蛋白质组学研究方法课件

1、蛋白质组学研究方法课件 蛋白质组学的研究进展 蛋白质组学研究方法课件 提提 纲纲 蛋白质组学的产生蛋白质组学的产生 蛋白质组学研究意义蛋白质组学研究意义 蛋白质组学研究的内容和方法蛋白质组学研究的内容和方法 蛋白质组学的发展趋势蛋白质组学的发展趋势 我国蛋白质组学研究的现状我国蛋白质组学研究的现状 蛋白质组学研究方法课件 1995 流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌 1830 Kb 1997 酵母酵母 12.7 Mb 1998 线虫线虫 9700 Kb 2002 水稻水稻 430 Mb 果蝇果蝇 蛋白质组学研究方法课件 从基因到蛋白质 蛋白质组学研究方法课件 蛋白质组学的产生蛋白质组学的产生 荧光染色的

2、细胞内蛋白质荧光染色的细胞内蛋白质 蛋白质组学研究方法课件 人类基因组计划完成之后，生物学人类基因组计划完成之后，生物学 被重新划分为前基因组和后基因组被重新划分为前基因组和后基因组 两部分。两部分。 * 基因组和蛋白质组到基因组和蛋白质组到 底有什么联系底有什么联系？ 蛋白质组学研究方法课件 蛋白质组研究的意义蛋白质组研究的意义 蛋白质组的研究能为众多种疾病机理的阐明及蛋白质组的研究能为众多种疾病机理的阐明及 攻克提供理论根据和解决途径。通过对正常个体及攻克提供理论根据和解决途径。通过对正常个体及 病理个体间的蛋白质组比较分析，我们可以找到某病理个体间的蛋白质组比较分析，我们可以找到某 些些

3、“疾病特异性的蛋白质分子疾病特异性的蛋白质分子”，它们可成为新药，它们可成为新药 物设计的分子靶点，或者也会为疾病的早期诊断提物设计的分子靶点，或者也会为疾病的早期诊断提 供分子标志。供分子标志。 蛋白质组学研究方法课件 动物模型/细胞 蛋白质组研究蛋白质组研究 生物信息学分析 功能分析 人类疾病 蛋白质组新技术 蛋白质组研究的策略：平台与整合 蛋白质组学研究方法课件 蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质组研究的基本技术路线 蛋白质样品的制备蛋白质样品的制备 双向电泳双向电泳图像分析图像分析 转印至膜上的蛋白转印至膜上的蛋白凝胶中的蛋白凝胶中的蛋白溶液中的蛋白溶液中的蛋白 混合肽混合肽 蛋白质质量

4、蛋白质质量N端测序端测序肽序列质谱数据肽序列质谱数据肽指纹图肽指纹图 数据搜索数据搜索 新的或已知蛋白新的或已知蛋白 蛋白转录后修饰的鉴定蛋白转录后修饰的鉴定 蛋白质组学研究方法课件 Proteolytic digestion Proteolytic fragmentsPure protein2D electrophoresisSample MALDI-TOF Capillary Electrophoresis HPLC N- Amino acid sequencing Mass spectrum LC/MS/MS G C G Database searching 蛋白质组学研究方法课件 蛋白

5、质组研究的支柱：蛋白质组研究的支柱： 双向电泳技术双向电泳技术 生物质谱生物质谱 生物信息学生物信息学 蛋白质组学研究方法课件 双向电泳技术双向电泳技术 1.双向电泳技术发展史双向电泳技术发展史（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE） OFarrell 1975年创建高分辨率的双向凝胶电泳，对大肠杆年创建高分辨率的双向凝胶电泳，对大肠杆 菌细胞抽提物双向电泳，分离到菌细胞抽提物双向电泳，分离到1100个蛋白组分。但载体两个蛋白组分。但载体两 性电解质使得性电解质使得pH不稳定且重复性差。不稳定且重复性差。 1982年年Bjellqvist 等引入固

6、相等引入固相pH梯度梯度IPG（Immobilized pH gradients)。解决了双向电泳重复性差、阴极漂移、可比性差解决了双向电泳重复性差、阴极漂移、可比性差 上样量低等一系列问题。上样量低等一系列问题。 1994年，年，Rabilloud 等用胶内水化的方法进行双向电泳，等用胶内水化的方法进行双向电泳， 进一步增加了样品上样量。进一步增加了样品上样量。 1998年，年，Islam等等 IPGphor等电聚焦等电聚焦系统的引入大大简化系统的引入大大简化 了了IPGIEF，聚焦水化同时进行。聚焦水化同时进行。 蛋白质组学研究方法课件 双向凝胶电泳（双向凝胶电泳（2 2DEDE）原理）原

