毕业设计（论文）-摇床水平确定枯草芽孢杆菌YS-45的最佳发酵培养基

1、长沙学院changsha university毕业设计（论文）资料设计（论文）题目：摇床水平确定枯草芽孢杆菌ys-45的最佳发酵培养基 系部： 生物工程与环境科学系 专 业： 生 物 工 程 学 生 姓 名： 熊 威 班 级： （2）班 学号2006052211 指导教师姓名：罗永兰 职称 教授 最终评定成绩 长沙学院教务处 二七年十月制目 录第一部分 毕业论文一、毕业论文第二部分 外文资料翻译一、外文资料原文二、外文资料翻译第三部分 过程管理资料一、 毕业设计（论文）课题任务书二、 本科毕业设计（论文）开题报告三、 本科毕业设计（论文）中期报告四、 毕业设计（论文）指导教师评阅表五、 毕业设

2、计（论文）评阅教师评阅表六、 毕业设计（论文）答辩评审表2010届本科生毕业设计（论文）资料第一部分 毕业论文（2010届）本科生毕业论文摇床水平确定枯草芽孢杆菌ys-45的最佳发酵培养基系部： 生物工程与环境科学系 专 业： 生 物 工 程 学 生 姓 名： 熊 威 班 级： （2）班 学号2006052211 指导教师姓名： 罗永兰 职称 教 授 最终评定成绩 2010 年6月 长沙学院本科生论文摇床水平确定枯草芽孢杆菌ys-45的最佳发酵培养基系 （部）：生物工程与环境科学系专 业： 生 物 工 程 学 号： 2006052211 学生姓名： 熊 威 指导教师： 罗 永 兰 教授 201

3、0 年6月 长沙学院毕业设计(论文) 摘 要利用枯草芽孢杆菌( bacillus subtilis )防治植物病害是目前植物病害生物防治的研究热点2-4。抗菌株ys45是一种柑橘内生菌，为一种枯草芽孢杆菌8，初步研究，对金色葡萄球菌、油菜菌核菌有较强的抑菌作用6。为了提高拮抗性菌株ys45发酵液中抑菌物质的产生量，我们必须优化ys45的发酵培养基和发酵条件。本实验分别以油菜菌核菌、金色葡萄球菌作为病原指示菌，通过单因子试验和正交试验确定拮抗性菌株ys45摇床水平的最佳发酵培养基：pda100 g/l，糖蜜15 g/l，nh4no31 g/l，feso40.2 g/l，k2hpo40.2 g/l

4、，caco3浓度8%。此结果为日后反应器水平研究及大规模生产奠定理论和实践基础。关键词：拮抗菌，金色葡萄球菌，油菜菌核菌，单因子法，正交法，纸碟 法abstractusing bacillus subtilis (bacillus subtilis) is the control of plant diseases plant disease biological control research focus 2-4. antagonistic strain ys45 is a citrus endophyte, as a bacillus subtilis 8, the primarily

5、study of antagonistic strains ys45 show that it belongs to bacillus subtilis, the fermentation products showed strong inhibition on rape sclerotium bacteria, staphylococcus aureus6. in order to improve the quantity of antibacterial substance produced in fermentation of antagonistic strains ys45. we

6、must optimize the ys45 of fermentation medium and fermentation conditions. in this study, sclerotia were to rape bacteria, staphylococcus aureus as a pathogen indicator bacteria, a single factor and orthogonal tests to determine the level of antagonistic strains ys45 shaker the best culture medium:

7、pda100 g / l, molasses 15 g / l, nh4no31 g / l, feso4 0.2 g / l, k2hpo40.2 g / l, caco3 concentrations of 8%. . this results in the future level of research reactors and large-scale production to lay the basis of the theory and practicekeywords:antagonistic bacteria, staphylococcus aureus, rape scle

8、rotium fungus, biological pesticides, single factor, orthogonal method, paper plates method目 录摘 要iabstractii第1章 前言1第2章 材料与方法32.1 实验材料及仪器设备32.1.1 实验材料32.1.2 仪器设备32.1.3 其他材料42.2 实验方法42.2.1 拮抗性菌株ys45摇床水平最佳发酵时间的确定42.2.1.3 实验菌种活化及种子扩大培养52.2.1.4 接种、培养62.2.1.5 无菌发酵液制备62.2.1.6无菌发酵液的抑菌效果62.2.2 单因子实验确定最佳c源72.

