Vietnamese Children: Study P

18、rotocol for a Multicentre, Randomised, Placebo-Controlled TrialJ. Trials,2013, 14: 27.4 VERMA A, SHUKLA G. Probiotics Lactobacillus rhamnosus GG, Lactobacillus acidophilus Suppresses DMH-induced Procarcinogenic Fecal Enzymes and Preneoplastic Aberrant Crypt Foci in Early Colon Carcinogenesis in Spra

19、gue Dawley RatsJ. Nutr Cancer, 2013, 65(1): 84-91.5 WAITZBERG D, OGULLO L C, BITTENCOURT AF, et al. Effect of Synbiotic in Constipated Adult Women - a Randomized, Doubleblind, Placebo -controlled Study of Clinical Response J. Clin Nutr,2013, 32(1): 27-33.6 WANG Y, LI Y, XIE J, et al. Protective Effe

20、cts of Probiotic Lactobacillus casei Zhang Against Endotoxin - and D -galactosamine -In- duced Liver Injury in Rats Via Anti-oxidative and Anti-inflammatory CapacitiesJ. Int Immunopharmacol, 2013, 15(1): 30-37.7 TUOMOLA E, CRITTENDEN R, PLAYNE M, et al. Quality Assurance Criteria for Probiotic Bacte

21、ria J. Am J Clin Nutr, 2001, 73(2Suppl): 393S-398S.8 WU R, WANG L, WANG J, et al. Isolation and Preliminary ProbioticSelection of Lactobacilli from Koumiss in Inner Mongolia J. J Basic Microbiol, 2009, 49(3): 318-26.9 LENSKI R E, ROSE MR, SIMPSON SC, et al. Long-term Experimental Evolution in Escher

22、ichia coli. I. Adaptation and Divergence During 2,000 Generations J. The American Naturalist, 1991, 138(6): 1315-1341.10 周朝晖 , 范小兵 , 杭晓敏 , 等. 昂立植物乳杆菌发酵及其稳定性能的 研究 J. 微生态制剂 , 2004, 16(6):356-357.11 刘衍芬 , 高学军 , 张明辉 , 等. DVS 乳酸菌种菌株传代过程中遗传 稳定性分析 J. 生物技术 , 2005, 15(2):48-50.12 刘衍芬 , 高学军 , 张明辉 , 等. DVS 乳酸菌种菌株保存过程中遗传 稳定性分析 J. 中国乳品工业 , 2005, 33(1):7-10.13 刘晓辉 , 冀宝营 , 高晓梅 , 等 . 直投式酸奶发酵剂乳酸菌菌种遗传 稳定性的研究 J. 中国酿造业