7、理: : 先根据蛋白质的等电点不同在先根据蛋白质的等电点不同在pH梯度介质梯度介质 中进行第一次分离，即等电聚焦（中进行第一次分离，即等电聚焦（isoelectric focusing, IEF），然后根据蛋白质分子量的不同），然后根据蛋白质分子量的不同 进行第二次分离，即进行第二次分离，即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 完整的实验步骤包括：完整的实验步骤包括： 样品分离、等电聚焦、平衡、第二向分离、样品分离、等电聚焦、平衡、第二向分离、 染色、成像、软件分析、蛋白质鉴定染色、成像、软件分析、蛋白质鉴定 蛋白质组学研究方法课件 1.样品制备样品制备 样品的制备是实验成败的关键，需

8、样品的制备是实验成败的关键，需 根据不同的研究目的来决定具体的根据不同的研究目的来决定具体的 实验方法。实验方法。 蛋白样品的有效溶解是成功分离蛋蛋白样品的有效溶解是成功分离蛋 白质的最关键的因素之一。可以根白质的最关键的因素之一。可以根 据样品性质的不同，选用具有单一据样品性质的不同，选用具有单一 的增溶作用的溶液，还可用含多种的增溶作用的溶液，还可用含多种 变性剂、去垢剂、还原剂的复杂混变性剂、去垢剂、还原剂的复杂混 合溶液，以使样品中非共价结合的合溶液，以使样品中非共价结合的 蛋白质复合物和聚集体完全破坏。蛋白质复合物和聚集体完全破坏。 蛋白质组学研究方法课件 可溶性样品可溶性样品 固体

9、组织样品固体组织样品 细胞细胞 不同样品的基本处理方法不同样品的基本处理方法 样品的分级处理样品的分级处理 通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法 对蛋白质样品进行分级处理，可降低样品的复杂性并对蛋白质样品进行分级处理，可降低样品的复杂性并 富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分 级抽提，按样品溶解度不同进行分离。级抽提，按样品溶解度不同进行分离。 蛋白质组学研究方法课件 2.第一向：等电聚焦凝胶电泳第一向：等电聚焦凝胶电泳 （isoelectric focusing gel elect

10、rophoresis, IEF） 等电聚焦是将蛋白质样品加载到等电聚焦是将蛋白质样品加载到pHpH梯度介质梯度介质 上进行电泳，在电场的作用下蛋白质会向与其所上进行电泳，在电场的作用下蛋白质会向与其所 带的电荷相反的方向泳动，直到迁移到其等电点带的电荷相反的方向泳动，直到迁移到其等电点 位置时，其净电荷为零，在电场中不再移动。这位置时，其净电荷为零，在电场中不再移动。这 样根据各自不同的等电点，蛋白质最终被聚焦到样根据各自不同的等电点，蛋白质最终被聚焦到 一个很窄的一个很窄的pHpH介质区域内而实现分离。介质区域内而实现分离。 蛋白质组学研究方法课件 + pH 3pH 7.5pH 10 + p

11、H 3pH 7.5pH 10 + pH 3pH 7.5pH 10 + pH 3pH 7.5pH 10 蛋白质组学研究方法课件 PROTEAN IEF Cell等电聚焦电泳仪等电聚焦电泳仪 是是Bio-Rad公司公司1999年推出的一维高电压等电聚焦电泳，年推出的一维高电压等电聚焦电泳， 这款电泳的设计主要体现了蛋白质组工作系统对一维电这款电泳的设计主要体现了蛋白质组工作系统对一维电 泳高容量，高分辨率，重现性好等的要求。泳高容量，高分辨率，重现性好等的要求。 电压范围：电压范围：2510,000 V 电流范围：电流范围：2.4mA 温控范围：温控范围：10-25，内置，内置Peltier 半导