9、2.2.1 实验设计72.2.2.2 实验菌种活化及种子扩大培养72.2.2.3 试验用培养基的制作72.2.2.4 接种、培养72.2.2.5 无菌发酵液制备72.2.2.6无菌发酵液的抑菌效果72.2.3 单因子实验确定最佳n源72.2.3.1 实验设计82.2.3.2 实验菌种活化及扩大培养82.2.3.3 试验用培养基的制作82.2.3.4 接种、培养82.2.3.5 无菌发酵液制备82.2.3.6无菌发酵液的抑菌效果82.2.4 单因子实验确定最佳无机盐82.2.4.1 实验设计82.2.4.2实验菌种活化及种子扩大培养82.2.4.3 发酵培养基的制作82.2.4.4 接种、培养9

10、2.2.4.5 无菌发酵液制备92.2.4.6无菌发酵液的抑菌效果92.2.5 正交试验确定菌种最佳发酵培养基92.2.5.1 实验设计92.2.5.2 实验菌种活化及扩大培养102.2.5.3 试验用培养基的制作102.2.3.4 接种、培养112.2.3.5 无菌发酵液制备112.2.3.6无菌发酵液的抑菌效果11第3章 实验结果123.1 ys45最适发酵时间实验结果123.2单因子实验确定最佳c源实验结果133.3单因子实验确定最佳n源实验结果143.4单因子实验确定最佳无机盐实验结果153.5正交试验结果163.6试验数据处理17结 论19参考文献20致 谢22iv 长沙学院毕业设计

11、(论文) 第1章 前言一直以来化学农药防治病虫害对农业生产起了十分重要的作用，但由于化学农药的大量使用，却带来了很多负面作用，如污染环境、危害人畜、易产生抗药性，严重影响了人类健康和生态平衡。随着全球范围内研制开发高效低毒生防制剂的兴起，开发微生物制剂来控制有害生物，已经成为替代化学农药的新型环保防治措施，受到世界各国学者和企业的重视。利用拈抗微生物来防治植物病害成为了生物防治的一个主要内容，并已显示出良好的应用前景1。下面先来讲述下植物内生拮抗菌、的分离，筛选，鉴定等的研究概况和应用前景。内生细菌存在于健康植物体内，一些内生细菌具有促生长、抗病和固氮等生物学功能。其中能产生抗生素等抗性物质的

12、内生菌称为拮抗菌。目前对拮抗菌分离，筛选，鉴定的方法很多。这些方法主要有： 1.1采用化学药剂表面灭菌的方法，例如用此法从黑龙江省大豆品种合丰25的根、茎、叶和种子中分离到大量内生细菌，其种群数量在根部最多，在叶部次之，在茎部和种子中最少。从121株内生细菌中筛选到31株对大豆根腐病菌具有较强抑制作用的拮抗内生细菌，其中菌株tf28抑菌谱广，抑菌率高，对不同植物的病原菌e oxysporum 的抑菌率为802967。经形态、生理生化和16s rrna鉴定为解淀粉芽孢杆菌。1.2还有利用常规的分离方法-对峙法和平板涂布法。例如对大蒜鳞茎进行内生细菌的分离，对分离的内生菌进行拮抗试验研究，结果表明

13、：分离得到l9株内生细菌，其中1o株菌对2种以上植物病原真菌有不同程度的抑制作用。还有研究从棉花根际分离出4 028个细菌分离物，以棉花立枯病病原真菌立枯丝核菌为靶标菌，通过平板对峙法获得48个具有拮抗性能的分离物，其中mk48、mk49、mks0及mk51具有较强的拮抗性能，且拮抗性能稳定。1.3采用稀释平板法，例如在对棉花黄萎病的研究中从健康棉花根部土壤中分离得到细菌菌株1520株。通过室内平板多次筛选获得25株对棉花黄萎病菌具有强拮抗抗作用的细菌菌株4。拮抗菌效能测定和生产研究的方法主要是在实验室中采用单因素实验的方法和正交试验。例如为了对棉花黄萎病生物防治的进一步研究，筛选出一株编号1

14、247的对大丽轮枝菌具有拮抗作用的菌株并设计了该实验对其实验室发酵条件进行了摸索。目前拮抗菌的应用领域越来越广泛，如利用内生细菌进行植物保护，尤其是对植物土传病害的抑制作用报道较多，现已从棉花、橡树、马铃薯和蔬菜等多种作物体内分离筛选到对棉花黄萎病、橡树枯萎病、马铃薯软腐病、蔬菜立枯病等病害具有良好抑制效果的内生细菌6。利用拮抗菌防治植物病害已被认识和广泛应用，从自然界寻找和筛选新的生防菌对生物防治具有重大意义，特别是利用拮抗菌防治棉花立枯病已有了广阔的应用前景7。而近期对番茄，黄瓜的拮抗菌的研究也相当突出。试验结果表明，从黄瓜根际土壤中分离筛选的细菌ds一1和放线菌sg一126可显著提高黄瓜

