多联实时荧光PCR检测几种重要肠道致病菌的实验研究

1、多联实时荧光pcr检测几种重要肠道致病菌的实验研究2l06chinatropicalmedicinevo1.6no.12december2006中国热带医学2006年第6卷第l2期多联实时荧光pcr检测几种重要肠道致病菌的实验研究彭雁忠,贾宏,邹原,肖性龙,黄胜中,林镜中.论着摘要:目的建立一种能同时检测志贺氏茵(sh),0l39霍乱弧茵(0l39vc)和空肠弯曲茵(cj)的多联实时荧光pcr定量方法.方法根据sh的ipah基因序列,0l39vc的wbfr基因序列,cj的c基因序列的开放读码框(orf),分别利用abiprimerexperess2.0和bnastar中的primerselec

2、t软件设计出数对特异性的引物和探针,筛选出最佳的各组引物和探针组合,对引物,探针的浓度,md浓度,taq酶的用量,反应条件等进行优化,从而建立了捡测临床标本中sh,o【3qvc和cj的多联荧光pcr反应体系和检测方法.结果实验显示该方法具有特异性强,灵敏度高,均达到100copies/mlo结论多联实时荧光pcr方法可同时定量地检测临床标本中sh,0mvc,cj,结果显示快速简便,准确高效,有利于上述病原茵所致疾病的早期诊断和治疗.关键词:志贺氏茵;0t39霍乱弧茵;多联实时荧光pcr空肠弯曲茵中图分类号:r378文献标识码:a文章编号:10099727(2006)12210604anexpe

3、rimentonquantitativemethodofmultilinkrealtimeluorescencepcrfordecflonofsh/ge,0l39vibriocholerae,campylobacterjejuni.pengyahzhong,jiahong,zouyuan,eta1.(1.theshenzhenhospitalofbeijinguni.vemi,shengzhen518000,guangdong,p.r.china;2.shenzhenhighoccupationaltechnicalinstitute)abstract:objectivetofoundtheq

4、uantitativemethodofmultilinkrealtimeluorescencepcrforsimultaneousdetectionofshigdla(sh),0139vibriocholerae(0l39vc)andcampylobacterejuni(cj).methodsaccordingtotheopenreadingflame(orf)ofsequenceofshipahgene,ol39vcwbfrgene,andcjcgene,severalcouplesofspecificprimersandprobesweredesigned,withutilizationo

5、fprimerselectsoftwareamongtheabiprimerexperess2.0anddnastarrespectively.optimalcombinationofeveryprimerandprobewasselected.optimizationofconcenationofprimerandprobe,m,taqenzymedosage,responseconditionwerooptimized.reactionsystemanddeterminationapproachofmultilinkrealtimefluorescencepcr(mlrtlpcr)were

6、establishedfordetectionofsh,o139vcandcjfromclinicalspecimens.resultstheresultsshowedthatmlrtlpcrpossessedhighspecificityandsensitivityfordetectionofsh,ol39vcandcjandachieved100copies/m1.conclusionthemethodofmlrtlpcrcandetectsh,0139vcandcjfromclinicalspecimensimultaneouslyandquantitatively.themethodi

7、sfast,convenient,accuratefavorableforthepurposesofearlydiagnosisandtreatment.keywords:shigeua(sh);0139vibriocholerae(oi39vc);campylobacterjejuni(cj);multilinkrealtimeluoreseencepcr志贺氏茵shigella(sh),ol39群霍乱弧菌ol39vibriocholerae(ovc)和空肠弯曲菌campylobacterjejuni(cj)是导致腹泻常见的病原菌j,而且这三种病原菌致泻的临床表现颇为相似:恶心,呕吐,水样腹