12、体制冷，精确控温。半导体制冷，精确控温。 胶条容量：容纳胶条容量：容纳24个个7cm胶条，胶条，12个个11、17、18、 24cm胶条胶条 聚聚 焦焦 槽：槽：7、11、17、18、24cm 蛋白质组学研究方法课件 蛋白质组学研究方法课件 蛋白质组学研究方法课件 IPG 胶条胶条 IPG胶条使用的介质是一些具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍胶条使用的介质是一些具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍 生物，并可制成任意的生物，并可制成任意的pH梯度。可根据不同的分离目的来选择梯度。可根据不同的分离目的来选择 不同的不同的pH梯度范围。梯度范围。 线性宽线性宽pH梯度胶条（梯度胶条（pH3-10）尽管可以在

13、同一块凝胶上显示）尽管可以在同一块凝胶上显示 样品中绝大多数的蛋白质，但多数蛋白质都集中在胶条的中部，样品中绝大多数的蛋白质，但多数蛋白质都集中在胶条的中部， 使得中间的分辨率较低。使得中间的分辨率较低。 非线性宽非线性宽pH范围胶条（范围胶条（pH3-10）是将）是将pH4-8之间的距离相对拉之间的距离相对拉 大，两端大，两端pH范围的距离相对缩短，因此可以较好的分离大部分范围的距离相对缩短，因此可以较好的分离大部分 PI 为为4-8的蛋白质。的蛋白质。 窄范围重叠窄范围重叠pH梯度胶条（梯度胶条（pH3-6, 5-8, 7-10）可以大大提高分）可以大大提高分 辨率和灵敏率。辨率和灵敏率。

14、 微范围微范围pH梯度胶条（梯度胶条（pH3.9-5.1，4.7-5.9，5.5-6.7，6.3-8.3） 能进一步提高凝胶的分辨率，尤其适合于低丰度蛋白的检测。能进一步提高凝胶的分辨率，尤其适合于低丰度蛋白的检测。 蛋白质组学研究方法课件 3.平衡平衡 从第一向电泳转移到第二向电泳的过程包括两步：从第一向电泳转移到第二向电泳的过程包括两步： 一是将已等电聚焦的一是将已等电聚焦的IPG胶条在含有胶条在含有SDS的缓冲液中平衡；的缓冲液中平衡； 二是胶条包埋在第二向凝胶的顶部。二是胶条包埋在第二向凝胶的顶部。 平衡的作用是保证蛋白质完全被平衡的作用是保证蛋白质完全被SDS包裹，半胱氨包裹，半胱氨

15、 酸被还原且被烷基化。平衡分为两步：平衡液酸被还原且被烷基化。平衡分为两步：平衡液1（尿素（尿素6M， SDS 2%, Tris/HCL 0.05M，甘油，甘油20%，DTT2%）作用是）作用是 还原蛋白的巯基，平衡液还原蛋白的巯基，平衡液2（尿素（尿素6M，SDS 2%, Tris/HCL 0.05M，甘油，甘油20%，碘乙酰胺，碘乙酰胺2.5%）作用是蛋）作用是蛋 白巯基烷基化。白巯基烷基化。 蛋白质组学研究方法课件 4.第二向：第二向：SDS-PAGE 双向电泳第二向是将在双向电泳第二向是将在IPG胶条中经过第一向等电聚焦分胶条中经过第一向等电聚焦分 离的蛋白质转移到第二向离的蛋白质转移

16、到第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，根据蛋聚丙烯酰胺凝胶上，根据蛋 白质的分子量的不同与第一向垂直进行分离。白质的分子量的不同与第一向垂直进行分离。 在二向中在二向中SDS-聚丙烯凝胶电泳中凝胶的组成可以是均一胶聚丙烯凝胶电泳中凝胶的组成可以是均一胶 （单一浓度的丙烯酰胺），也可以使用梯度胶（丙烯酰胺（单一浓度的丙烯酰胺），也可以使用梯度胶（丙烯酰胺 的浓度自上而下逐渐增高）。两者各有优缺点。其中均一的浓度自上而下逐渐增高）。两者各有优缺点。其中均一 胶可以很好的分离分子量范围较窄的蛋白质样品。梯度胶胶可以很好的分离分子量范围较窄的蛋白质样品。梯度胶 可以同时分析分子量范围很宽的蛋白质；同时随着