15、植株对枯萎病的抗性，减少死株率，具有良好的防治效果，并且还能促进黄瓜的生长发育，进而提高产量，这在一定程度上说明两个拮抗菌作为生防菌利用的可能性。同样在对番茄灰霉病和青枯病的研究中，研究出用于控制番茄灰霉病的发生及危害的细菌有10多种，主要有芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、乳芽孢杆菌、短体芽孢杆菌、嗜麦芽黄单孢菌、假单孢杆菌、荧光假单孢菌等。拮抗菌的研究发展前景十分看好。应用也越来越广泛。主要在生物防治上作用显著。从土壤，动植物体等的中间筛选拮抗微生物来防治多种病害成为了备受人们关注的热点课题。目前生物防治被认为是最具有发展潜力的重要防治方法，而获得高效拮抗菌和使其的作用发

16、挥到最大是生物防治的基础。利用枯草芽孢杆菌( bacillus subtilis )防治植物病害就是目前植物病害生物防治的一个研究研究热点2-4。枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)是一种广泛分布于各种不同生活环境中的革兰氏阳性杆状细菌，可以产生内生芽孢，耐热抗逆性强，在土壤和植物的表面普遍存在，同时还是植物体内常见的一种内生菌，对人畜无毒无害，不污染环境。由于它生长速度快、营养需求简单，在植物的表面易于存活、定殖与繁殖，而且生产枯草芽孢杆菌制剂的工艺简单，制剂稳定，施用方便，储存期长，因此是一种理想的生防微生物。油菜菌核病是油菜生长上的主要病害，由油菜菌核菌所致，它从苗期到成熟

17、期，都可造成危害，尤以中后期发病最普遍，危害最严重。目前无高抗的品种，又无有效的化学药剂来防治5-6】。金色葡萄球菌(staphylococcus aureus)是医学和兽医临床常见的病原菌之一，其引起的感染在临床上十分多见，常引起人和动物组织器官脓肿、创伤、化脓甚至脓毒败血症以及食物中毒7。研究表明，拮抗性菌株ys45分类鉴定属于枯草芽孢杆菌8，其发酵产物对油菜菌核菌6、金色葡萄球菌均具有较强的抑制作用。如果将其开发成新型的生物农药，既能提高油菜的产量，增加经济效益，又能在环境保护、人畜健康、生物农药的产业化等方面产生良好的生态效益和社会效益。现在我们面临的是如何提高柑桔内生拮抗细菌发酵液的

18、防治效价等问题，因此对发酵培养基、发酵条件进行优化从而发酵液的防治效价是一个重要研究方向8。培养基的组成、浓度会影响到微生物的生长与代谢产物的积累。碳源和氮源是微生物细胞和代谢产物的重要营养物质，也是发酵培养基的重要组成部分。发酵培养基配方是影响微生物发酵的重要因素之一。大量研究结果表明：不同细菌对各种营养物质的需求量不同。细菌发酵所需的基本营养包括碳源、氮源、无机离子等。目前,生产上枯草芽孢杆菌的发酵培养基配方的主要成分有玉米粉、葡萄糖、豆饼粉、鱼粉以及其它一些微量元素9。发酵过程中各种原材料的质量都能影响培养基的质量。例如，我国东北产的大豆中含硫氨基酸的含量较高，所以加工制备的黄豆饼粉质量

19、较好10。葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖等为速效碳源；而糊精和可溶性淀粉需要经过菌体胞外酶水解成单糖后才能被菌体利用，为迟效碳源。而在细菌培养中，过多的速效碳源会加速菌体呼吸，消耗过多氧气而不利于菌体生长；同时它会产生一些酸性中间代谢产物，降低ph值影响细菌生长和产生抑菌物质；另外，过多的速效碳源会使菌体代谢过快，使细菌后续生长缺乏营养11。为了改善细菌的生长条件,提高发酵液目的产物含量，就必须调整出培养基中各物质的最佳配比。另外，微生物在不同的生长阶段、不同目的产物的生产时期等，对环境条件可能会有不同的要求，所以应加强对这一方面的研究。这样，研究制定菌株的生长曲线（包括迟缓期，对数期，稳定期，衰

20、亡期）是非常重要的，也是非常必要的12。本实验分别以油菜菌核菌、金色葡萄球菌作为病原指示菌，得出不同单因素（缓效碳源、速效碳源、氮源、无机盐）对拮抗菌株ys45的发酵产物的抑菌效果的影响为依据，通过摇瓶培养确定拮抗性菌株ys45发酵培养基。在优化筛选过程中，首先对缓效碳源、速效碳源、氮源、无机盐进行单因子研究13，根据单因子实验结果，按照正交实验设计进行正交实验，确定其最佳发酵培养基，为该菌株的进一步研究与开发应用奠定了基础，也为日后的反应器水平研究和将来大规模生产奠定理论和实验基础。第2章 材料与方法2.1 实验材料及仪器设备2.1.1 实验材料实验菌种：拮抗性菌株ys45：柑橘内生细菌，长