8、泻等.因此,探索一种快速,简便,准确,特异的确诊检验方法,对及时有效地实施针对性治疗具有重大意义.目前常见病原茵的检验方法存在着检测周期长,工作量大,所需试剂繁多,而且假阴性率高,灵敏度低,或假阳性率高,特异性差,不能满足现代临床检验的需求.本研究试图在一个反应管内,将三种荧光紊标记的不同的探针与上述三种病原体核酸进行特异结合,用特异性的pcr引物分别扩增荧光探针对应的病原体核酸片段,利用具有多个激光通道的荧光pcr检测仪,建立检测志贺氏菌(sh),o霍乱弧菌(ovc),空肠弯曲菌(cj)的多联实时荧光pcr反应体系,以尝试从分子生物学角度找出一条检测临床标本病原菌的快速简便的方法.1材料与方

9、法1.1材料1.1.1菌株研究所用共30株菌株均为北京大学深圳医院感染性疾病科实验窒分离并鉴定保存(见表1).1.1.2试剂和仪器营养肉汤,营养琼脂干粉购自北京陆桥公司;mbi5u/ultaq酶购自深圳晶美生物有限公司.dntps,depch20购自上海生物工程有限公司;基因组提取试剂盒为promega公司产品;trisbase,sds购自深圳赛泰克公司;edta,nac1,乙醇,异丙醇,氯仿,苯酚:氯仿(v/v=1:1)等为国产分析纯以上级试剂.引物,探针均由上海生物工程有限公司所合成.所用仪器包括abi7500荧光定量pcr仪,abi7000荧光定量pcr仪,abi7900ht荧光定量pc

10、r仪.移液器(1o00d,200gl,100gl,20p.1,2.5g1),低温微量超速离心机,水浴锅和涡旋振荡器等.基金项目:深圳市2004年度立项课题(200405134)作者单位:1.北京大学深圳医院,广东深圳518000;2.深圳高等职业技术学院,广东深圳518000;3.深圳太太基因工程有限公司,广东深圳518000.作者简介:彭雁忠(t959一),男,北京大学深圳医院感染科主任.主任医师,主要从事感染痛防治研究.中国热带医学2006年第6卷第l2蝴chinatropicalmedicinevo1.6no.12dee6e,200621o7表1实验菌株.i铀ielstrainsinnu

11、mberstrainnumbercampylobacterejuniszc1q11213e.colijm109sd8410campylobacterjejunicctcc199934proteusmirabilisatcc29唧ylobactercolinctc2509imonellaatcc9d89campylobactercoliszc1q12465salmonellaatcc14028campylobacterlarlnctc11352listeriamonocytogenesszciq7644campylobacterladnctc12144listeriamonocytogenesa

12、tcc19115campylobacterupaaliemianet:12206s如咖enteriaes2ciq4376campylobacterupsaliensisnctc11840shigellaflexnerlszciq2973bacilluscereusmyoidesatcc11778vibrioparahaemolyticusszciq4242bacillussubtilatcc6633vibrloparahaemolytleusszoq4237staphylococcusaurgusszciq6538enterobactersakazakiiszoq0013staphylococ

13、cusepidermidisszoq12228enterobactercloacaeszoq4530:streptococcusagalactiaenctc6571klebsieuaoxytocaszciq4510:e.coli0l57:h7szoq13813hbriocholerae01szciq7326e.coli0l57:h7szoq6543vibriocholerae0139szctq51441.2方法1,2.1引物与探针的设计根据志贺氏菌(sh),ol39霍乱弧菌(o.vc),空肠弯曲菌(cj)三种菌相应基因组的基因序列,即sh的ipah基因序列,0vc的wbfr基因序列,cj的c基

14、因序列,于genbank公用数据库中查找出有关的已经发表的基因序列及与之密切相关(同属)的另一种病原体序列,用primerex.press2.0j和dnastar】进行排序,分析,设计,评估,同时顾及3种病原菌的引物之间的二级结构关系,最后分别设计出相应的引物和探针,见表2.1.2.2细菌培养和dna的提取分别取志贺氏菌,空肠弯曲菌和0m群霍乱弧菌标准菌株于各自选择性培养基中培养24h,培养条件为37,150rpm.取增菌后的增菌液约lml于1.5ml的ep管(给每个ep管标记好编号),12o00rpm离心5min,去上清;在上述ep管中加入dna裂解液7o(),充分混匀重悬,水浴煮沸5min

