植物开放式组织培养的研究进展

1、植物开放式组织培养的研究进展安徽农业科学.journalofanhuiagri.sci.2010,38(26):142811428314288责任编辑章炼红责任校对况玲玲植物开放式组织培养的研究进展张慎,郭陶然,邓志瑞,黄俊逸,.(1.江苏盐城生物工程高等职业技术学校,江苏盐城224731;2.上海大学生命科学学院,上海200444;3.上海市能源作物育种与应用重点实验室,上海200444)摘要由植物组织培养技术的形成过程入手,首次提出了植物开放式组织培养发展的3个阶段,即探索阶段,奠基阶段和快速发展阶段,并分别加以概述,最后对未来开放式组织培养技术的发展方向进行了多方面的前景展望.关键词植物

2、,开放式组织培养,抗生素,无糖培养中图分类号q813.1+2文献标识码a文章编号05176611(2010)2614281一o3researchprogressofopen-styleplantculturesystemzhangshenetal(yanehengbiologyengineerhighschoolofjiangsu,yancheng,jiangsu224731)abstractfromtheformingprocessofplanttissueculturesystem,threedevelopingstagesofopenstyletissueculturewereprese

3、ntedforthefirsttime,theyareexplorationstage,foundationstageandrapidgrowthstage,andtheyweresummarizedrespectively.finally,thedevelopmentdirectionofopenstyletissuecultureinthefuturewasprospected.keywordsplant;tissuecultureofopenstyle;antibiotics;sugarfreemicropropagation被誉为植物组培之父的德国着名的植物生理学家和植物学家haber

4、landt在schleiden和schwann的细胞学说的推动下,于1902年提出了植物细胞具有全能性的理论之后,各国科学家经过近百年的辛勤探索,最终发现,几乎所有植物的根,茎,叶,花,果实和种子等不同器官,组织和细胞均成功实现了离体培养,并发育成新的植株.如1904年hanning通过培养萝卜和辣根菜的胚获得成功;1912年,kotte和robins在根尖培养中获得了组织培养的成功;1925和1929年,laibach分别在亚麻种间杂种胚培养中获得成功,证明胚培养可应用于植物远缘杂交;1934年,white由番茄根在世界上建立了第1个活跃生长的无性繁殖系,并于1937年建立了第1个组织培养的

5、综合培养基(white培养基);1958年,美国植物学家steward等用胡萝卜根韧皮部的细胞进行培养,得到了能够开花结实的完整植株,首次证实了habellandt在5o多年前关于细胞全能性的预言;1960年,morel提出了1个茎尖离体无性繁殖兰花的方法,由此在全世界迅速建立起兰花工业;1964年,guha等成功地在毛叶曼陀罗花药培养中,由花粉诱导得到单倍体植株j,从而促进了花药和花粉培养的研究.之后,花药培养相继在烟草,水稻,小麦,玉米,番茄,辣椒,草莓,苹果等160多种植物培养中获得成功.而这些成功都归因于植物组织培养技术的建立.然而,由于这种组培技术对无菌环境有严格要求,导致生产成本大

6、大升高,例如需要无菌操作台或生物安全柜,高压灭菌锅等配套措施,且价格昂贵,使其应用范围受到极大的限制,不利于在常规农业生产中推广与普及.另外,以该技术为基础的各项科研工作亦受到一定程度的影响.因此,防止污染成了组培研究中不可或缺的主要工作.为此,众多的学者们采取各种方式在防止污染而又不影响培养物的生长方面进行了大量的研究.随着研究的不断深入,植物开放式组织培养的概念被提基金项目作者简介收稿日期上海大学大学生创新项目(b.05-0112-09-903).张慎(1970一),男,安徽六安人,讲师,从事农业,蚕桑教学与科研工作.通讯作者,副教授.2olo5-2o了出来.依据作者们对开放式组培的认识与