21、沙学院生物技术研究所提供。 金色葡萄球菌：中国兽药检验所提供。培养基：pda液体培养基 配方：土豆200g，蔗糖20g，水1000ml pda固体培养基 配方：土豆200g，蔗糖20g，琼脂15-20g，水1000ml 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15-20g， 水1000ml，ph7.0-7.2。 2.1.2 仪器设备电子天平（shimadzu生产,型号为ay220,功能主要是在配置培养基时进行药品等的质量称量。）电子炉（北京市永光明医疗仪器厂生产，型号为dl-1,作用是在制作发酵培养基，pda培养基和牛肉膏蛋白胨培养基等时进行加热，使得各种成分能充分混合溶

22、解，制成培养基。）超纯水系统（颐洋企业发展有限公司生产，型号为艾科浦超纯水系统，作用是供应超纯水，去离子水等，为某些特殊仪器洗涤和无菌水制作还有培养基制作等操作提供适合的水作为原料。）电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司生产，型号为dhg-9140a，作用主要是对清洗过得仪器设备进行快速的烘干干燥处理。）高压蒸汽灭菌锅（tomy生产，型号为es315，主要是对实验设备器材以及培养基等进行高温灭菌操作。）微波炉（格兰仕生产，型号为机械型wp750l23-6，在本实验中主要的作用是对已冷却的培养基进行加热溶解操作。）超净工作台（由苏净集团安泰公司制造，型号为sw-cj-1f，主要是进行无菌

23、实验操作。）生化培养箱（广东省医疗器械厂生产，型号为微电脑控制lrh-190，对实验菌等进行活化培养和在控制的适宜条件下培养的仪器。）冰箱（siemens制造，型号为kk29e18ti，在本实验中的主要作用是对实验用到的多种菌种进行低温保藏。）精密ph计（雷磁公司生产，型号为phs-3c，作用是调节发酵液培养基到要求的ph值。）摇床（zhcheng生产，型号为zhwy200b,作用是对研究的菌种进行发酵液体培养。）旋转蒸发仪（上海嘉鹏科技有限公司制造，型号为re-52aaa,在本实验中的主要作用是对发酵菌液进行浓缩。）循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂生产，型号为shz-d,作用是抽真空，与

24、旋转蒸发仪配合进行使得需要浓缩的液体能在低的温度下沸腾蒸发获得浓缩。）高速冷冻离心机（湘仪离心机厂生产，型号为gl-21m，在本实验中的作用主要是对浓缩后的发酵菌液进行离心除去菌体等沉淀。）打孔器（选取直径9mm的打孔器，作用是制备直径9mm的圆形纸碟。）移液枪（dragon-med制造，型号为ds87114的100-1000ul和0-100ul，作用是精确的吸取定量液体进行移液操作。）游标卡尺（上海三圈量具工具有限公司，型号是0-150mm，作用是对抑菌圈的直径大小进行测量。）2.1.3 其他材料 土豆、糖蜜、工业酒精、硝酸铵nh4no3、硫酸亚铁feso4(上海试一化学试剂有限公司)、磷酸

25、氢二钾k2hpo4(国药集团化学试剂有限公司)、氯化钠nacl（湖南汇红试剂有限公司）、碳酸钙caco3(上海实验试剂有限公司)、蔗糖（国药集团化学试剂有限公司）、琼脂（北京鼎国生物科技有限责任公司）、牛肉膏（上海源聚生物科技有限公司）、蛋白胨（上海中洋海洋生物工程股份有限公司东海制药厂）2.2 实验方法2.2.1 拮抗性菌株ys45摇床水平最佳发酵时间的确定ys45进行发酵培养，定时取样，分别测定发酵液对金色葡萄球菌、油菜菌核菌的抑菌作用，以确定ys45的最适发酵时间。2.2.1.1 实验设计设12个不同的发酵时间的处理， 即0h，1h，2h，4h，8h，12h，16h，20h，24h，28

26、h，32h，36h。2.2.1.2 实验培养基的准备pda液体培养基：按照2.1.1的配方，称取所需物质，将土豆煮沸半小时后，过滤掉残渣，在过滤的液体中加入蔗糖并搅拌使其溶解，然后再定容到相应的体积。在12个250ml锥形瓶中分别装入45ml配好的pda培养基作为发酵培养基，在1个250ml的锥形瓶中加入100ml配好的pda培养基作为扩大培养基，封口后高压蒸气锅灭菌30min，作为发酵培养基备用。pda固体试管斜面培养基：按照2.1.1的配方，称取所需物质，将土豆煮沸半小时后，过滤掉残渣，在过滤的液体中加入蔗糖并搅拌使其溶解，然后边加琼脂边迅速搅拌，直到琼脂完全溶解后再定容。将配制好的培养基