17、凝胶浓可以同时分析分子量范围很宽的蛋白质；同时随着凝胶浓 度梯度的升高凝胶孔径的缩小，分离的蛋白质点更为清晰。度梯度的升高凝胶孔径的缩小，分离的蛋白质点更为清晰。 蛋白质组学研究方法课件 + pH 3pH 7.5pH 10 蛋白质组学研究方法课件 蛋白质组学研究方法课件 蛋白质组学研究方法课件 5.染色染色 有机染料、银染、有机染料、银染、负染、胶体扩散染料、荧光染料、金属负染、胶体扩散染料、荧光染料、金属 螯合染料螯合染料 双向电泳中蛋白质的检测通常是用普通染料或金属染双向电泳中蛋白质的检测通常是用普通染料或金属染 料来检测凝胶中的蛋白质。染色的灵敏度与许多因素相关，料来检测凝胶中的蛋白质。

18、染色的灵敏度与许多因素相关， 包括与蛋白质结合的染料数量；染色的强度；凝胶上的蛋包括与蛋白质结合的染料数量；染色的强度；凝胶上的蛋 白质与凝胶背景之间的染色差异等许多方面。其中考马斯白质与凝胶背景之间的染色差异等许多方面。其中考马斯 亮蓝染色是检测蛋白质最常用的方法，亮蓝染色是检测蛋白质最常用的方法，Coomassie Brilliant Blue R-250 检测的灵敏度为检测的灵敏度为40ng。银染方法也。银染方法也 有许多种，尽管在化学作用上有一些差异，但却具有相似有许多种，尽管在化学作用上有一些差异，但却具有相似 的灵敏度，可以达到的灵敏度，可以达到1ng。 蛋白质组学研究方法课件 凝

19、胶的图像处理分析凝胶的图像处理分析 典型流程典型流程 凝胶图像的扫描凝胶图像的扫描 图像加工图像加工 斑点检测和定量斑点检测和定量 凝胶配比凝胶配比 数据分析数据分析 数据呈递和解释数据呈递和解释 2-DE数据库的建立数据库的建立 蛋白质组学研究方法课件 蛋白质组学研究方法课件 Bio-Rad公司推出的公司推出的PDQuest分析软件分析软件 含含5种功能：成像系统控制功能种功能：成像系统控制功能 + 二维凝胶分析功能二维凝胶分析功能 + 数数 据库管理功能据库管理功能 + Spot Cutter切胶系统控制功能切胶系统控制功能 + 质谱质谱 数据反馈功能。数据反馈功能。 蛋白质组学研究方法课

20、件 蛋白胶切取系统蛋白胶切取系统 蛋白切胶系统是一套自动切胶系统，通过蛋白切胶系统是一套自动切胶系统，通过CCD成像，并成像，并 调用分析软件获得的分析结果，自动准确的从凝胶切获调用分析软件获得的分析结果，自动准确的从凝胶切获 取蛋白点，并将之存放在取蛋白点，并将之存放在96孔板中，以便进行下一步研孔板中，以便进行下一步研 究工作究工作 蛋白质组学研究方法课件 生物质谱（生物质谱（mass spectrometrymass spectrometry）技术）技术 原理：在样品离子化后，根据离子质荷比的不同进行分离原理：在样品离子化后，根据离子质荷比的不同进行分离 并确定分子量，具有灵敏度高准确度

21、高易于实现自动化等并确定分子量，具有灵敏度高准确度高易于实现自动化等 优点。优点。 在在80年代早期出现了两种新的离子化技术，使质谱从仅能年代早期出现了两种新的离子化技术，使质谱从仅能 分析小分子挥发物到可以研究生物大分子分析小分子挥发物到可以研究生物大分子 *基质辅助激光解析离子化（基质辅助激光解析离子化（MALDI） *电喷雾离子化（电喷雾离子化（ESI） 这些技术能非常快速和准确的测定大分子物质，结合这些技术能非常快速和准确的测定大分子物质，结合 各种质谱技术后，可以在各种水平上研究蛋白质，为蛋白各种质谱技术后，可以在各种水平上研究蛋白质，为蛋白 质的研究开辟新道路。质的研究开辟新道路。

22、 蛋白质组学研究方法课件 质谱技术进行蛋白质鉴定的基本流程质谱技术进行蛋白质鉴定的基本流程 样品制备样品制备 与与IPG胶条水化胶条水化 IPG电泳电泳 与上样缓冲液浸润与上样缓冲液浸润 SDS-PAGE 转转PVDF膜膜 胶内直接染色胶内直接染色 染色染色 取出蛋白点取出蛋白点 胰酶等消化胰酶等消化 浓缩于多孔吸附柱上浓缩于多孔吸附柱上 MALDI-MS肽指纹图肽指纹图 数据库查询数据库查询 蛋白质鉴定蛋白质鉴定 已知已知 反向反向HPLC分离分离 MALDI-MS， PSD片段分析片段分析 未知未知 ESI-MS-MS、微测序、微测序 蛋白质组学研究方法课件 质谱法测序 1.1.肽段质量指

