逆萎康对胃癌前病变细胞的灭杀效果探讨(word版)

1、 精编范文 逆萎康对胃癌前病变细胞的灭杀效果探讨温馨提示：本文是笔者精心整理编制而成，有很强的的实用性和参考性，下载完成后可以直接编辑，并根据自己的需求进行修改套用。逆萎康对胃癌前病变细胞的灭杀效果探讨 本文关键词：胃癌, 病变, 细胞, 探讨, 效果逆萎康对胃癌前病变细胞的灭杀效果探讨 本文简介：摘要：目的研究逆萎康对胃癌前病变细胞(MC细胞)凋亡的影响及其可能的作用机制。方法用不同浓度的逆萎康汤剂分别作用于MC细胞,采用流式细胞仪分别检测细胞的凋亡情况;采用实时荧光定量PCR(RTqPCR)技术检测细胞中c-myc基因、细胞周期素D1(cyclinD1)基因的表达;采用免疫印迹法(Wes逆

2、萎康对胃癌前病变细胞的灭杀效果探讨 本文内容：摘 要：目的 研究逆萎康对胃癌前病变细胞 (MC细胞) 凋亡的影响及其可能的作用机制。方法 用不同浓度的逆萎康汤剂分别作用于MC细胞, 采用流式细胞仪分别检测细胞的凋亡情况;采用实时荧光定量PCR (RTqPCR) 技术检测细胞中c-myc基因、细胞周期素D1 (cyclin D1) 基因的表达;采用免疫印迹法 (Western Blot) 检测细胞中B淋巴细胞瘤-2 (Bcl-2) 、Bcl-2相关X蛋白 (Bax) 、半胱氨酸蛋白酶-3 (Caspase-3) 、β-连环蛋白 (β-catenin) 、10号染色体上缺失的磷

3、酸酶和紧张素同系物 (PTEN) 、糖原合成酶激酶3β (GSK-3β) 和磷酸化糖原合成酶激酶3β (pGSK-3β) 蛋白的表达量。结果 随着逆萎康汤剂浓度的增加, 其促MC细胞凋亡的作用逐渐增强 (F=24.864, P0.05) 。结论 逆萎康能有效地促使MC细胞凋亡, 其机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活有关。关键词：逆萎康; 胃肿瘤; 癌前状态; 细胞凋亡; Wnt信号通路;Abstract：Objective To study the effect of Niweikang on the apoptosis o

4、f precancerous lesions of gastric cancer (MC cells) and its possible mechanism of action. Methods MC cells were treated with different concentrations of Niweikang, and a flow cytometer was used to determine cell apoptosis;quantitative real-time PCR was used to determine the mRNA expression of c-myc

5、and cyclin D1 in the cells;Western Blot was used to determine the protein expression of B-cell lymphoma-2 (Bcl-2) , Bcl-2-associated X protein (Bax) , Caspase-3, β-catenin, phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10 (PTEN) , glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β) , and phos

6、phorylated glycogen synthase kinase-3β (p-GSK-3β) . Results Niweikang showed a gradually enhanced apoptosis-promoting effect on MC cells as its concentration increased (F=24.864, P0.05) . Conclusion Niweikang can effectively promote MC cell apoptosis, which may be related to its inhibition

7、 of activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway.Keyword：Niweikang; Stomach neoplasms; Precancerous conditions; Apoptosis; Wnt signaling pathway;现阶段, 胃癌以其极高的发病率和死亡率成为癌症相关死亡的主要原因之一。据统计, 东亚地区人群中胃癌的发病率和死亡率均排在世界前列, 而我国在其中占据非常大的比例1,2,3,4,5。多数胃癌病人在肿瘤出现明显转移时才被发现和确诊, 5年生存率极低6。慢性萎缩性胃炎 (CAG) 伴肠上皮化生和

8、不典型增生是胃癌的癌前病变7。现代医学尚未发现有特异性药物或者治疗手段可以抑制甚至逆转CAG向胃癌的演变, 如今临床上常用的治疗方案仅可以延缓病症的发展, 减轻病人的痛苦, 对于胃部器质性和功能性损伤的修复和逆转作用甚微。近年来, 传统中医药在治疗胃癌癌前病变 (PLGC) 方面取得了重大进展。逆萎康是由青岛大学附属医院研制, 该方应用于临床多年, 对于CAG伴肠化生、不典型增生等癌前病变的治疗及胃癌术后的辅助治疗有良好的效果8,9。为减轻原逆萎康致呕这一副反应的发生, 早期对该组方进行了一系列优化。关于优化后的逆萎康组方发挥作用的具体机制尚不明确。本研究旨在探讨优化后逆萎康对胃癌前病变细胞

