人类疾病预防与控制

1、1 第一节：人类疾病动物模型定义 人类疾病动物模型(Animal models of human diseases)是指在医学研究中，在动物身上建立， 或形成类似人类疾病动物。通过动物模型直接， 或间接反映疾病的发生和发展过程，在了解疾病 的基础上开创和改进、优化疾病的治疗。 2 人类疾病动物模型的意义 1.避免直接实验所造成危险。 2.临床上平时不易见的疾病可以随时复 制。 3.增加方法学上的可比性。 4.样品易得，实验方法简化。 5.有助于了解疾病的本质。 3 1.避免直接实验所造成危险。 古人尝白草 肿瘤 损伤 中毒 4 2.临床上平时不易见的疾病可以随时复 制 发病率低：遗传疾病，传染

2、病，内分泌疾病 潜伏期长：动脉粥样硬化 病程长：慢性哮喘，甲亢 放射病，毒气中毒，烈性传染病 5 3.增加方法学上的可比性 年龄，性别，体质，遗传，社会因素等，都对疾 病发生发展起着一定的影响作用。 动物模型，认为设计，遗传背景等各项条件都很 清楚，或可以控制，因此可以排除外因干扰。 6 4.样品易得，实验方法简化 动物模型，可按需要采集各种样品，其中包括处死 收集标本。取材方便，简化了试验方法。 5.有助于了解疾病的本质 临床研究带有一定的局限性 同一病原体对人和动物的感染 观察遗传因素对疾病发生发展的影响 可以用单一病因短时间复制出人类疾病 7 动物疾病模型具有的特点 应再现所要研究的人类

3、疾病，动物疾病表现应 与人类疾病相类似； 动物能重复产生该疾病，最好能在2种动物体复 制该病； 实验动物合格，动物背景资料完整，生命周期 要满足实验需要； 动物要价廉、来源充足、便于运送； 尽可能选用体型小的动物。 8 第二节：人类疾病动物模型的分类第二节：人类疾病动物模型的分类 1诱发性动物疾病模型(Experimental animal model) 是指以物理学、化学、生物学等致病手段，人 为导致动物组织、器官或整体成为人类疾病动物模 型；使其在功能、代谢、形态结构等方面发生改变， 即人为地诱发动物产生类似人类疾病模型。 9 应用：药理学，毒理学，免疫学，肿瘤学 和传染病等 优点：简便，

4、条件简单，其他因素容易控 制，短时间内可大量复制 不足：诱发动物模型在某些方面与自然产 生的疾病模型有所不同；某些疾病不能用 人工方法诱导。 10 2自发性动物模型(Spontaneous animal model) 是指不加任何人工诱发，在自然条件下动物自 然产生的疾病，或者由于基因突变的异常表现， 通过遗传育种保留下来的动物疾病模型。其中包 括近交系的肿瘤疾病模型和突变系的遗传性疾病 模型。 11 常用的自发突变模型常用的自发突变模型 高血压模型高血压模型 （SHR大鼠）大鼠） 肥胖模型肥胖模型 （Zucker大鼠）大鼠） 糖尿病模型糖尿病模型 GK大鼠大鼠 肥胖并糖尿病肥胖并糖尿病 模型

5、模型 （db/db小鼠）小鼠） 12 优点：在一定程度上减少人为的因素，更接近自 然的人类疾病。 缺点：目前发现的种类有限。 近交系肿瘤模型，因实验动物种属，品系 不同，其肿瘤发生类型，机理有所不同 疾病动物需要饲养条件要求高，操作技术 性强。 13 3抗疾病型动物模型(Negative animal model) 是指特定的疾病不会在某种动物身上发 生。因此，可借以探讨何种动物对该疾病 有天然的抵抗力。 14 4生物医学动物模型(Biomedical animal model) 是指以动物生物学特征提供人类疾病 相似表现的疾病模型。 15 二、按系统范围分类二、按系统范围分类 1疾病基本病理