7、理解,该研究对开放式组培的探索阶段,奠基阶段和快速发展阶段进行了介绍,并对未来开放式组培的发展方向提出了新的看法.1开放式植物组织培养的探索开放式植物组织培养是在传统组织培养的基础上,为了解决污染问题而逐渐发展起来的.它的探索阶段主要包括:降低培养基中糖含量;去除部分有机成分和无糖培养3个方面的尝试.1.1降低培养基糖含量传统组培常常选择蔗糖等糖类物质作为碳源.由于培养基糖浓度(3%)较高,为微生物的生长繁殖创造了有利条件,导致一旦有细菌或孢子进入培养器皿中,就会迅速增殖,夺取养分与氧气,并进一步感染培养物,从而宣告培养的失败.因此降低培养基中的糖浓度会在一定程度上抑制微生物的增殖,降低污染率

8、.王秋洁等的研究表明,对于大花蕙兰而言,适当降低糖浓度还有利于原球茎的增殖与分化.此外,降低糖浓度还能够阻碍乙烯的生物合成,并提高试管苗移栽成活率.但对于大多数植物来说,降低糖浓度会导致培养物的生长速度缓慢,使植株生长瘦弱,因此近年来该方法应用不甚广泛.1.2去除部分有机物降低污染率的另一种方法是去除培养基中的部分有机物使某些微生物的生长受抑制.宋锋惠等在阿月浑子组织培养中用除去有机成分(保留肌醇)的ms培养基上接种被污染的丛生芽,结果丛生芽能正常生长,细菌数量逐渐减少.其原因是vb,vb和烟酸等有机成分都是某些细菌生长的必需物质,除去这些物质后,细菌无法正常生长发育,从而逐渐减少或死亡.这种

9、方法减少了试管苗的污染,取得了较好的效果,为在组培快繁中有效地控制污染找到了一条新的途径.然而,维生素在一般植物正常生理活动中却起着很重要的作用.如在ms培养基中添加适量维生素vb有利于小麦幼胚胚性愈伤组织的发生,同时对促进小麦幼胚愈伤组织的分化也有显着影响.所以该方法只适用于一些特定的品种.1.3无糖培养植物组织的无糖培养,即是在培养基中不加糖,以co作为碳源,采用环境控制手段,增加试管苗培养过程中的光照和co,浓度,促使植株加强自身的光合作用,14282安徽农业科学2010盎并利用容器内小植株具有的光合自养能力而培养植株的一种方式.它是在20世纪80年代末由日本千叶大学教授古在丰树提出.自

10、从无糖组培的理念提出后,各国学者们对此进行了相当深入的研究.肖玉兰等将非洲菊增殖苗转接到无糖的ms和hoagland培养基上7d后,生根率达57.1%和60.5%,而有糖的仅为4.8%,差异极为显着.这表明无糖培养可以促进植株尽早生根,且生根率高.如果在无糖组培中添加适量的谷氨酸促进叶绿素合成,还有利于提高光合效率,使得植株干重明显升高.刘立秋等的研究表明,在毛白杨增殖培养阶段,必须在培养基中加入适量的外源糖分才能完成其形态建成过程,补充c0只能作为组培过程的辅助手段,有利于培养壮苗.但李晓龄等以梨的幼嫩枝条作为外植体进行无糖培养20d后的结果表明,增值率仅为39.3%,比对照组(1.0%糖,

11、3.o%糖)分别降低7.4%和66.8%在植物组培生产中,如何减少试管苗的污染和提高过渡苗的成活率,进而降低生产成本,提高产品的质量和数量,以获得良好的经济效益,一直是亟待解决的问题.无糖培养方法的优点在于:降低污染率,减少了因污染引起的植物损失;植株生长速度快,生长发育均匀,品质好,缩短了培养周期,提高了过渡苗的成活率以及商品苗的质量和产量;培养成分集中并浓缩于设备之中,对专业要求降低,生产成本降低,劳动强度减少,更利于植物组培的工厂化,规模化生产.然而,该方法要求植物组织必须含有一定的叶绿素.另外,该方法所要求的培养环境迥异于传统培养方式,在前期设备上需要一定的投入,因此对于一些目前尚不适