23、纹图谱肽段质量指纹图谱（PMF） 步骤：蛋白被蛋白酶专一步骤：蛋白被蛋白酶专一 性酶解后，用质谱检测生性酶解后，用质谱检测生 成的肽段，形成由各肽段成的肽段，形成由各肽段 质量组成的质谱图，将得质量组成的质谱图，将得 到的质量谱图与数据库中到的质量谱图与数据库中 通过计算得到的理论谱图通过计算得到的理论谱图 进行比较，进行鉴定。进行比较，进行鉴定。 代表方法：代表方法： 2DPAGE-MALDI-TOF Proteomics 2004, 4, 619-626. J. Biotechnol. 2003, 106, 147-156. J. Mass Spectrom. 1998, 33, 1-19

24、 蛋白质组学研究方法课件 2.2.多肽片段指纹图谱（多肽片段指纹图谱（PFFPFF） 步骤：用酶专一性酶解蛋步骤：用酶专一性酶解蛋 白质，经过分离，得到的白质，经过分离，得到的 肽段在质谱中被选择和破肽段在质谱中被选择和破 碎后得到碎后得到MS/MSMS/MS谱图，与数谱图，与数 据库中的谱图比较进行鉴据库中的谱图比较进行鉴 定定 代表方法：代表方法： LC-ESI-MS/MS 2D-LC-MS/MS（shotgun） Proteomics 2004, 4, 619-626. J. Biotechnol. 2003, 106, 147-156. J. Mass Spectrom. 1998,

25、33, 1-19 蛋白质组学研究方法课件 生物信息学在蛋白质组学研究中的作用 J. Biotechnol. 2003, 106, 147-156. 蛋白质组学研究方法课件 生物信息学在蛋白组研究中的应用 1. 1. 编码的编码的DNADNA序列的寻找与分析（分析研究对象）；序列的寻找与分析（分析研究对象）； 2. 2. 蛋白质序列信息的获取（搜索与测序）；蛋白质序列信息的获取（搜索与测序）； 3. 3. 蛋白质鉴定和性质预测蛋白质鉴定和性质预测; ; 4. 4. 蛋白质序列分析；蛋白质序列分析； 5. 5. 蛋白质结构和功能预测；蛋白质结构和功能预测； 6. 6. 数据的分析与整合：大范围基因

26、表达分析；蛋白数据的分析与整合：大范围基因表达分析；蛋白- - 蛋白相互作用；蛋白在细胞内的定位；构建通路和蛋白相互作用；蛋白在细胞内的定位；构建通路和 细胞系统；预测和发现新的知识。细胞系统；预测和发现新的知识。 蛋白质组学研究方法课件 蛋白质鉴定和性质预测 蛋白质鉴定：蛋白质鉴定： 1.1.检索工具和算法：检索工具和算法： PMFMS-Fit（Prospector的一部分）、的一部分）、ProFound、 Mascot； PFFMascot、SEQUEST、Emowse（EMBOSS软件包）。软件包）。 2. 网络鉴定工具网络鉴定工具: AAComldent工具工具 PeptideMass

27、工具工具 3. 3. 数据库资源：数据库资源： PIR-PSD： SWISS-PROT： 蛋白质组学研究方法课件 编码的DNA序列的寻找与分析 找寻找寻DNA的开放阅读框翻译编码区的开放阅读框翻译编码区 工具：美国国家生物技术信息中心（工具：美国国家生物技术信息中心（NCBI）提供的）提供的“ORF Finder” 欧洲生物信息研究所（欧洲生物信息研究所（EBI）提供的）提供的Protein machine 其它资源其它资源 1）美国国家生物技术信息中心（）美国国家生物技术信息中心（NCBI）：）： GenBank核酸序列数据库核酸序列数据库, ； 2）欧洲生物信息研究所（）欧洲生物信息研究所