6、过程动物模型 是指致病因素在一定条件下作用于动物后，所 出现的共同性的功能、代谢和形态结构某些改变 的动物模型。 这种动物模型的致病因素不是某种疾病所特有 的，而是各种疾病都可能共同发生的。 是研究疾病机理和药物筛选理想的方法。 16 2各系统疾病动物模型 是指与人类各系统疾病相应的动物模型， 如神经、心血管、呼吸、消化、泌尿等系 统疾病相应的动物模型。 17 A.神经系统 1大鼠囊状脑动脉瘤 结扎大鼠颈总动脉，同时佐以脱氧皮质 酮和高渗盐水处理，饲喂含有氨基丙睛 的饲料，复制囊状动脉瘤模型，为研究人 类脑动脉瘤与血液动力学的关系，病变的 发展及发病机理提供有益的帮助。 18 2结扎大鼠中动脉

7、的大鼠卒中模型 结扎大鼠大脑中动脉，复制中风模型其 优点是能产生非致命性的孤立性病灶损害， 可提供长期的行为学和生物化学的研究。 19 3.维生素A缺乏引起的兔脑积水模型 选用雌性幼兔，饲以限制维生素A饲料，诱发兔 脑积水。该模型优点是易复制，易收集胎兔和新 生兔的标本样品，通过血清维生素A的监测，可控 制血清中维生素A的浓度，有利进行生化和形态学 的研究。 20 B.心血管系统 1.动脉粥样硬化 长期以来用兔饲以高脂肪、 高胆固醇饲料诱发动脉粥样硬化的动物模型。给 小型猪饲喂高脂肪、胆固醇饲料诱发动脉粥样硬 化病变，其解剖部位，病理特点均与人类相似， 有时还伴有心肌梗塞，较易饲养管理，小型猪

8、是 一种很好的模型动物。 21 2心肌缺血和心肌梗塞 电刺激法：雄性成年免麻醉后，用弱、强刺激(弱为 0.81.6毫安，强为46毫安)交替刺激右侧下丘脑背侧 核，复制心肌缺血动物模型； 药物法；给大鼠、兔注射异丙肾上腺素，犬静脉给予麦 角新硷制备冠状动脉痉挛模型； 冠状动脉阻断法：应用大鼠、犬麻醉后,分离冠状动脉 套上自制的冠状动脉压迫环，制备心肌缺血和心肌梗死模 型。 22 3高血压 目前，应用最广泛的是日本学者培育的突变 系SHR大鼠。该鼠自发性高血压的变化与人类相似， 并且可产生脑血栓、梗塞、出血、肾硬化、心肌 梗死和纤维化等变化。在SHR的基础上，又培育了 两个亚系SHRSP和SHRS

9、R，前者出生后，除出现严 重高血压外,90以上患脑卒中(脑出血和脑栓塞)； SHRSR则是抗脑卒个的自发性高血压大鼠。 23 C.呼吸系统 1用异性蛋白注射致豚鼠过敏症动物模型，包 括支气管痉挛、哮喘和过敏性休克。1974年 Petterson和Kelly发现狗可以对空气中过敏原(草、 树、灰尘和猫抗原)引起过敏症的模型。主要表现 为豚草花粉病、患犬出现眼结膜炎、鼻炎、重度 搔痒性皮炎，血液内有抗脉草抗原的循环抗体， 相当于人体免疫球蛋白IgE。这些是临床研究和生 产检定过敏症的动物模型 24 2慢性支气管炎和肺炎 70年代初学者应用SO2、烟雾、甲醛蒸气、辣性 气体等制备诱发性猴、免、大鼠、