12、应该培养方法的植物种类,仍需进行更深入的研究.但笔者相信,随着无糖培养技术的成熟,这种培养方式将会有广阔的发展前景.2抗生素的广泛使用2.1培养物表面消毒在接种时用抗生素溶液浸泡培养物有助于减少接种感染率.reuveni等先用300mg/l的利福平溶液预处理从温室中采下的番木瓜侧芽,再按常规顺序进行表面消毒,有效减少了外植体污染,且对番木瓜的生长无毒副作用.李颖等用多菌灵和青霉素浸泡处理已被污染的银白杨,四倍体刺槐,微型月季和地被菊的组培苗茎段,结果发现,多菌灵能有效杀灭真菌,而青霉素只在初代培养时起抑制细菌作用;在浸泡后接种的第1代,其生长势优良,分化能力较强,生长较健壮;生根培养时,根系较

13、发达,但移栽成活率不高.笔者在接种文心兰花梗芽时在常规消毒外辅以多菌灵浸泡,短期内亦获得较好效果.2.2抑制内生细菌一些植物体内含有内生菌,在组培过程中会逐渐增殖引起污染.内生菌难以通过常规消毒杀灭,因此常常采用抗生素来处理此类问题.在马蹄莲组织培养中,当快速繁殖至45代时,添加200mg/l的青霉素gk,能有效抑制内生菌的生长,且不影响繁殖系数.朱广廉对相思树的芽和茎段进行灭菌时,在先用皂液刷洗和乙醇杀菌后,将外植体转入0.2%benlete(一种杀真菌剂)和0.2%链霉素溶液中,于25,100r/min的摇床上振荡(16h),然后再用80%乙醇和0.1%hgci,分别杀菌1和15min,获

14、得了理想的灭菌效果.王梅等通过几种常用抗生素对草莓章姬内生菌的抑制效果的研究表明,青霉素对内生菌的抑制效果最好,且对植株的生长有明显促进作用.陈娟等对生姜茎尖组织培养和污染率控制的研究中发现,将表面消毒与抗生素浸泡处理相结合,能有效降低污染率.2.3在培养基中添加抗生素在培养基中添加抗生素的抑菌效果较为理想,即使接种时有少量微生物落入也不易引起污染.许婉芳等研究了抗生素在金线莲组织培养中的抗污染作用,结果表明,抗生素混合处理比单一处理效果好.王春在马铃薯组织培养中试验了4种抗生素的抑菌效果.结果表明,培养基添加20mg/l氨苄西林钠或硫酸链霉素时,能有效抑制品种大西洋试管苗的细菌性侵染,提高试

15、管苗的生长势,缩短其繁殖周期,加快其繁殖速度.胡静等研究了抗生素对甘农3号紫花苜蓿愈伤组织的生长和体细胞胚分化的影响,结果发现,羧苄青霉素为适宜抑菌剂,其愈伤诱导阶段的适宜浓度为300mg/l,体胚形成及芽诱导分化阶段的适宜浓度为200mg/l.杨国会等在虎眼万年青组织培养中研究抗生素抑菌作用时发现,青霉素在浓度为20mg/l时,无论是在抑制细菌,真菌还是在诱导率方面均优于其他不同浓度的几种抗生素,并且可以应用于花卉的快繁.尽管在培养基中添加抗生素或数种抗生素的混合使用对微生物的生长起到良好的抑制作用,但也有不少的负面影响.具体表现在以下几个方面:难以对所有菌种产生有效的抑制作用;微生物易产生