27、装入10ml试管（约3ml每支），用棉塞塞好。然后用牛皮纸捆好（5支1捆），高压蒸汽锅灭菌30min。灭菌完毕后，在培养基未开始凝固前搁置斜面。pda固体平板培养基：严格按照无菌操作要求，在超净工作台中，将配制好未凝固的培养基倒入无菌培养皿中备用。牛肉膏蛋白胨固体试管斜面培养基：牛肉膏蛋白胨培养基的配置：按照2.1.1的配方，称取所需物质，等牛肉膏，蛋白胨和氯化钠都溶解后，再加入琼脂（边加边迅速搅拌），然后定容到相应体积后立即将ph调为7.0-7.2。将配制好的培养基装入10ml试管（约3ml每支），用棉塞塞好。然后用牛皮纸捆好（5支1捆），高压蒸汽锅灭菌30min。灭菌完毕后，在培养基未开始

28、凝固前搁置斜面。牛肉膏蛋白胨平板培养基：严格按照无菌操作要求，在超净工作台中，将配制好未凝固的培养基倒入无菌培养皿中备用。2.2.1.3 实验菌种活化及种子扩大培养 ys45菌种的活化： 严格按照无菌操作，在超净工作台中，用无菌吸管吸03-05毫升无菌水滴入安培管，轻轻震荡使冻干菌体溶解成悬浮状，将接种环烧红后伸入安培管，待接种环冷却后，沾取少量ys45菌种，接种于斜面试管培养基上，一共活化10支，放入28c恒温生化培养箱中培养12h16。 ys45种子的扩大培养：严格按照无菌操作，在超净工作台中，用移液枪从100mlpda培养液中取5ml放入1支ys45菌种的试管中，然后用接种环将斜面上的菌

29、种刮落，再将含有菌种的培养液倒回锥形瓶中。迅速封口，然后摇床培养12小时。（振动频率150次/分钟，27） 金色葡萄球菌的活化：严格按照无菌操作，在超净工作台中，用接种环在斜面试管培养基上挑取少量菌种，然后接种于新制的斜面试管培养基上，封口后高温灭菌备用。油菜菌核菌的活化：严格按照无菌操作，在超净工作台中，用接种环在平板培养基上挑取油菜菌核菌的菌种，接种于新制的pda平板培养基上（每个培养基上接种6小块菌种）。2.2.1.4 接种、培养严格按照无菌操作，在超净工作台中，将扩大培养的种子液按照10%的接种量接入发酵培养基中，即5ml每瓶，共接种12瓶，然后分别按照不同的发酵时间摇床培养（振动频率

30、150次/分钟，27）。2.2.1.5 无菌发酵液制备发酵液浓缩：将ys45进行发酵培养，定时取样，分别测定发酵液对金色葡萄球菌、油菜菌核菌的抑菌作用，以确定ys45的最适发酵时间。发酵液离心：将浓缩液进行梯度离心4次，即10ml-7ml-5ml-3ml-1ml，最后1ml为无菌发酵液，在4c冰箱中保存备用。离心条件为：离心机转速12000r min ，离心时间30min，离心温度 4c。2.2.1.6无菌发酵液的抑菌效果将各组无菌发酵液采用纸碟法测定其对金色葡萄球菌和油菜菌核菌的抑菌效果。各组无菌发酵液重复3次，以新鲜培养基为对照。具体方法如下：金色葡萄球菌 用打孔器将滤纸打成10mm的圆形

31、纸碟，用培养皿包好，高压蒸汽灭菌30min后备配制固体牛肉膏蛋白胨培养基，趁热加入锥形瓶，封口后高压蒸汽灭菌30分钟后备用严格按照无菌操作要求，在超净工作台中将液态牛肉膏蛋白胨培养基倒入空白的无菌培养皿中严格按照无菌操作要求，在超净工作台中在金黄色葡萄球菌菌种试管中加入5ml无菌水，用接种环搅拌，将含有金色葡萄球菌的悬液装入无菌离心管中严格按照无菌操作要求，在超净工作台中往牛肉膏平板培养基上滴加0.2ml金色葡萄球菌悬液，用三角棒涂布均匀严格按照无菌操作要求，在超净工作台中，中镊子将纸碟放入涂布好菌悬液的培养皿的正中央严格按照无菌操作要求，在超净工作台中，用移液枪将20ul无菌发酵液滴加到纸碟