10、小鼠的慢性支 气管炎动物模型。 有人先后将木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶，胰蛋白 酶，蛋白溶解酶分别注入兔，大鼠，地鼠气管内 诱发肺气肿。 25 D.消化系统 1先天性高胆红素血症模型：已发现非洲啮齿 类胃溃疡、地鼠的肝淀粉样变、羊和大鼠的先天 性高胆红素血症动物模型。尤其是South-downe变 种羊，因其先天性肝脏摄取有机阴离子缺陷(胆红 素)，造成血中未结合的胆红素增高。 26 2小牛轮状病毒性肠炎模型： 轮状病毒性肠炎对人类及许多动物都能引起感 染，如小鼠、兔、羊、猪等。在实验中发现人类 与动物可交叉感染，小牛轮状病毒性模型有利于 生产大量血清与抗原，便于手术、粪便特征容易 监测，是传染病学

11、、生理学研究较好模型。 27 3豚鼠溃疡性结肠炎模型： 豚鼠口服变质角叉菜(从红海藻中提取)溶液， 产生溃疡性结肠炎、临床表现与人类溃疡性结肠 炎相似，是研究溃疡性的发病机理、综合症对全 身影响，和治疗方法的模型。 28 E.泌尿系统 1.诱发性肾小球肾炎模型： 给兔、猫、狗注射异种抗肾血清、细菌抗原与 肾组织复合抗原，以及抗原抗体诱发动物肾小球 肾炎模型。 29 2.自发性肾脏疾患模型： 如芬兰的Landrace羊羔中有一种发展迅速致死 的肾小球肾炎，伴有肾小球免疫荧光复合物的沉 积。 狗、猫自发的免疫介导肾小球肾炎动物模型。 30 3.继发性肾炎模型： 小鼠淋巴脉络膜炎、乳酸脱氢酶、鼠类的

12、白血病 病毒感染等均能复制继发性肾炎。 31 F.内分泌与代谢 (1)手术糖尿病模型 ： 自从德国的Won Mening将犬作胰腺全切除术，造成糖尿 病后，陆续报道猫、大鼠、兔、猪、猴等切除80一90 胰腺，并受到高糖饮食刺激后，引起永久性糖尿病。 32 (2)化学物质损伤胰岛细胞： 链脲佐菌素(STZ)一次腹腔或静脉注射30一100mgkg几天 后可使狗、大鼠等动物产生永久性高血糖。 四氧嘧啶(A11oxan)一次静脉或腹腔注射30150mgkg， 可复制糖尿病模型，但可造成肝、肾组织的损害，而且较 多的资料证明，它在生理上不同于人类所患的糖尿病。 环丙庚哌,给大鼠连续给药4周后，可见高血糖

13、症状。 鼠脑炎、心肌炎(EMC)病毒M型变异可诱发若干品系的成年 小鼠糖尿病，如DBA2、CD-l、C3H、C57BL、BALBcj。 33 (3)遗传性及自发性糖尿病： kk小鼠由日本杂种小鼠交配得来的遗传性糖尿病小鼠，其 生物特性类似ob小鼠，属先天遗传缺陷性小鼠。 C57BLks小鼠是一种具有db基因的近交小鼠，其表现多 食肥胖及血糖升高，类似人类中年肥胖合并糖尿病 中国地鼠(黑线仓鼠)有50自发产生糖尿病，属多基因遗 传，病鼠耐糖曲线类似人类型非胰岛素依赖性)糖尿病。 BB Wistar系大鼠：是一种典型自发遗传 I型(胰岛素依赖 性)糖尿病的动物模型。其临床表现为多饮、多食、体重 下

14、降、高血糖及酮尿。 34 三、中医证候动物模型三、中医证候动物模型 中医动物模型经30余年的研究，已形 成独特的体系。为中医基础病理学、 基础药理学研究提供了重要依据。 35 1960年发现,过量使用肾上腺皮质激素的小鼠表现为阳虚 征象：体重下降、萎靡、耐寒力低。 1963年又发现用助阳药(附子、肉桂、淡众蓉、仙灵脾)能 治疗这种状态。 1964年，易宁育用六昧地黄汤治疗类似阴虚的肾性高血压 大鼠。 1977年，上海中医学院用肾上腺皮质激素和甲状腺，加利 血平复制小鼠阳虚、阴虚模型并用助阳药、滋阴药治疗。 1979年，张启元尝试用灌喂大黄煎剂“泻下伤脾”，建立 小鼠脾虚证模型 。 1988年，

