实验五蚕豆根尖微核检测技术

1、二、实验原理二、实验原理 微核简称(MCN)，是真核生物细胞中的一种异常结 构，往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生。 在细胞间期微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之 外、大小应在主核1/3以下。微核的折光率及细胞化 学反应性质和主核一样。 一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的断片微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的断片 产生的，产生的，但有些实验也证明整条的染色体或多条染色 体也能形成微核。这些断片或染色体在细胞分裂末期 被两个子细胞核所排斥便形成了第三个核块。 已经证实微核率的大小是和用药的剂量或辐射累积 效应呈正相关，这一点和染色体畸变的情况一样。所 以可用简易的间期微核计数来代替繁杂的中

2、期畸变染 色体计数。 由于大量新的化合物的合成，原子能应用，各种各 样工业废物的排出，使人们需要有一套高度灵敏、技 术简单的测试系统来监视环境的变化。 只有真核的测试系统更能直接推测诱变物质对人类 或其它高等生物的遗传危害，在这方面，微核测试是 一种比较理想的方法。 且有研究显示以植物进行微核测试与以动物进行的 一致率可达99%以上。 目前，微核测试已经广泛应用于辐射损伤、辐射防 护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症 前期诊断等各方面。 利用蚕豆根尖作为实验材料进行微核测试，可准确 显示各种处理诱发畸变的效果，并可用于污染程度的 监测。 三、实验材料三、实验材料 蚕豆种子 四、实验器

3、具、药品试剂四、实验器具、药品试剂 实验器具：实验器具： 显微镜，计数器，镊子，载玻片，盖玻片，烧杯， 瓷盘等。 实验药品：实验药品： 6mol/L盐酸，甲醇，冰乙酸，醋酸洋红， 氟化钠处理液：0.5mmol/L 3种浓度。 五、实验方法五、实验方法 1实验材料的培育实验材料的培育 蚕豆根尖细胞的染色体大，DNA含量高，因而对 诱变因子反应敏感。种子成熟后，晒干贮藏于干燥器 内或4冰箱内备用。 2浸种催芽浸种催芽： 将实验用蚕豆种子按需要量放入盛有蒸馏水的烧杯 中，在25下浸泡24小时。种子吸胀后，用纱布松散 包裹置白磁盘中，保持湿度，在25恒温箱中催芽12- 24小时，待初生根长出2-3mm

4、时，再取发芽良好的种 子，放入铺满滤纸的磁盘中，25继续催芽，经约36- 48小时，大部分初生根长至1-2cm左右，根毛发育良 好，这时即可用来进行检测了。 3处理处理 每一处理选取6-8粒初生根生长良好、根长一致的 种子，放入盛有待测物溶液的培养皿中，浸没根尖。 用自来水作对照处理，处理根尖624h(处理时间可 视实验需要和被测液浓度而定)。 4根尖细胞恢复培养根尖细胞恢复培养 将处理后的种子用蒸馏水浸洗三次，每次2-3min。 将洗净的种子再放入铺好滤纸或脱脂棉的白磁盘内， 25温箱中恢复培养22-24小时。 5固定根尖细胞及制片固定根尖细胞及制片(参考根尖压片法参考根尖压片法) (1)将

5、恢复培养后的种子，从根尖顶端，切下1cm长的 幼根。用卡诺氏液固定24h，固定后如果不及时制片， 可换入70% 的乙醇中，置4冰箱内保存备用。 6酸解：酸解： 从70乙醇中取出固定好的根尖流水冲洗 min吸水纸吸干放入盛有适量1 mol/L HCl， 600.5水浴保温的瓶中解离10min。 7染色染色 ： 解离后材料水洗3min并吸干，挑取1个根尖的乳 白色分生组织于载玻片上夹碎捣烂，滴加12滴染液， 染色1015min，压片。 8压片压片 在经染色的材料上加一滴染液，盖上盖玻片，覆 一层吸水纸，用带橡皮头的铅笔垂直敲打，或以拇指 垂直紧压盖片(注意勿使盖片搓动)，使材料分散压平， 便于观察

6、。 9镜检及微核识别标准镜检及微核识别标准 首先在低倍镜下找到分生组织区细胞分散均匀，分 裂相较多的部位，再转高倍镜观察。 微核识别标准微核识别标准： （1）在主核大小的1/3以下，并与主核分离的小核。 （2）小核着色与主核相当或稍浅。 （3）小核形态为圆形、椭圆形或不规则型。 观察3个根尖，每个根尖计数100个细胞中的微核数 并进行记录。 六、注意事项：六、注意事项： 1. 各种诱发微核的处理试剂具有一定毒性，请注意使 用安全，并防止污染环境。 2.凡数值在上下限时，定为上一级污染。 3.对严重污染的水环境进行检测时，检测处理会造成 根尖死亡，应稀释后再作测试； 4.在没有空调恒温设备时，如室温超过30，MCN 本底可能有升高现象，但可经污染指数法数据处理， 不会影响检测结果。 蚕豆根尖微核检测记录表蚕豆根尖微核检测记录表 试验号 镜检日期 镜检者 片号 第一片第二片第三片 各自观察的细胞 数或微核数 细胞数微核数细胞数微核数细胞数微核数 总计 平均微核千分率 目前，微核