16、抗药性;抗生素的药效维持时间相对较短;可能对培养物产生药害及难以预料的生长调控.如在大白菜形态发生过程中,氨苄青霉素对根和芽的分化有显着的促进作用,卡那霉素则严重抑制根和芽的形态发生,噻孢霉素则强烈抑制根和芽的再分化,并有推迟芽和根形态发生的作用;羧苄青霉素对根和芽的分化无明显抑制作用,而羧苄青霉素和氨苄青霉素则也有缩短再分化进程的作用.因此,在实际应用中仍有许多问题有待解决.总之,降低培养基糖含量和去除部分有机物的引旨为开放式组织培养的开展奠定了一定基础,而抗生素使用的成功,为植物开放式组织培养的发展打开了大门,并奠定了坚实的基础.3开放式组培的快速发展由于传统植物组培的方法价格昂贵,对无菌

17、环境要求较高,因而不利于技术的推广与普及.随着抗生素在植物组织培养中抑菌试验的成功,科研工作者开始尝试开放式植物组织培养方式.自1994年以来,崔刚,单文修等围绕杀菌剂的研制和使用,简化组培环节,降低组培成本,建立了一套完整可行的开放式组织培养模式(简称开放式组培),并在几十种植物组培上获得了成功.在此期间,李江等对植物组织培养的各个环节可能降低成本和简化操作步骤等进行了归纳与总结.随着开放式组培体系的提出,众多专家对不同植物开放式组培的方法进行了探讨.崔刚等从多种植物中提取具有杀菌,抗菌的活性物质,成功研制出具有广谱性杀菌能力的抗菌剂,并成功建立了葡萄外植体的开放式组养体系,使葡萄外植体的成

18、功率达到95%以上,所获外38卷26期张慎等植物开放式组织培养的研究进展14283植体均分化正常.张薪薪等采用平板生长抑制法,菌丝生长速率法和孢子萌发试验法检测了几种抑菌剂对植物组织培养中常见细菌和真菌的抑菌作用,结果表明,y1.1的抑菌作用最具广谱性,62.5mg/l的yi一1对马铃薯试管苗生根,分化及生长无抑制作用,且在开放式组培中未发生污染,可用作开放式组培中的抑菌剂.陈瑞丹等也对梅花茎段开放式启动培养进行了初步的研究.赵青华等,陈永波等近期对魔芋开放式组培养技术进行了初探,试验成功后该课题组还申请了魔芋开放式组培的专利.随着开放式组培技术的一个个突破,开放式组培方法受到人们越来越多的关

19、注.所谓植物开放式组织培养,是指在抑生素的作用下,使植物组织培养脱离严格无菌的操作环境,不需高压灭菌和超净工作台,利用塑料杯代替组培瓶,在自然,开放的有菌环境中进行植物的组织培养,从根本上简化组培环节,降低组培成本,便于技术的推广.由于降低了环境要求,减少了操作环节,在设备,场地,能源等方面都显着降低了成本.以组培100万株种苗计,常规组培的成本为21.06万元,而开放式组培的成本为6.71万元,仅为常规组培的30%.植物开放式组培的特点在于:培养容器的选择范围较大,不需要耐高温高压的材料;培养基不需高压灭菌;接种器具不需高压灭菌;接种与培养环境不必无菌;成本低,操作方便;微生物不易产生抗药性

20、,能获得较持久的抑菌效果.由于开放式组培技术能够省去营造无菌环境的成本,因此笔者认为,该方法是未来植物组织培养最有应用前景的发展方向之一.4前景展望植物开放式组培技术的关键在于找到有效的抑菌剂.通过降糖或减少有机物的添加量,可以在一定程度上起到抑菌作用,但不能满足开放式组培的要求.抗生素的使用可以起到比较好的抑菌效果,但抗生素容易使微生物产生抗药性,且对组织培养材料的生长有一定的影响.鉴于此,有学者利用具有抑菌作用的中药混合物进行抑制微生物生长的研究,并取得成功,但该方法在中药选择及提取过程方面比较繁琐.因此有效抑菌剂的探索正方兴未艾.在组织培养过程中造成污染的根本原因在于,为了使培养物能较分