15、由杨云主持研究的“劳倦和饥饱所致大鼠脾虚证 模型”获得国家中医药管理局科技进步二等奖。 36 四、设计动物模型的注意事项四、设计动物模型的注意事项 1尽可能再现所要的人类疾病的模型 。 复制模型时必须强调从研究目的出发，熟悉诱 发条件、宿主特征、疾病表现和发病机制，充分 了解所需动物模型的全部信息，分析时候能得到 预期结果。 要避免选用与人类对应气官相似性很小的动物 作为疾病模型 动物模型.doc 37 2注意选用标准化和实用价值高的动物。 模型应适用于多数研究者使用，容易复制，实验中便于 操作和采集各种标本。 动物来源必须充足，选用多胎分娩的动物对扩大样本和 重复实验是有益的。尤其对慢性疾病

16、模型来说，动物须有一 定的生存期，便于长期观察使用，以免模型完成时动物已频 于死亡或毙于并发症。 野生动物在自然环境中观察有助于正确评价自然发病率 和死亡率。复制模型时必须注意动物种群的选择，要了解各 类动物种群的特点和对复制动物的影响。 38 用于生物医学研究的动物种群，可按其遗传成分和其环境 被研究人员控制的程度，分为三种基本类型： 实验室类型，它们可提供最大程度的遗传和环境操作； 家养类型，不论是乡村或城市饲养的，人类对其干扰的程 度不同，且动物环境与人类环境可为能极为接近； 自然生态类型。几乎没有人为的干扰。可能某种动物（啮 齿目、食肉目、兔形目）可按所有三类类型进行研究，这就 增加了

17、对环境和遗传因素作比较研究的可能性。 在选用三类动物种群复制动物模型时，必须了解它们各 自的优点和缺点 不同类型的动物种群的优点和缺点.doc 39 注意环境因素对模型动物的影响 复制模型的成败往往与环境的改变有密切关 系。拥挤、饮食改变、过度光照、噪音、屏障系 统的破坏等，任何一项被忽视都可能给模型动物 带来严重影响。除此以外，复制过程中固定、出 血、麻醉、手术、药物和并发症等处理不当，同 样会产生难以估量的恶果。因此，要求尽可能使 模型动物处于最小的变动和最少的干扰之中。 40 不能盲目地使用近交系动物,不然会导致不能控 制的因素进入实验 例如自发性糖尿病大鼠(BB、Wistar)除具有

18、糖尿病临床特征外，还发现多种病理变化（外周 神经系统严重病变、睾丸萎缩、甲状腺炎、胃溃 疡、恶性淋巴瘤等）。因此要有目的地选择。半 个世纪以来，近交系的开发不断提供着新的动物 模型材料，大、小鼠疾病作为模型在医学使用量 已高达7090%。 41 利用近交系作动物模型时还必须认识到： 1.动物形成亚系后不应该再视为同一品系。 要充分了解新品系的特征和背景材料。 2.即使作为已形成模型的品系，由于不适当 的育种方法和环境改变，还可发生新的基因突变 和遗传漂变；即存在着变种甚至断种的危险。 3国外经常取用二种近交系的杂交一代 （F1）作为模型。其个体之间均一性好，对实验 的耐受性强，又多少克服了近交

