多聚酶链式反应扩增DNA

1、DNADNA多聚酶链式反应扩增DNADNA片断 课题2 1 1、多聚酶链式反应的概念 一 、课题背景 2 2、多聚酶链式反应的应用： 的诊 断、 、 、 和 DNADNA 等各方面。 遗传疾病 刑侦破案 古生物学 基因克隆 序列测定 1 1、DNADNA分子的组成成分和结构 DNA DNA 分子的基本组成单位是 . . 共有 种, ,每个基本单位是由一分子 的 、一分子的 、 和一分子的 构成。 脱氧核甘酸 4 4 磷酸 碱基 脱氧核糖 那么DNADNA分子的平面结构怎 样呢？ 二 、基础知识 2 2、DNADNA分子复制的过程 参与的组分在DNADNA复制中的作用 解旋酶打开DNADNA双链

2、 DNADNA母链提供DNADNA复制的模板 4 4种脱氧核苷酸合成子链的原料 DNADNA聚合酶催化合成DNADNA子链 引物使DNADNA聚合酶能够从引物的 3 3 端开始连接脱氧核苷酸 解旋酶 DNADNA母链 4 4种脱氧核苷酸 DNADNA聚合酶 引物（ RNA） 打开DNADNA双链 模板 合成子链原料 催化子链合成 使DNADNA聚合酶能从引 物3 3端开始连接脱 氧核苷酸 思考：3 3、是什么？ 体外扩增DNA DNA 如何提供相似环境？ 变性（ 80-100 ） TaqTaq聚合酶（耐高温） 20203030个核苷酸构 成DNADNA或RNARNA DNA双链 单链 变性（加

3、热80-100 ） 复性（缓慢冷却） 4 4、DNA DNA 分子的热变性原理： 变性的目的： 复性的目的： 解开双链 有利于引物和引物与两条单 链的结合 （一） 、PCRPCR技术的原理 利用DNADNA分子的热变性原理，通过控制温度来控制 双链的解聚与结合，从而完成体外DANDAN分子的扩增。 体外DNADNA复制的条件： 四种脱氧核苷酸、耐高 温的聚合酶、引物、 模板；缓冲溶液和严格控制 温度的温控设备。 复制的方向：子链的5 5端向 3 3端延伸。 （一）、PCRPCR技术原理 PCRPCR参与的组分在DNADNA复制中的作用 高温变性解旋酶打开DNADNA双链 DNADNA母链提供D

4、NADNA复制的模板 4 4种脱氧核 苷酸 合成子链的原料 TaqTaq酶（耐高温）DNADNA聚合酶催化合成DNADNA子链 20-3020-30个核苷酸构 成DNADNA或RNARNA单链 引物使DNADNA聚合酶能够从 引物的3 3端开始连接 脱氧核苷酸 （二）、PCRPCR的反应过程 每个循环包括：变性 复性延伸 从第二轮循环开始，上一次循环的 产物也可以作为模板参与反应，并且由 引物延伸而成的DNADNA单链会与引物 结合，进行DNADNA的延伸，这样，DNADNA聚合 酶只能特异性地复制处于两个引物之间 的DNADNA序列，使这段固定长度的序列呈 指数扩增。 No Image DN

5、ADNA双链反向平行 3 5 5 3 1 1、DNADNA分子的3 3 端与5 5 端 -OH-OH端为3 3 ; ; 磷酸基团的末端为5 5。 2 2、DNADNA分子由两条反向平行的脱氧核苷酸 链根据碱基互补配对原则形成氢键连接而 成。 No Image 基本单位 A T G C A T G C 3 3 5 5 实验操作步骤： （准备）按配方将所需试剂摆放在实验桌上 （移液）用微量移液器按配方在微量离心管 中依次加入各组分 （混合）盖严离心管口的盖子，用手指轻轻 弹击管壁 （离心）将微量离心管放在离心机上 （反应）将离心管放入PCRPCR仪上，设置好PCRPCR 仪的循环程序 反应周期 高

6、温变性 低温复性(退火) 适温延伸 反应循环数： 扩增倍数：109以上 30多次 以便增加大分子模板DNADNA彻底变 性的概率 （二）、PCR的反应过程 1 1、循环之前的一次预变性 2 2、PCR PCR 一般要经历三十多次循环 5/ 3/ GGTC 3/5/ GACC 5/ 3/ AG 引物 5/3/ GG 引物 变性 复性 延伸 复制过程 5/ 3/ GGTC 5/ 3/ GGTC 5/ 3/ GA 引物 5/ 3/ GA 引物 5/3/ GG 引物 5/ 3/ GA 引物 3/ 3/5/ GACC 3/5/ GACC 5/3/ GG 引物 5/3/ GG 引物 5/3/ GG 引物