9、(MC细胞) 增殖、凋亡及对Wnt/β-catenin通路相关分子的影响, 以期能为PLGC的临床治疗寻找新的靶点。现将结果报告如下。1 、材料与方法1.1、 材料来源MC细胞由青岛大学附属医院中心实验室馈赠;胎牛血清 (FBS) 、RIP细胞裂解液、PVDF膜和ECL化学发光试剂购自美国Millipore公司;RP-MI1640培养基及双抗 (青霉素和硫酸链霉素) 购自美国Hyclone公司;凋亡检测试剂盒购自日本DoJindo公司;c-myc、细胞周期素D1 (cyclin D1) 引物由华大基因合成;兔抗人B淋巴细胞瘤-2 (Bcl-2) 、Bcl-2相关X蛋白 (Bax) 、

10、10号染色体上缺失的磷酸酶和紧张素同系物 (PTEN) 、半胱氨酸蛋白酶-3 (Caspase-3) 、β-连环蛋白 (β-catenin) 、糖原合成酶激酶3β (GSK-3β) 和磷酸化糖原合成酶激酶3β (pGSK-3β) 购买自美国Cell Signaling公司;兔抗人GAPDH购自武汉Elabscience公司;辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购自美国CST公司。1.2 、细胞培养与逆萎康方剂的优化将对数生长期MC细胞置于含体积分数0.10胎牛血清的RPMI 1640培养基中, 在37、含体积分数0.05CO2的细胞培养箱中

11、进行无菌培养, 每23d传代1次, 镜下观察细胞贴壁达85%以上时, 以2.5g/L胰蛋白酶消化传代。逆萎康方剂的优化:优化后的逆萎康方剂包括雪胆15g、黄!10g、老龙皮10g、半枝莲15g、海漂蛸10g、朱砂七3g、生姜6g、陈皮6g。将上述药材浸泡半小时后, 提取2次, 每次提取1h, 料液比为12倍, 水煎以后冷却, 经旋转蒸发后浓缩至含生药300g/L, 经0.22μm微孔滤膜过滤, 分装至离心管中, 置于-20冰箱保存, 用前以RPMI 1640培养液配制成所需浓度。1.3 、流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况分别用0、100、200、300g/L的逆萎康孵育处理MC细胞48h后

12、, 用预冷的PBS洗涤2次, 分别加入AnnexinV-FITC和PI solution各5μL, 轻轻混匀, 室温避光孵育15 min后, 加入1Annexin V Binding Solution 400μL, 采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。1.4 、实时荧光定量PCR (RT-qPCR) 技术检测c-myc、cyclin D1基因的表达RT-qPCR的反应体系含ddH2O 7.0μL, SybrGreen qPCR Master Mix (2) 10.0μL, 10μmol/L上游引物与10μmol/L下游引物各1.0μL, cDNA1.0&m

13、u;L, 总体积为20μL。扩增条件:95预变性10min;然后9530s, 6030s, 7230s, 进行40个循环。采用2-CT法计算各组mRNA的表达水平。见表1。表1 逆转录PCR引物序列1.5、 免疫印迹法 (Western Blot) 检测相关信号通路蛋白的表达不同浓度的逆萎康处理MC细胞48h以后, 用RIPA裂解液裂解细胞后离心, 取上清液。在SDS-PAGE凝胶加样孔中分别加入30μg蛋白样品, 以80V30min、110V1h电泳分离蛋白, 并转移至PVDF膜上, 以体积分数0.05脱脂奶粉室温封闭1h, 然后分别将条带加入Bcl-2、Bax、Caspase-

14、3、β-catenin、PTEN、GSK-3β、p-GSK-3β一抗液中, 4孵育过夜, TBST洗膜3次, 每次持续5 min, 二抗37孵育1h, TBST洗膜3次, 每次持续5 min, ECL显影。采用Image J软件分析目的蛋白条带和GAPDH灰度比值, 计算各种蛋白的相对表达量。2、 结果2.1、 逆萎康对MC细胞凋亡的影响0、100、200、300g/L组细胞总凋亡率分别为 (4.32±0.70) %、 (6.12±0.00) %、 (8.02±1.04) %、 (15.82±2.52) %,

15、 组间比较差异具有显着性 (F=24.864, P0.05) 。2.2、 逆萎康对MC细胞c-myc、cyclin D1基因表达的影响0、100、200、300g/L组c-myc基因表达量分别为1.000±0.000、0.951±0.021、0.834±0.023、0.679±0.049, 组间比较差异具有显着性 (F=113.404, P0.05) 。2.3、 逆萎康对MC细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、β-catenin、PTEN、GSK-3β以及p-GSK-3β蛋白表达的影响0、100、20