19、系的缺点。但盲 目引进F1代动物对复制所要求的模型是缺乏意义 的。 42 动物进化的高级程度并不意味着所有器官和功 能接近于人的程度 复制动物模型时，在条件允许的情况下，应 尽量考虑选用与人相似、进化程度高的动物作模 型。但不能因此就认为进化程度越高等的动物其 所有器官和功能越接近于人。例如，非人灵长类 诱发动脉粥样硬化时，病变部位经常在小动脉、 即使出现在大动脉也与人类分布不同。据报导用 鸽（White Gameau Pigeon）作这类模型时，胸 主动脉出现的黄斑面积可达10%，镜下变化与人 也比较相似，因此也广泛被研究者使用。 43 正确地评估动物疾病模型 应该懂得没有一种动物模型能完全

20、复制人类 疾病真实情况，动物毕竟不是人体的缩影。模型 实验只是一种间接性研究，只可能在一个局部或 几个方面与人类疾病相似。因此，模型实验结论 的正确性只是相对的，最终必须在人体身上得到 验证。复制过程中一旦出现与人类疾病不同的情 况，必须分析其分岐范围和程度，找到相平行的 共同点，正确评估哪些是有价值的。 44 第三节：第三节：免疫缺陷动物模型免疫缺陷动物模型 免疫缺陷动物是指由于先天性遗传突变，或用 人工方法，培育一种或多种免疫功能缺陷的动物。 免疫缺陷动物开创了肿瘤学、免疫学、细胞生 物学的新的里程碑。 45 分类：分类： 按免疫功能缺陷的种类常分为: 1.T-淋巴细胞功能缺陷动物：裸小鼠

21、、裸大鼠、裸 牛、裸豚鼠等。 2.B-淋巴细胞功能缺陷动物：CBA/N小鼠、Arabin马 和Quarter马等马属动物。 3.NK细胞功能缺陷动物：Beige小鼠。 4.联合免疫缺陷动物：Scid小鼠等其他人工定向培 育的多种免疫功能缺陷动物。 46 常见的免疫缺陷动物常见的免疫缺陷动物 1.裸小鼠 是指先天性无胸腺，且无被毛的小鼠,简称为 裸小鼠。其突变基因为裸基因,符号为:nu,是一个 隐性突变基因,位于小鼠的第11号染色体上。目前， 此基因已导入到不同品系的小鼠中,常见的有 BALB/c-nu、C3H-nu、C57BL/6-nu等。 47 裸鼠的解剖生理特点： 毛囊发育不良，外观上看几

22、乎没有被毛，故称“裸鼠”； 无胸腺，仅有胸腺残迹或异常的胸腺上皮。故不能分泌胸腺素，不能 使T细胞正常分化，而T细胞是移植排异的主要细胞。细胞基本正常但 功能欠佳。有较高的NK细胞数量和活性。 因为IgG的产生需要T细胞和巨噬细胞的参与，其免疫球蛋白主要是IgM， 只有极少量的IgG。 自发肿瘤现象罕见，可能与NK细胞的活性高有关。 裸鼠易患鼠肝炎和病毒性肺炎。 纯合裸鼠母性极差，且受孕率低，乳房发育不良。通常以纯合雄鼠与 带有nu基因的杂合雌鼠（nu/+nu/nu）可获1/2裸鼠。 裸鼠需饲养在屏障环境中。 48 裸鼠的应用 （1 1）肿瘤学。）肿瘤学。 （2 2）微生物学。）微生物学。 （

23、3 3）免疫学。）免疫学。 （4 4）寄生虫学。）寄生虫学。 （5 5）遗传学。）遗传学。 （6 6）遗传学。）遗传学。 （7 7）临床医学。）临床医学。 49 2.裸大鼠 1953年，英国科学家首次在大鼠中发现一种外观与裸小 鼠相似，只是被毛不像裸小鼠那样全无，通过解剖和免疫 学检查发现其也是无胸腺、缺乏T细胞功能，B细胞功能正 常，细胞活力增强，繁殖方式与裸小鼠相同，且能接受异 种组织和细胞移植。 50 3.Beige（bg）小鼠 为NK细胞活性缺陷的突变系小鼠，bg是隐性突变基因，位于第13号 染色体上。纯合的小鼠（bg/bg）被毛完整，但毛色变浅，耳廓和尾 尖色素很淡。这种小鼠其内源性