28、（EBI）：）： 欧洲分析生物学实验室核酸数据库（欧洲分析生物学实验室核酸数据库（EMBL）, ； 3）日本国立遗传学研究所：）日本国立遗传学研究所： 日本日本DNA数据库（数据库（DDBJ）, 。 蛋白质组学研究方法课件 双向电泳的局限性 a.低拷贝蛋白的鉴定：目前的技术还不能检测出拷贝数低于低拷贝蛋白的鉴定：目前的技术还不能检测出拷贝数低于 1000的蛋白质的蛋白质 b.极端酸性和极端碱性的蛋白极端酸性和极端碱性的蛋白 c.分子量过大（大于分子量过大（大于100KD）或过小（小于）或过小（小于10KD）的蛋白）的蛋白 质不适合用这一方法质不适合用这一方法 d.一些疏水性蛋白，由于不能溶于提

29、取液而不适合一些疏水性蛋白，由于不能溶于提取液而不适合2-DE c.目前不能实现自动化处理，得到高质量的双向电泳图需要目前不能实现自动化处理，得到高质量的双向电泳图需要 精湛的技术精湛的技术 蛋白质组学研究方法课件 我国蛋白质组学的现状和发展趋势 国内在国内在19971997年开始开展蛋白质组研究年开始开展蛋白质组研究 20002000年中科院上海生化所发表了我国第一篇蛋白质组研年中科院上海生化所发表了我国第一篇蛋白质组研 究论文，并建立了我国第一个大型的蛋白质组数据库并究论文，并建立了我国第一个大型的蛋白质组数据库并 实现了网络共享实现了网络共享 20012001年军科院和湖南师大相继发表了

30、蛋白质组研究论文年军科院和湖南师大相继发表了蛋白质组研究论文 20022002年年1111月，在法国凡尔赛召开的首届人类蛋白质组国月，在法国凡尔赛召开的首届人类蛋白质组国 际大会上，贺福初院士当选为际大会上，贺福初院士当选为“人类肝脏蛋白质组研究人类肝脏蛋白质组研究 计划计划”执行主席，这是我国领导的一项重大国际合作计执行主席，这是我国领导的一项重大国际合作计 划，也是第一个人类组织器官的蛋白质计划，具有重要划，也是第一个人类组织器官的蛋白质计划，具有重要 的现实意义与重大的战略意义。的现实意义与重大的战略意义。 蛋白质组学研究方法课件 实实 例例 样品：结核杆菌样品：结核杆菌 1.菌体蛋白的

31、制备菌体蛋白的制备 菌体在含有菌体在含有1mM PMSF和和10mM EDTA的的MilliQ中重悬中重悬 超声破碎裂解菌体超声破碎裂解菌体15分钟，功率为分钟，功率为200瓦，超瓦，超1秒停秒停2秒秒 向超声裂解物中加入尿素、二硫苏糖醇、辛葡糖酐、两向超声裂解物中加入尿素、二硫苏糖醇、辛葡糖酐、两 性电解质终浓度分别为性电解质终浓度分别为9M、70mM、2%和和0.2%。 室温放置室温放置30分钟，分钟，10000g，15分钟。分钟。 蛋白浓度的测定，分装冻存。蛋白浓度的测定，分装冻存。 蛋白质组学研究方法课件 2.等电聚焦程序（等电聚焦程序（17cm胶条）胶条） 水化水化 主动水化主动水化

32、 50V 12h S1 除盐除盐 快速快速 250V 1.5h S2 除盐除盐 快速快速 1000V 2.5h S3 升压升压 线性线性 8000V 5h S4 聚焦聚焦 快速快速 8000V 80000Vh S5 保持保持 快速快速 500V 任意时间任意时间 3.SDS-PAGE 胶浓度为胶浓度为12%，上样量为，上样量为100ug。电泳时保持恒流状态。电泳时保持恒流状态。 4.银染银染 固定、水洗、敏化、水洗、染色、显色、终止固定、水洗、敏化、水洗、染色、显色、终止 5.扫描和软件分析扫描和软件分析 蛋白质组学研究方法课件 蛋白质组学研究方法课件 蛋白质组学研究方法课件 蛋白质组学研究方

33、法课件 蛋白质组学研究方法课件 展展 望望 蛋白质组学是针对蛋白质组研究的一门新兴学科蛋白质组学是针对蛋白质组研究的一门新兴学科,是人是人 类基因组计划完成后生命科学最活跃的领域之一类基因组计划完成后生命科学最活跃的领域之一,近年来近年来 发展迅速发展迅速,其相应的方法学也取得了巨大的进步。双向电其相应的方法学也取得了巨大的进步。双向电 泳泳-质谱技术虽然一直是蛋白质组学的核心技术质谱技术虽然一直是蛋白质组学的核心技术,但是近年但是近年 来一系列新技术新思想融入了蓬勃发展的蛋白质组学技术来一系列新技术新思想融入了蓬勃发展的蛋白质组学技术 当中当中,极大的促进了这门新兴学科在生命科学各个领域的极