21、化,生长,人们会尽量创造一个适宜于植物生长的,单一稳定的环境,而该环境同时也正是微生物生长的理想环境,从而导致微生物的大量滋生.笔者认为,必须改变这种单一稳定的环境才能真正达到开放式组织培养的要求.为此,笔者提出了以下几点设想.4.1纳米材料的应用国内已研制出的棕色的25nm纳米抗菌颗粒,对大肠杆菌,金黄色葡萄球菌等致病微生物均有强烈的抑制和杀灭作用,且遇水后杀菌力更强,具有广谱,亲水,环保等多种性能,且因采用纯天然矿物质,不会使细菌产生耐药性.奚正英对纳米tio,和纳米zno的抗菌效果进行了研究,结果表明,当纳米抗菌剂在其浓度为1000ppm(最低抑菌浓度)以上时,对110210cfu/ml

22、(最高杀菌浓度)受试菌株的抑菌率可高达99.99%.由此可见,纳米材料的抑菌效果好,且不产生抗药性,但其对组培材料是否有大的影响仍需探讨.因此,纳米材料作为抑菌剂具有广阔的应用前景.4.2具有广谱抗茵作用蛋白质的应用乳铁蛋白是转铁蛋白家族中一种天然的铁离子结合糖蛋白.1972年,bullen等首先提出乳铁蛋白具有抑菌作用.1982年,arnold等通过萤光免疫研究发现,乳铁蛋白可与菌体表面结合,从而隔断外界营养物质进入菌体,致使菌体死亡.现已确定,乳铁蛋白属广谱抑菌剂,既可抑制需铁的革兰阴性菌,如大肠菌群和沙门氏菌等;也可抑制革兰阳性菌,好氧菌,厌氧菌和假丝酵母菌属等,但基本不抑制对铁需求不高

23、的菌,如乳酸菌.另有学者报道,乳铁蛋白肽(lactoferricin,lfcin)抗菌活性比乳铁蛋白高400倍以上.此外,溶菌酶(1ysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)或n-乙酰胞壁质聚糖水解酶(n-acetylmu.ramideglycanohydrolase),是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶.该酶具有抗菌,消炎,抗病毒等作用.像这类具有广谱抗菌作用的蛋白质在植物组织培养中的利用还未见报道.但作者认为,这是开辟开放式植物组培技术的新途径,且对组培物无任何影响,不产生微生物的抗药性.4.3液体培养基的循环使用俗语说:流水不腐,户枢不蠹.在传统的植物组织培养中,之所以容易被污

24、染,是因为所用培养基是固体居多,且空气不流通.该设想就是在要改变这种状况的基础上提出的.方法是把液体培养基雾化后喷洒到组培物上,接着收集流下的液体培养基,然后通过微孑l滤膜或滤饼过滤除菌后再送回雾化器重复使用,同时在培养基中可以添加一些微量抗生素或其他广谱抗菌剂等.该法的优点是可以工厂化大量培养植株,由于不添加或少量添加抑菌剂,植物的生长相对不易受到影响,对于食用药用植物的组织培养将更加安全.因此笔者认为,该方法是最有发展前景的开放式组织培养技术之一.参考文献1wh1tepr.potentiallyunlitedgrowthofexcisedtomatoroottipsinaliquidmed

25、iumj.plantphysiology,1934,9(3):585600.2morelg.producingvirus-freecymbidiumsj.americanorchids0cielybulletin.1960.29:495497.3guhas,maheshwarisc.invitroproductionofembryosfromanthemofdaturaj.nature,1964,204(4957):497.4王秋洁,李青.大花蕙兰组织培养降低或本的研究c张启翔.中国观赏园艺研究进展(2007).北京:中国林业出版社,2007:264268.5宋锋惠,李康,史彦汀.阿月浑子组织