24、NK细胞功能缺陷。纯合bg基因降低杀 菌活性。 bg对化脓性细菌感染非常敏感，对各种病原因子也都较敏 感， bg小鼠必须在屏障环境中才能较好的生存。繁殖时可采用纯合 子的亲本。 51 4.SCID小鼠 SCID小鼠的全称为“重症联合免疫缺陷”小鼠。其突变 点在16号染色体上，为单基因突变，突变符号为scid，当 其纯合时，性状表现为淋巴细胞抗原受体基因编码顺序异 常，造成T、B淋巴细胞不能分化为特异性的淋巴细胞，目 前已有多种不同品系的SCID小鼠。 52 SCID小鼠的生物学特征： 外观与普通小鼠无异样，但其胸腺、脾、淋巴结等免役器官的重量 不到正常小鼠的30%。其胸腺多为脂肪组织包围，没有

25、皮质结构，仅 残存的髓质。外周白细胞较少，淋巴细胞仅占总数的10-20%（正常小 鼠为70%）。 饲养环境饲养环境 SCID小鼠需在屏障环境（ 空气洁净度万级以下）中， 方能存活一年以上。其繁殖生产，以近交系繁殖方式进行， 产子率和离乳率均低于正常小鼠。 53 5.Motheaten小鼠 突变基因（me）位于第6号染色体上，出生后两天内即 可有病变现象，表现为皮肤脓肿，有严重的联合免疫缺陷 现象。对胸腺依赖和不依赖抗原均无反应，细胞毒和自然 杀伤细胞活性低下。此小鼠对于先天性早期免疫缺陷和某 些自身免疫疾病的研究有着重要的价值。 54 6.人工定向培育的多联免疫缺陷型小鼠 目前，常见的三种小鼠

26、的三个隐性免疫基因，即 NK细 胞缺陷的Beige基因、T细胞缺陷的nu基因和B细胞缺陷的 Xid基因。可将它们杂交- 回交，筛选出T、B、NK细胞三 联免疫缺陷小鼠。这种小鼠对于实验性的肿瘤移植和免疫 功能的研究有着极其重要的作用。 55 转基因动物的概念转基因动物的概念 所谓转基因动物就是把外源性目的基因导入动物的受精卵 或其囊胚细胞中，后改用注入受精卵的任何一个前核，并在细 胞基因组中稳定整合，再将合格的重组受精卵或囊胚细胞筛选 出来，采用借腹怀孕法寄养在雌性动物（foster mother）的 子宫内, 使之发育成具表达目的基因的胚胎动物, 并能传给下 一代。这样，生育的动物为转基因动

27、物。这类动物由于外源性 目的基因的稳定存在而赋于子代动物个体。 56 转基因动物技术的主要步骤转基因动物技术的主要步骤 获取外源目的基因 外源目的基因导入生殖细胞或胚胎干细胞 选择携带目的基因的细胞，选择体外培养系统和宿主动 物 转基因胚胎的发育及鉴定 筛选所得的转基因动物 57 目的基因的制备 目的基因的制备 目的基因的获得 逆 转 录 合 成 法 化 学 合 成 法 P C R 扩 增 法 目的基因的扩增 通过载体在宿主中克隆 通过PCR扩增目的基因 58 目的基因的导入目的基因的导入 脂质体介导法 脂质体是磷脂在水中形成的一种由脂类双分子层围成的囊状结构 形 成 囊 状 结 构 可 将