16、0、300g/L组Caspase-3、β-catenin、Bcl-2、p-GSK-3β蛋白表达量比较差异有显着意义 (F=14.78363.224, P0.05) 。各组间GSK-3β蛋白的表达量比较, 差异均无显着性 (P0.05) 。见图13, 表2、3。3、 讨论当前胃癌的治疗主要以手术及化疗、放疗、分子靶向治疗为主10,11,12, 但化疗药物由于存在易产生耐药性、毒性较大且疗效有限等缺点, 应用范围受到极大限制。多年来传统中医在对CAG向胃癌的病程进展治疗方面, 积累了丰富的经验。中药组方逆萎康具有健脾和胃、清热导滞、益气止痛之功效。该组方可以显着地降低

17、CAG的发病概率, 有效地抑制CAG向胃癌的转变。目前对于胃癌的发病机制仍在持续探索当中, 至今依旧未有定论。值得肯定的是, 胃癌的发生和转归是受外界环境和机体自身因素影响的。机体中若干因子、基因以及信号通路都参与调节13。在人类各种癌症中, 尤其是晚期和转移性癌症中Wnt/β-catenin信号通路的调节一直处于激活的状态14,15。Wnt/β-catenin途径具有多个作用位点, 受多种信号途径调节, 该通路中任何组分的改变都可能导致信号转导异常, 从而导致肿瘤的发生16。Wnt/β-catenin及其上游相关信号的异常调节可致β-catenin在细

18、胞中累积和易位, 并在进入细胞核后激活T细胞因子/淋巴增强因子转录活性, 导致下游基因的异常表达17。因此本研究探讨了逆萎康对β-catenin的影响, 并且进一步分析了逆萎康对cyclin D118,19,20以及c-myc21,22,23基因表达的影响, 研究结果显示, 逆萎康处理MC细胞48h后, cyclin D1、c-myc蛋白水平明显降低, 提示逆萎康具有抑制Wnt/β-catenin通路的作用。图1 逆萎康对MC细胞Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表达的影响(1) 、 (2) 、 (3) 、 (4) 分别为0、100、200、300g/L组。图2 逆

19、萎康对MC细胞PTEN和β-catenin蛋白表达的影响(1) 、 (2) 、 (3) 、 (4) 分别为0、100、200、300g/L组。图3 逆萎康对MC细胞p-GSK-3β和GSK-3β蛋白表达的影响(1) 、 (2) 、 (3) 、 (4) 分别为0、100、200、300g/L组。表2 逆萎康对MC细胞Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表达的影响表3 逆萎康对MC细胞PTEN、β-catenin、p-GSK-3β和GSK-3β蛋白表达的影响Bcl-2基因家族是凋亡过程中重要的组成部分。其中Bcl-2能够有效地抑制细

20、胞凋亡, 其在多种肿瘤的发生进展中表达上调24,25。Bax能够诱导细胞进入凋亡程序, 与Bcl-2对凋亡的抑制作用恰好相反。在细胞凋亡信号通路中, Caspase-3位于通路的下游, 是凋亡过程的重要因子, 能够诱导细胞的凋亡26,27。逆萎康能够使MC细胞中促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表达上调, 抑制细胞凋亡蛋白Bcl-2的表达下调, 从而证实了逆萎康诱导MC细胞凋亡的作用。GSK-3β在细胞内糖代谢、细胞增殖分化和凋亡等生理过程中起调控作用。GSK-3β异常表达和功能障碍可能导致一系列无法克服的疾病, 包括肿瘤、糖尿病和阿尔茨海默病等28。故本研究探讨了逆萎

21、康对p-GSK-3β和GSK-3β表达的影响, 实验结果表明逆萎康对MC细胞中GSK-3β的表达无显着影响, 但其能够显着下调p-GSK-3β的表达水平。逆萎康可以通过抑制MC细胞中β-catenin的表达, 抑制GSK-3β磷酸化, 进而加速β-catenin的降解, 使β-catenin在MC细胞内的蓄积减少, 从而最终阻断Wnt/β-catenin信号通路的激活, 使得MC细胞的增殖和活化得到抑制。PTEN是一重要的肿瘤抑制因子, 在大多数人类肿瘤中经常发生突变29。PTEN在细胞中控制着多种生物学

22、过程, 包括维持基因组稳定性、细胞存活、迁移、增殖和代谢30。PTEN高甲基化可以导致PTEN蛋白的低表达, 进而引发胃肠道上皮的非典型增生, 在胃癌的发生和发展中PTEN的低表达起着重要作用10。本实验进一步对PTEN的表达检测显示, 逆萎康可诱导PTEN蛋白表达上调, 从而起到抗肿瘤的作用。综上所述, 逆萎康抑制胃癌发生的机制可能通过增加PTEN的表达进而抑制Wnt/β-catenin通路的激活来实现, 最终抑制MC细胞的增殖, 促进其凋亡。相信通过后续更加深入的体内研究后, 能更进一步深入了解逆萎康治疗PLGC作用及其机制。参考文献1SITARZ R, SKIERUCHA M,

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