32、上用封口膜将培养皿封好，待无菌发酵液渗入培养基后倒置恒温培养用游标卡尺对所有实验产生的抑菌圈的直径大小进行测量比较并记录数据。油菜菌核菌 用打孔器将滤纸打成9mm的圆形纸碟，用培养皿包好，高压蒸汽灭菌30min后备用严格按照无菌操作要求，在超净工作台中将液态pda固体培养基倒入空白的无菌培养皿中严格按照无菌操作要求，在超净工作台中，用镊子将无菌纸碟置于刚接种油菜菌核菌的平板培养基的正中间严格按照无菌操作要求，在超净工作台中，用移液枪将20ul无菌发酵液滴加到纸碟上用封口膜将培养皿封好，待无菌发酵液渗入培养基后倒置恒温培养用游标卡尺对所有实验产生的抑菌圈的直径大小进行测量比较并记录数据2.2.2

33、 单因子实验确定最佳c源将ys45接种于不同c源的发酵培养基中发酵培养，培养时间为2.2.2所确定的时间，根据采用不同c源发酵培养所得的无菌发酵液对金色葡萄球菌和油菜菌核菌的抑菌作用筛选最佳c源。2.2.2.1 实验设计实验设8种不同c源处理和两个空白对照。即在普通pda培养基中分别加入糖蜜，甘油，蔗糖，麦芽糖，牛肉膏，淀粉，葡萄糖，甘露醇,均为10g每升。2.2.2.2 实验菌种活化及种子扩大培养同2.2.1.22.2.2.3 试验用培养基的制作按2.2.2.1实验设计，配置发酵培养基10瓶（方法同2.2.1.2），45ml/瓶，在8个试验处理的锥形瓶中分别加入相应量的c源，即0.5g，然后

34、用量筒量取45mlpda液体培养基加入，用分口膜封口后做好标记，121高压蒸汽灭菌30分钟后备用。2.2.2.4 接种、培养严格按照无菌操作，在超净工作台中，将扩大培养的种子液按照10%的接种量接入发酵培养基中，即5ml每瓶，接种后置于150次/分钟，27、的摇床内培养28小时。2.2.2.5 无菌发酵液制备同2.2.1.52.2.2.6无菌发酵液的抑菌效果同2.2.1.62.2.3 单因子实验确定最佳n源将ys45分别接种于不同n源的发酵培养基中培养，培养时间为2.2.2所确定的时间，根据不同n源的发酵液对金色葡萄球菌和油菜菌核菌的抑菌作用筛选种子最佳n源。2.2.3.1 实验设计实验设8个

35、处理和两个空白对照，即在普通pda培养基中分别加入蚕粉，豆粕，蛋白胨，酵母膏，硫酸铵，硝酸铵，尿素，鱼粉，均为3g/l。2.2.3.2 实验菌种活化及扩大培养同2.2.1.2。2.2.3.3 试验用培养基的制作按2.2.3.1实验设计，配置发酵培养基10瓶（方法同2.2.1.2），45ml/瓶，在8个试验处理的锥形瓶中分别加入相应量的n源，即 然后用量筒量取45mlpda液体培养基加入，用分口膜封口后做好标记，121高压蒸汽灭菌30分钟后备用。2.2.3.4 接种、培养 严格按照无菌操作，在超净工作台中，将扩大培养的种子液按照10%的接种量接入发酵培养基中，即5ml每瓶，接种后置于125次/分

36、钟，27的摇床内培养28小时。2.2.3.5 无菌发酵液制备同2.2.1.52.2.3.6无菌发酵液的抑菌效果同2.2.1.62.2.4 单因子实验确定最佳无机盐将ys45分别接种量接种于不同无机盐的发酵培养基发酵培养，培养时间为2.2.2所确定的时间，根据不同无机盐的发酵液对金色葡萄球菌和油菜菌核菌的抑菌效果，筛选最佳无机盐。2.2.4.1 实验设计实验设7个处理和1个空白对照，即在普通pda培养基中分别加入磷酸氢二钾，硫酸亚铁，氯化铁，硫酸镁，磷酸氢二钠，碳酸钙，磷酸氢铵。2.2.4.2实验菌种活化及种子扩大培养同2.2.1.2。2.2.4.3 发酵培养基的制作按2.2.4.1实验设计，配