26、培养及快速繁殖技术研究j.河北林果研究,2003,18(1):5o一53.6郭向云,尹钧,余桂荣,等.vb1和干燥处理对小麦幼胚愈伤组织培养的影响j.华北农,2oo3,18(4):1922.7kozait,kitayay,kutotac.collectedpapersonenvironmentalcontrolinmieropmpagationj.chilaunversitypress,1995(3):591947.8肖玉兰,张立力,张光怡,等.非洲菊无糖组织培养技术的应用研究j.园艺,1998,25(4):408410.9李宗菊,桂明英.谷氨酸在无糖组织培养中的应用j.西南农业,1999,1

27、2(3):45-49.1o刘立秋,陈文龙,白淑霞,等.碳素营养对毛白杨葡萄试管增殖培养苗的影响j.林业科技通讯,1996(7):2436.11李晓玲,由继红,杨文杰.苹博一号梨试管苗的光自养生长和光混合营养生长j.特产研究,2000(1):1120.12reuvenio,shlesingerdr,laviu.invitropropagationofdioeciouscarlcapapayal.j.plantcelltissudandorganculture,1990,20(3):4146.13李颖,李春燕.多菌灵和青霉素在组培污染中的应用j.林业科技,2002,27(1):68(下转第1428

28、8页)14288安徽农业科学2010生1j0嘎86n4a200.020.040.060.080.1o吼120.14多糖浓度polysaccharidecollcyltrationi口g/ml图8标准曲线fig.8standardcurve结果显示5次测定结果变化很小,相对标准偏差rsd<2.oo%(n=5),表明精密度高,重现性好.表1精密度实验结果table1precisionexperimentresults2.4回收率测定分别移取1.0mg/ml的提取液0.5ml于9个25ml容量瓶中,再分别加入不同浓度的葡萄糖标准溶液,按1.2.4方法测定多糖含量,计算加标回收率,结果如表2所示

29、.表2显示一次测定加标回收率在76.0%一95.9%范围内,表明测定多糖含量准确可靠.3结论采用超声辅助浸提法提取了香菇多糖,并采用硫酸一苯酚法测定了香菇多糖的含量.采用超声辅助提取多糖能在相对较低温度下,较短提取时间内得到较高提取率,通过单(上接第14283页)14王亦菲,陆瑞菊,周润梅,等.彩色海芋组织培养过程中内生菌的抑制j.上海农业,2001,17(2):8283.15朱广廉.植物组织培养中的外值体灭菌j.植物生理学通讯,1996,32(6):444449.16王梅,汤浩茹,刘淑芳,等.抗生素对草莓内生菌的抑制j.安徽农业科学,2005,33(4):606607.17陈娟,潘开文,毕世

30、荣,等.生姜茎尖组织培养和污染率控制的研究j.长江蔬菜,2o07,1:3840.18许婉芳,萧华山.抗生素在金线莲组织培养中的抗污染作用j.福建农业科技,1999(s1):1ol1.19王春.医用抗生素在马铃薯组织培养中的抑菌效应研究j.甘肃农业科技,2004(10):1516.2o胡静,马晖玲,nqq-,等.两种生素的效价比及其对甘农3号紫花苜蓿愈伤组织生长发育的影响j.草原与草坪,2oo7(2):1-4.21杨国会,刘畅,童建青,等.虎眼万年青组织培养中抗生素抑菌作用的研究j.安徽农业科学,2oo8,36(34):1489414895.22张松,温孚江,朱常香,等.抗生素对大白菜组织培养形态发生的影响j.山东农业大学:自然科学版,2ooo,31(4):38538823崔刚,单文修,秦旭,等.植物开放式组织培养研究初探j.山东农业因素变化法确定了最佳提取条件:超声波预处理30rain,香菇多糖提取率为8.9312%,相对其他方法较高.表2回收率试验table2recoveryexperiment参考文献1李雪华,龙盛京,谢云峰,等.龙眼多糖,荔枝多糖的分离提取及其抗氧化作用的探讨j.广西医科大学,2o04,21(3):342344.2王玲