28、D N A 包 在 其 中 带有外源DNA的脂质体通过细胞的内吞作用进入受体细胞，达 到基因转移的目的 血影细胞介导法 血影细胞：哺乳动物细胞溶血，使血红蛋白大量逸出，最后成 为仅有被细胞膜包被的细胞核结构 血红蛋白大量逸出时，外源DNA也容易进入。让血影细胞与受 体细胞在适当条件下发生细胞融合，从而使外源DNA导入受体细 胞 电转移法 受体细胞与外源DNA按一定比例混合后，放入电脉冲槽中， 经用脉冲电压刺激，外源DNA即可进入细胞（或受精卵） 59 目前应用于生产转基因动物的方法 - -原核显微注射原核显微注射 生殖细胞载体生殖细胞载体 反转录病毒转染反转录病毒转染 体细胞核移植体细胞核移植

29、 胚胎干细胞技术胚胎干细胞技术 应用较早并且被公认应用较早并且被公认 和成熟的技术和成熟的技术 最具应用潜力的并且也是最具应用潜力的并且也是 目前发展最快的技术目前发展最快的技术 60 原核注射原核注射 显微注射法是建立得最早的转基因方法，也是目前 使用最为广泛、最为有效 的方法。其所具有的优点是: 基因的转移率高，整合效率可达30%:可直接用不含有原 核载体DNA片段的外源基因进行转移;外源基因的长度不 受限制，可达几百kb;常常能得到纯系动物;实验周期相 对比较短。 61 外源基因 基因微注射 移植受精卵 小鼠出生 转基因鼠的检测 繁殖后代繁殖后代 62 A :A :准备注射的原核清晰的卵

30、母细准备注射的原核清晰的卵母细 胞胞 B:B:注射过程注射过程 C: C: 注射后的卵母细胞注射后的卵母细胞 D: D: 吸取基因注射液吸取基因注射液 63 转转GFPGFP绿色荧光胚胎绿色荧光胚胎 64 转转GFPGFP绿色荧光胚胎绿色荧光胚胎 65 生殖细胞载体技术 有体外和体内转染生殖细胞的两种方法，前者又包括精 子载体法、卵子载体法、受精卵载体法、胞浆内精子注 射法等。 精子载体法是将成熟的精子与外源DNA的载体共同孵育， 使精子携带外源DNA，受精后外源DNA整合至染色体中。 此法理论上是可行的、也有成功的先例，但成功率不高、 效 果 不 稳 定 ， 有 待 继 续 探 索 、 完

31、善 。 66 反转录病毒转染 将目的基因重组到反转录病毒RNA载体上,制成高滴度的病毒颗粒,人 为感染着床前或着床后的胚胎,也可以让胚胎与能释放反转录病毒的 单培养层细胞共孵育以达到感染的目的。反转录病毒RNA进入寄主细 胞后,被反转录为DNA,并在整合酶和其末端特殊核酸序列作用下整合 到寄主细胞的基因组进行表达和遗传,得到转基因动物。 67 目的基因目的基因 逆转录病毒逆转录病毒 卵母细胞卵母细胞 成熟卵母成熟卵母细细胞胞 精子精子 导入 感染 体外受精 囊胚囊胚受体受体动动物子物子宫宫 胚胎移植 转转基因基因动动物物 妊娠 68 体细胞核移植 体细胞核移植技术是先把外源基因整合到供体细胞上

32、体细胞核移植技术是先把外源基因整合到供体细胞上, ,然后将供体细然后将供体细 胞通过显微操作的方法注射到去核卵母细胞中胞通过显微操作的方法注射到去核卵母细胞中, ,组成重构体组成重构体, ,通过激活通过激活 使其发育成转基因重构胚胎，再把其移植到假孕母体使其发育成转基因重构胚胎，再把其移植到假孕母体, ,待其妊娠、分待其妊娠、分 娩后便可得到转基因克隆猪。此法具有相对较大的优越性娩后便可得到转基因克隆猪。此法具有相对较大的优越性: :转基因效转基因效 率高率高, ,约是显微注射法的约是显微注射法的2 2倍；可对外源基因在供体细胞上是否整合、倍；可对外源基因在供体细胞上是否整合、 整合状况及整合