34、大的促进了这门新兴学科在生命科学各个领域的 应用。应用。 蛋白质组学研究方法课件 1、质谱显像、质谱显像(Mass Spectrometry Imaging ,MSI)技术技术 质谱显像技术是利用基质辅助激光解吸质谱显像技术是利用基质辅助激光解吸/ 离子化质谱离子化质谱, 直接确定新鲜冰冻组织切片的多肽或蛋白的新技术直接确定新鲜冰冻组织切片的多肽或蛋白的新技术,也被也被 称为原位蛋白质组学。称为原位蛋白质组学。 通常该技术可以在组织的任意位置检出通常该技术可以在组织的任意位置检出400 个以上的个以上的 蛋白信号。蛋白信号。MALDI 质谱显像既有质谱设备的高敏感性全质谱显像既有质谱设备的高敏

35、感性全 部优点部优点,又具有同时检测混合物中多种成分的能力又具有同时检测混合物中多种成分的能力,基本无基本无 需考虑化学性质和分子质量。需考虑化学性质和分子质量。 质谱成像技术正在快速应用于许多领域。质谱成像技术正在快速应用于许多领域。 蛋白质组学研究方法课件 2 多维液相色谱多维液相色谱(Multiple Dimension Liquid Chromatography , MDLC) 将蛋白抽提物变性将蛋白抽提物变性 酸化酸化 强阳离子交换柱强阳离子交换柱 根据根据 各肽段的电荷差异进行分离各肽段的电荷差异进行分离 反相层析柱反相层析柱 电喷雾离子电喷雾离子 化质谱仪化质谱仪(ESI-MS)

36、 这一过程反复进行这一过程反复进行,从而得到由样品产生的多肽混合物从而得到由样品产生的多肽混合物 中各肽段的肽指纹图谱中各肽段的肽指纹图谱,结合数据库搜索即可得到样品的结合数据库搜索即可得到样品的 蛋白组成。感兴趣的肽段还可以在通过源后裂解或碰撞裂蛋白组成。感兴趣的肽段还可以在通过源后裂解或碰撞裂 解直接得出序列信息解直接得出序列信息,实现分离和鉴定一次完成实现分离和鉴定一次完成,达到对复达到对复 杂多肽和蛋白样本的有效分析和在线检测。杂多肽和蛋白样本的有效分析和在线检测。 蛋白质组学研究方法课件 3 核素标签色谱核素标签色谱 核素标签色谱是液相色谱核素标签色谱是液相色谱-质谱技术与核素示踪技

37、术相质谱技术与核素示踪技术相 结合的分离方法结合的分离方法,主要用于定量分析差异表达蛋白。广泛主要用于定量分析差异表达蛋白。广泛 应用的是同位素亲和标签应用的是同位素亲和标签( Isotopic-code affinity tag , ICAT) 。 此法敏感度高此法敏感度高,低表达蛋白分析准确性好。低表达蛋白分析准确性好。ICAT 是一种是一种 人工合成的有机分子人工合成的有机分子,一端是起亲和标签作用的生物素一端是起亲和标签作用的生物素,另另 一端为可与半胱氨酸发生特异性反应的活性基团。一端为可与半胱氨酸发生特异性反应的活性基团。 ICAT 技术利用巯基标记技术利用巯基标记,所以只能对含半胱氨酸残基的蛋所以只能对含半胱氨酸残基的蛋 白质进行分析是其不足之处。目前白质进行分析是其不足之处。目前ICAT方法又衍生了多方法又衍生了多 种新的方法种新的方法,如定量研究蛋白质磷酸化的磷酸化蛋白亲和如定量研究蛋白质磷酸化的磷酸化蛋白亲和 标签、大规模研究标签、大规模研究N-末端糖基化的糖基化定点标签、分析末端糖基化的糖基化定点标签、分析 蛋白质丰度的串联质量标签等。蛋白质丰度的串联质量标签等。 蛋白质组学研究方法课件 蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术 蛋白质芯片蛋白质芯片( Protein chips) 技术是一类高通技术是一类高通 量、微型化分析蛋白质表达和蛋白功能的新型分离量