37、置发酵培养基8瓶，45ml/瓶，分别在7个试验处理的锥形瓶中加入不同的无机盐，即磷酸氢二钾0.15g/l，硫酸亚铁0.15g/l,氯化铁0.01g/l，硫酸镁0.05g/l，磷酸氢二钠0.15g/l，碳酸钙0.2/l，磷酸氢铵0.15g/l15-17，用封口膜封口后作好标记，121高压蒸汽灭菌30分钟后备用。2.2.4.4 接种、培养严格按照无菌操作，在超净工作台中，将扩大培养的种子液按照10%的接种量接入发酵培养基中，即5ml每瓶，接种后置于150次/分钟，27的摇床内培养28小时。 2.2.4.5 无菌发酵液制备同2.2.1.52.2.4.6无菌发酵液的抑菌效果同2.2.1.62.2.5

38、正交试验确定菌种最佳发酵培养基 因为当每个单因子采用不同浓度组合时会产生不同的实验效果，所以要进行正交实验，将每个单因子的各种浓度全面的组合，找出最优的水平组合，筛选出最佳的发酵培养基。通过前面单因子试验的结果，本实验采用4因素3水平或5因素4水平或6因素5水平的正交方案。2.2.5.1 实验设计 表1 6因子5水平设计方案单因子水平abcded（1）（2）（3）（4）（5）表2 正交表试验实验设计方案pda糖蜜硝酸铵磷酸氢二钾硫酸亚铁碳酸钙12345678910111213141516171819202122232425k1k2k3k4k5（1）（1）（1）（1）（1）（2）（2）（2）（2

39、）（2）（3）（3）（3）（3）（3）（4）（4）（4）（4）（4）（5）（5）（5）（5）（5）1+2+3+4+56+7+8+9+1011+12+13+14+1516+17+18+19+2021+22+23+24+25（1）（2）（3）（4）（5）（1）（2）（3）（4）（5）（1）（2）（3）（4）（5）（1）（2）（3）（4）（5）（1）（2）（3）（4）（5）1+6+11+16+212+7+12+17+223+8+13+18+234+9+14+19+245+10+15+20+25（1）（2）（3）（4）（5）（2）（3）（4）（5）（1）（3）（4）（5）（1）（2）（4）（5）（1）

40、（2）（3）（5）（1）（2）（3）（4）1+10+14+18+222+6+15+19+233+7+11+20+244+8+12+16+255+9+13+17+21（1）（2）（3）（4）（5）（3）（4）（5）（1）（2）（4）（5）（1）（2）（3）（5）（1）（2）（3）（4）（1）（2）（3）（4）（5）1+9+13+17+212+10+14+18+223+6+15+19+234+7+11+20+245+8+12+16+25（1）（2）（3）（4）（5）（4）（5）（1）（2）（3）（5）（1）（2）（3）（4）（1）（2）（3）（4）（5）（2）（3）（4）（5）（1）1+8+12+

41、16+252+9+13+17+213+10+14+18+224+6+15+19+235+7+11+20+24（1）（2）（3）（4）（5）（5）（1）（2）（3）（4）（1）（2）（3）（4）（5）（2）（3）（4）（5）（1）（3）（4）（5）（1）（2）1+7+11+20+242+8+12+16+253+9+13+17+214+10+14+18+225+6+15+19+232.2.5.2 实验菌种活化及扩大培养同2.2.1.2。2.2.5.3 试验用培养基的制作按2.2.3.1实验设计，配置发酵培养基25瓶，50ml/瓶，在25个试验处理的锥形瓶中分别加入相应量的所有单因子，然后加纯水定容

42、到50ml，用分口膜封口后做好标记，121高压蒸汽灭菌30分钟后备用。2.2.3.4 接种、培养在种子扩大培养过程中，按实验设计，定时取种子接种，每次接一瓶5ml/瓶，接种后置于27、150次/分钟的摇床内培养28小时。2.2.3.5 无菌发酵液制备同2.2.1.52.2.3.6无菌发酵液的抑菌效果同2.2.1.6第3章 实验结果3.1 ys45最适发酵时间的确定实验结果ys45不同发酵温度的发酵液对金色葡萄球菌和油菜菌核菌的抑菌效果见表3及图1。从中可以比较看出温度为28h时的抑菌圈直径平均值是22.94mm,此时的抑菌圈比任何其他发酵培养温度的直径都大，抑菌圈大小，28h32362420。

43、说明培养28小时产生的发酵液抑菌效果最好，因此表3结果表明：发酵时间为28h时的发酵液对金黄色葡萄球菌和油菜菌核菌的抑制效果最好。表3 不同发酵时间的发酵液对金色葡萄球菌、油菜菌核菌抑菌效果发酵时间金色葡萄球菌（抑菌圈直径mm）油菜菌核菌（抑菌圈直径mm）平均平均010.4110.4010.4110.41 10.0010.0010.0010.00 110.2211.6610.8610.91 10.0810.2010.2210.17 210.7410.5610.8010.70 10.4010.2410.8010.48 410.8410.6610.6610.72 10.8610.7611.0010

44、.87 822.6423.0422.6022.76 11.2010.8812.3411.47 1223.1222.2622.8622.75 11.2613.2012.0212.16 1624.923.9821.8423.57 12.9812.6212.0812.56 2026.6226.3625.0226.00 12.4012.3212.0212.25 2427.7426.7827.2227.25 14.0614.3012.9813.78 2831.1230.3429.730.39 15.9215.8816.4016.07 3229.4828.3828.3228.73 15.54142815.