33、位点预先进行准确鉴定和评估；也可以提前预测基因整合状况及整合位点预先进行准确鉴定和评估；也可以提前预测基因 的表达情况；不存在位置效应且能大大节省供体和受体动物的数量及的表达情况；不存在位置效应且能大大节省供体和受体动物的数量及 费用。费用。 69 目的基因目的基因 动物胎儿成纤维细胞动物胎儿成纤维细胞 卵母卵母细细胞受体胞受体 导入 注核 囊胚囊胚受体受体动动物子物子宫宫 胚胎移植 转转基因基因动动物物 妊娠 成熟卵母细胞成熟卵母细胞 去核 70 核移植获得的表达红色荧光蛋白的兔克隆胚 左图为光镜视野照片， 右图为激发荧光的照 片。 71 核移植获得的表达绿色荧光蛋白的兔克隆胚 72 200

34、72007克隆出世界首例转基因克隆兔 Transgenic Res 18(2):227-35, 2009 Apr (TRAGonline) doi:10.1007/s11248-008-9227-y 世界首例转基因克隆兔在沪诞生世界首例转基因克隆兔在沪诞生(图图) 2007-12-14 08:50来源：解放日报 实验首先取兔耳组织培养获得所需要 的成纤维细胞，经过次传代， 再将一种从特殊水母中提取的绿色荧光 蛋白基因转染到兔子成纤维细胞中， 再挑选出发绿色荧光的转基因体细胞， 将其细胞核移植到成熟的去核兔子 卵母细胞中，最终构成了转基因胚胎。 胚胎经过手术，移植入“代孕兔”体内。 经过天孕期，

35、通过给代孕 兔剖腹产获得幼兔，再经人工辅助哺育， 顺利断奶等一系列的过程，最终成功 获得了这只转基因克隆兔。转基因克隆 兔由于基因与原来兔子完全一样，加上 有发绿光的标记基因，便于鉴定，可以 尝试转入或转出某种基因，研究特定基 因和相关疾病的关系。 73 20072007获得世界首例转基因绿色荧光克隆兔获得世界首例转基因绿色荧光克隆兔 74 猪转绿色荧光蛋白的克隆胚胎体外发育猪转绿色荧光蛋白的克隆胚胎体外发育 A: 转EGFP供体 细胞 注核 B: 4-细胞转EGF P克隆胚胎 C: 8-细胞转EGF P克隆胚胎 D: 转EGFP克隆 囊胚 75 体细胞核移植方法生产转基因猪体细胞核移植方法生

36、产转基因猪 76 胚胎干细胞技术 将ES细胞植入动物囊胚后,可参与宿主胚胎的形 成,直至达到种系嵌合,因此,可将其作为一种载 体,把外源DNA导入ES细胞就可以实现由此发育 而成的转基因动物。该方法的优点是外源基因 的整合率很高,约50%,整合率在生殖细胞中的比 例约为30%。缺点是不易建立ES细胞系。 77 嵌合体的制作通常由聚合法和显微注射法两种。聚 合法首先去掉胚胎的透明带，然后将要聚合的细胞 放在一个凹槽内进行培养，使它们发生融合。进而 发育为一个胚胎，再通过胚胎移植得到嵌合体动物； 显微注射法是指将细胞或卵裂球注射到另一枚胚胎 内（胚胎可以是不同阶段的，如2，4，8-细胞或囊 胚），然后通过胚胎移植得到嵌合体动物。 78 囊胚注射 在直径为6cm的培养皿内用50l ES细胞培养 液做操作滴。选择形态较好的，细胞小而圆的吸 到注射针内。注射针从内细胞团对面的位置刺入， 将ES细胞轻轻的注入到囊胚腔内，一般每个囊胚 注射12枚左右ES细胞。等囊胚腔消失的后，慢慢 的抽出注射针。注射完一批后，一起移入CZB培 养液中，放入37、5%CO2的