7、3/ 5/ 3/ GA 引物 （1 1）变性：当温度上升到90 90 以上时， 双链DNADNA解聚为单链。 （2 2）复性：温度下降到50 50 左右，两种 引物通过碱基互补配对与两条单链DNADNA结合。 （3 3）延伸：温度上升到7272左右，溶液中 的四种脱氧核苷酸(A(A，T T，C C，G)G)在DNADNA聚合 酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成 新的DNADNA链。 （二）、PCRPCR的反应过程 3 3、每个循环包括：变性 复性延伸 （1）PCR循环-变性 9595变性 （1）PCR循环-变性 9595变性 （1）PCR循环-变性 9595变性 （2）PCR循环复性 555

8、5复性 （3）PCR循环延伸 （3）PCR循环延伸 （3）PCR循环延伸 （3）PCR循环延伸 4 4、循环特点： 上一次循环的产物为下一循环的模板 结果单链中有最初母链的只两条（无引物 存在于两个子代DNADNA分子中 其它子代DNADNA分子都为双引物分子式 处于两引物之间的DNADNA序列呈指数增长1 12 2N N 三、实验步骤： 准备好PCRPCR反应体系的配方 用微量移液器按配方在往微量离 心管中加入各组分 盖严盖子，用手指轻轻弹击 管壁混合反应液 离心10S10S 将离心管放入PCRPCR仪上，设置好 循环程序进行反应 四、操作提示： 操作提示 1 1为避免外源DNADNA等因素

9、的污染，PCRPCR实验中使用的 微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须 进行高压灭菌。 2 2PCRPCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在-20-20 储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓 慢融化。 3 3在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试 剂后，移液器上的枪头都必须更换。所有的成分都加入 后，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁， 使反应液混合均匀，再将微量离心管放在离心机上，离 心约10s10s，使反应液集中在离心管底部，再放入PCRPCR仪中 进行反应。 目的：避免外源性DNA大量扩增造成假阳性反应。 五、结果分析与评价 1 1、原理：DNADNA

10、在260nm260nm的紫外线波段有 一强烈的吸收峰( (图5-11)5-11)。可以利用 DNADNA的这一特点进行DNADNA含量的测定。 注意事项：详见操作提示 五、结果分析与评价 DNA 含量的测定：稀释对照调零 测定计算（公式见P63） 波长260nm260nm处 读数 蒸馏水 做对照 5050 倍 实验结果与分析 DNADNA含量(ug/mI)=50 (ug/mI)=50 （260nm260nm的读数） 稀释倍数 六、课题延伸 1 1、PCRPCR优点： 2 2、PCRPCR技术的应用P58P58 原理虽然复杂，但操作却十分简单。快 速、高效、灵活和易于操作 PCRPCR技术与体内

11、DNADNA复制的区别： 1. PCR 1. PCR不需要解旋酶；体内DNADNA复制 需要； 2. PCR 2. PCR需要耐热的DNADNA聚合酶（常用 TaqDNATaqDNA聚合酶），而其他生物体内的聚 合酶在高温时会变性； 3. PCR 3. PCR一般要经历三十多次循环，而 生物体内DNADNA复制需要生物体自身的复 制。 练习 ( (课堂检测) ) 1 1、DNADNA单链的_末端为3 3端, , _末端为5 5端, ,在DNADNA复制时, ,引 物从模板链的_端配对结合. .在 _酶的作用下, ,从引物的 _端, ,使子链向下延伸. . 2 2每次循环可以分为 _这三个过程,

12、 , 对应温度分别为_._. 磷酸基团 羟基 羟基 DNA聚合 3/ 变性、复性、延伸 9595、55 55 、72 72 9090以上、5050左右 、72 72 左右 练习 ( (教材P63)P63) 1 1、一个DNADNA片段经过3030次循环后能形 成_个这样的片段. . 2 2、依据DNADNA吸收紫外光的情况, ,用紫外 分光光度计测得 DNA=_DNA=_ 230 l50 x(260nm50 x(260nm的读数)x)x稀释倍数 练习巩固 1 1、关于PCRPCR技术的应用，错误的一项是 A A 古生物学、刑侦破案、DNADNA序列测定 B B 诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学 C DNAC DNA序列测定、基因克隆、刑侦破案 D D 诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNADNA序列测定 2 2、DNADNA的合成方向总是从子链的哪一端向 哪一端延伸？ 3 3、PCRPCR技术最突出的优点是