15、;在每个ep管加入等体积的酚氯仿(v/v=1:1)溶液7ooa,充分混匀后离心,13o00rpm离心5rain;将上清液移入另一支ep管中,加入等体积的氯仿约600gl,混匀后,13o00rpm离心5min;将上清液移入另一支ep管中,加入0.6倍体积的异丙醇330gl(约5s0d0.6=330g1),上下颠倒混匀,静置一段时间,13o00rpm离心5rain,小心吸取上清;用70%乙醇冲洗,13o00rpm离心5min,小心吸取上清,倒置晾干(有可能看到管底呈现透明胶状物);在干燥后的ep管中加入50dna溶解液充分混匀,并分别取10稀释至10和l0两个浓度各lml,一20保存备用.表2志贺

16、氏菌,o1拍群霍乱弧菌,空肠弯曲菌荧光pcr引物与探针table2prim盯amlprobeoffluoreetcrforsh,otvc,cj1.2.3fam一志贺氏菌,聊一ol39群霍乱弧菌和cy5一空肠弯曲菌单重荧光pcr体系的建立分别利用针对fam一志贺氏菌,teto39群霍乱弧菌,cy5一空肠弯曲菌设计的引物探针,采用已优化好的反应体系_l1(称反应体系1)进行单重实时荧光pcr实验,探索循环条件.反应体系1(单重荧光pcr实验反应体系):10(nh)2so4buffer:2.5,mg:3,dntp:1,taq酶:0.5ta,h2o:13.5,pf:lgl,pr:1,pb:0.5,te

17、mplate:2l.循环条件:stepl:95c3min,step2:95c5see,60c40see,40cycles.1.2.4fam一空肠弯曲菌,cy5一志贺氏菌,teto】蚰群霍乱弧菌三重实时荧光pcr体系的建立反应体系2(三重荧光pcr实验反应体系):10(nh,)2s04buffer:2.5,mg:3,dntp:1,taq酶:0.5,he04.5.然后加入志贺氏菌,o瑚群霍乱弧菌和空肠弯曲菌的上下游引物各1,探针各0.5,模板各2.循环条件:stepl:953rain,step2:95cc5see,60c40see,40cycles.将反应体系2与下列模板组合进行三重荧光pcr实验

18、,三种荧光标记所对应的dna模板浓度比约为1:1:1.模板组合:fam一志贺氏菌一1ou+cy5一空肠弯曲菌一1o0+teto139群霍乱弧菌10.将反应体系2与下列三组模板组合进行三重荧光pcr实验,三种荧光标记所对应的dna模板浓度比约为10:1:1.组合一:fam一志贺氏菌一10+cy5一空肠弯曲菌一10+letol3q群霍乱弧菌一l0组合二:cy5一空肠弯曲菌一10.+fam一志贺氏菌一10.+tetol39群霍乱弧菌一10组合三:哪一o群霍乱弧菌一10.+cy5一空肠弯曲菌一l0+fam一志贺氏菌一101.2.5将反应体系2和列下三组模板组合进行三重荧光pcr实验,三种荧光标记所对应

19、的dna模板浓度比约为1o2:lo2:1.组合一:fam一志贺氏菌一10+cy5一空肠弯曲菌一21o8chinatropicalmedicinevo1.6no.12december2006中国热带医学2006年第6卷第l2期1o+tetol群霍乱弧菌一10组合二:cy5一空肠弯曲菌一lo+fam一志贺氏菌一10+tetoi39群霍乱弧菌一lo组合三:tetol39群霍乱弧菌一lo+cy5一空肠弯曲菌一loq+fam一志贺氏菌一loi.2.6将反应体系2和以下三组模板组合进行三重荧光pcr实验,三种荧光标记所对应的dna模板浓度比约为1o4:io2:i.组合一:fam一志贺氏菌一1oo+cy5一