45、4415.09 3629.1228.3428.6828.71 14.2414.9815.6014.94 051015202530350h1h2h4h8h12h16h20h24h28h32h36h金色葡萄球菌抑菌圈大小（mm）油菜菌核菌抑菌圈大小（mm） 图1.不同发酵时间的发酵液对金色葡萄球菌、油菜菌核菌抑菌效果柱形图3.2单因子实验确定最佳c源实验结果ys45不同c源的发酵液对金色葡萄球菌和油菜菌核菌的抑菌效果见表4及图2。从中可以比较看出在pda培养基中添加糖蜜的发酵液的抑菌圈直径平均值均为33.01mm和22.18mm,此时的抑菌圈比任何其他发酵ph值培养时的直径都大，说明以糖蜜作为c源

46、的发酵液抑菌效果最好，因此表4结果表明：以糖蜜作为c源的发酵液对金黄色葡萄球菌和油菜菌核菌的抑制效果最好。表4 不同c源发酵液对金色葡萄球菌、油菜菌核菌抑菌效果c源金色葡萄球菌（抑菌圈直径mm）油菜菌核菌（抑菌圈直径mm）平均平均糖蜜34.6832.7631.6233.01 21.0419.9625.6222.18 甘油20.8620.220.720.59 12.1211.4211.6411.72 蔗糖21.321.9821.521.59 12.0213.9812.5212.84 麦芽糖23.3221.9222.2222.41 14.7614.3212.9813.59 牛肉膏23.423.36

47、23.9423.57 13.4616.8415.3215.21 淀粉16.6217.5419.8417.97 11.0611.511.2211.26 葡萄糖21.6821.6621.4621.60 13.0012.2411.5412.26 甘露醇22.4423.3433.8426.54 11.0410.811.0210.95 空白22.0222.2421.6821.87 11.7611.2611.4811.50 空白27.7226.0827.0826.96 15.1211.511.1412.59 图2.不同c源发酵液对金色葡萄球菌、油菜菌核菌抑菌效果柱形图3.3单因子实验确定最佳n源实验结果y

48、s45采用不同n源发酵的发酵液对金色葡萄球菌和油菜菌核菌的抑菌效果见表5及图3。从中可以比较看出以硝酸铵作为n源进行发酵时的抑菌圈直径平均值分别为32.27mm和17.47mm,这时的抑菌圈直径比其他n源的发酵液的抑菌圈都大，说明以硝酸铵作为n源发酵培养产生的发酵液抑菌效果最好，因此表3结果表明：以硝酸铵作为n源的发酵液对金黄色葡萄球菌和油菜菌核菌的抑制效果最好。表5 不同c源发酵液对金色葡萄球菌、油菜菌核菌抑菌效果n源金色葡萄球菌（抑菌圈直径mm）油菜菌核菌（抑菌圈直径mm）平均平均蚕粉31.30 32.20 24.66 29.39 16.74 15.02 15.50 15.75 豆粕28.

49、98 28.02 29.20 28.73 13.78 12.06 12.52 12.79 蛋白胨27.60 29.70 27.30 28.20 17.50 10.00 24.42 17.31 酵母膏29.92 30.50 30.70 30.37 10.00 12.58 10.82 11.13 硫酸铵29.62 30.46 27.50 29.19 10.00 10.00 10.00 10.00 硝酸铵32.34 32.30 32.16 32.27 17.40 16.89 18.12 17.47 尿素23.98 34.22 28.34 28.85 10.00 11.88 10.oo10.94 鱼粉

50、29.44 28.56 28.22 28.74 10.76 10.58 10.86 10.73 空白34.30 31.10 29.62 31.67 12.02 12.90 12.82 12.58 空白28.20 33.02 32.82 31.35 12.26 13.58 12.84 12.89 图3.不同n源发酵液对金色葡萄球菌、油菜菌核菌抑菌效果柱形图3.4单因子实验确定最佳无机盐实验结果ys45不同添加不同无机盐发酵的发酵液对金色葡萄球菌和油菜菌核菌的抑菌效果见表6及图4。从中可以比较看出以磷酸氢二钾，硫酸亚铁和碳酸钙作为无机盐进行发酵发酵液产生的抑菌圈直径平均值分别为32.93mm,31.84m