20、空肠弯曲菌一102+teto139群霍乱弧菌一lo组合二:cy5一空肠弯曲菌一loo+fam一志贺氏菌一102+tetol39群霍乱弧菌一lo组合三:tetol39群霍乱弧菌一l00+cy5一空肠弯曲菌一lo+fam一志贺氏菌一lo2结果2.1单重荧光pcr实验结果单重荧光pcr实验结果(图13),由结果可看出,模板浓度为loo,10,1o一都呈标准的阳性扩增,且志贺氏菌,o,霍乱弧菌和空肠弯曲菌三种不同荧光索标记探针所对应的模板在相同浓度梯度时,ct值基本相同,即dna模板浓度空肠弯曲菌一o39群霍乱弧菌志贺氏菌,以下认为其浓度相等,此结果符合预期设想.一tj一,一._.7,#&-.

21、/誊/,_,:毹口&?i一.r,图1志贺氏菌梯度稀释单重实时荧光pcr扩增结果1ampicaiionresultsofshdilutedinntanddetectedwith8ine一iyrealtimei.,ucmscencepcr鼻_景gi3样再曲.:;9群曩耳l一一图2ol39群霍乱弧菌梯度稀释单重实时荧光pcr扩增结果graph3amplificationresultsofol39vcdilutedingradientanddeteetedwith斑eplymaltimeluareseencepcr2.2三重荧光pcr实验结果三重荧光pcr(三种荧光标记所对应的dna模板浓度比

22、约为i:1:1)实验结果(如图4),由结果可看到三种荧光标记的探针所对应的反应都呈阳性扩增,且相互之间可区分开,故推断在同一反应管中相同浓度的不同荧光索(fam,cy5,1et)标记的荧光可进行同时收集.1lr雀曲拍-/坚辞曲_o7.龋l蔗l0.t.1一.一.1|掌,f.a,埘t9蜡2拈.瓤箱甜御j嚣.甜神州图3空肠弯曲菌梯度稀释单重实时荧光pcr扩增结果graph3hmplificie即hdfcjdilutedgradientanddetectedwith.gleplyaltimeluo8c唧eper-l茹聋茹=三孝埘ii矿.棠.或稚誊耪嘲岿一一参1蕊m帮20汕瑚砧鞲糍图4志贺氏菌,0m群霍

23、乱弧菌和空肠弯曲菌相同模板浓度,不同荧光素标记探针的实时荧光pcr检测结果graph4detect瑚il1t0fiatieal皿plateconcentration3kinds0fpathogenicbactexia0fsh,0瑚vc,cjwithmulti一1址realluo删lcecepcr,tl她probemarkedwithdiffentflucein2.3同荧光素及相同浓度dna模板在单重反应和三重反应中的实验结果同一种荧光紊标记的探针所对应的相同浓度dna模板在单重反应和三重反应中的实验结果(如图5),由结果可知,同一浓度在三重反应和单重反应中的扩增结果重复性很高,由此可推断三重荧

24、光pcr的不同荧光的吸收相互之间并无干扰作用.|_.-一.氆h鼬蛳蛐.0_rl-r玉桕#-靠再_o=.,.11klit一-毒t0j#,乒每寰ii.【-to.图5相同模板浓度的单重和三重实时荧光pcr的结果c5detectresultofidenticalmmplateconcentrationwith8i咄andtbreeplyrealtimeluoreseencepcr三重荧光pcr实验(三种荧光标记所对应的dna模板浓度比约为1o一:1o:1)结果如图6,一高浓度模板所对应的荧光的收集对两低浓度所对应的荧光的收集无干扰作用.三重荧光pcr实验(三种荧光标记所对应的dna模板浓度比约为lo:

25、10:10),结果如图7.在同一反应管中两高浓度所对应的荧光的收集对低浓度所对应的荧光的收集无干扰作用.中国热带医学2006年第6卷第l2期chinatropicalmedicinevol,6no,12december20062l09b0fbn,20k占k._c矗m蚰且味妇出.l皇,._.一一一,皇审【b.0?hi.一/:./.i0l*t,.互一yc蚋图61个高浓度模板(100)和2个低浓度模板(1oi4)的三重实时荧光per结果graph6detectresultof1hish=(10)and2lower(10一)tem.plateconcentrationwiththreeplyrealt

26、imeluorescencepcr乜i丑j且强_山,r一.hio-:.,:.己.-_1辞葺0,.,.,.墨.图7两高浓度模板(1o)和一低浓度模板(1oi4)的兰重实时荧光per结果graph7detectresultof2rli#oo.)衄d1lower(10一)tern-plaleconcentrationwiththreep1yrealtimeluorescencepcr三重荧光pcr实验(三种荧光标记所对应的dna模板浓度比约为1o:1o:1)结果如图8,在同一反应管中高浓度所对应的荧光收集对中浓度所对应的荧光收集和低浓度所对应的荧光收集无干扰作用.ila%i【0.一一.iii.ii!

27、一专/,/_h,/,.0/,:.r37is城t日90担,i扑蛐*ol1钾图8高浓度(1o0),中浓度(10一)和低浓度模板(10一)的三重实时荧光pcr结果graph8detectresultofi-n#er(1o),and1lower(10i4)-plateconcentrationwiththreeplyrealtimeiorescencepcr3讨论近年来,荧光定量pcr技术通过连接电脑分析pcr过程中产生的荧光信号,实现了实时,在线检测pcr扩增过程而无需对pcr扩增产物进行后处理,从而彻底克服了传统pcr技术易污染的缺点,而多联荧光pcr技术l6更是实现了一管多检的临床要求,因而成为

28、检测领域上越来越重要的一种检测手段.本研究根据志贺氏菌(sh),0.霍乱弧菌(0.39vcj,空肠弯曲菌(cj)三种菌相应基因组的基因序列,即sh的tp.基因亭列,0t39vc的基因序列,cj的c基因序列,设计出能够区分出三对特异的引物和探针,建立了快速检测临床标本中的志贺氏菌(sh),o139霍乱弧菌(o.39vc),空肠弯曲菌(cj)三种细菌的方法一多联荧光pcr法.本文实验表明,在同一反应管中,不同荧光素标记的探针在模板相同浓度时可以同时检出,并且相互之间可以较好的区分开;在同一反应管中,相同荧光标记在单重荧光pcr和三重荧光pcr的扩增效果基本相同,即在三重荧光pcr中,不同荧光标记之

29、间不会有交叉影响;不同荧光标记在浓度有差异(ct值的差异大约为6和13)的情况下,也可同时检出;fam一志贺氏菌,tet一0【39群霍乱弧菌和cy5一空肠弯曲菌可以成功进行三重实时荧光pcr,而在理论上探针的标记是不存在差异性的,故推断此方法可应用于其它以fam,tet,cy5三类荧光素标记探针的菌株的检测.4结论通过不同模板浓度的实时荧光pcr实验证明志贺氏菌(sh),0.39霍乱弧菌(0139vc),空肠弯曲菌(cj)三种细菌三重荧光pcr检测体系不但具有单重实时荧光pcr的所有优点外,更主要的是实现了一管三检,大大方便了实际应用,具有广泛的应用前景.参考文献:i彭雁忠,贾宏,邹虹,等.多联实时荧光pcr定量方法检测4种细菌的研究fj.中国热带医学,2005,5(5):943947.2吴永宁.现代食品安全科学m.北京:化学工业出版社,2003,336337.3食品微生物学检验(中华人民共和国