拟南芥叶色突变体F03―06的筛选及突变基因的克隆

1、拟南芥叶色突变体F0X06的筛选及突变基因的克隆DOI：10.14088/jki.issn0439-8114.2016.21.057Genetic Screening and Isolation of a Leaf Color Mutant F03-06 in ArabidopsisPING Bu-yun，ZHAO Jun，AN Li-jun(State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas/College of Life Sciences ，Northwest A & F University ，Yangling 71210

2、0 ，Shaanxi ， China )： Photosynthesis that is proceeded in the chloroplast plays key role for human beings survival ， leaf color mutants are excellent system to study the mechanisms of photosynthesis because leaf color could be used to mark the chloroplast development status. In an effort to identify

3、 genetic factors involved in plant photosynthesis，largescale genetic screening was carried out and one color mutant F03-06 was isolated from a EMS mutagenesis library in Col-0 back ground. Compared with the wild type， F03-06mutant exhibited smaller pale green rosette leaves ， dark veins and also ret

4、arded growing and dwarf plant size. Genetic analysis indicated that the F03-06 mutant phenotype was controlled by a single recessive nuclearlocus. Based on the map-based cloning approach and DNA sequencing ， there was a single nucleotide mutation at the +865th base pair within the gene At5g54810 wer

5、e found which was reported to en code theB sub unit of tryptopha nsynthetase. In addition，the loss function mutants ofAt5g54810 exhibit the similar phenotype to that of F03-06 ， At5g54810 could correspond to the mutation gene in F03-06 background. This work will provide newgenetic material for study

6、ing and revealing the mutual regulation mechanisms between tryptophan synthesis and chloroplast development.光合作用是地球上 ?模最大的能量转换形式，是生物界几乎 所有物种赖以生存的关键。 叶绿体是植物进行光合作用的重要细 胞器，具有半自主性，具备独立的DNA和蛋白质合成体系1。叶绿素是植物叶绿体内参与光合作用的重要色素，由于其对 400700 nm波长范围内的绿光吸收值低，所以大多数的植物叶 片都呈现绿色 2 ，但在某些特殊情况下，直接或者间接影响叶 绿素的合成或者降解过程， 造成植物

7、体内叶绿素的变化， 就会使 叶色发生变异，形成叶色突变体 3 。叶色突变大致分为白化、 黄叶、浅绿、深绿、黄绿、绿黄、条纹和斑点等类型，其突变的 分子机制也较为复杂， 植物叶绿素合成途径、 血红素到光敏色素 生色团生物合成途径的任何基因发生突变， 都会导致叶色突变体 的形成4 。另外，细胞核编码的叶绿体基因发生突变也会导致 叶色变异 5 。目前，叶色突变体已广泛应用于基础理论研究和 实践生产， 利用叶色突变体研究植物光合作用机制， 以及培育观 赏植物等。因此，发掘和筛选叶色突变体，克隆和鉴定突变基因 的生物学功能具有重要的理论意义和实际应用价值。 本 研究在大规模遗传诱变筛选中获得了一个拟南芥

8、叶色突变体F03-06，该突变体莲座叶与野生型相比叶色黄绿、叶脉深绿色、 叶片较小、呈圆形、叶柄短，植株整体生长缓慢，株型矮小。利 用图位克隆技术6,通过粗定位和精细定位以及 DNA测序分析， 确定该突变基因为 At5g54810，它编码拟南芥色氨酸合成酶的 p 亚基7， 8，为进一步解释色氨酸合成途径与植物叶绿体发育之 间的调控机制奠定基础。1 材料与方法1.1 材料Columbia （ Col-0 ）和 Lansberg erecta （Ler ）生态型野生 型拟南芥种子由本实验室保存； Col-0 背景的甲基磺酸乙酯（Ethyl methylsulfonate , EMS突变体库由本实验

9、室创制保存。1.2 试验方法1.2.1植物材料的种植和培养方法 将Col-0背景的EMS诱 变库按 pool 播种在进口品氏基质泥炭土（ Pindstrup Substrate Peat Moss ） 上, 4 C处理3 d保证种子发芽的一致性，随后移 入植物生长间培养，培养条件为24 h持续光照，温度（20 2） C, 相对湿度 70%。培养 2 周左右待植物长出第 3、第 4 片真叶时观 察叶片颜色，筛选叶色异常的植物作为潜在的叶色突变体。1.2.2 突变体遗传背景的纯化和遗传学分析 将挑选出的表 型明显的突变体与野生型 Col-0 连续回交 3 次，纯化突变体的遗 传背景并获得BC3种子。同时，在突变体与野生型 Col-0回交的 过程中，通过观察杂交 F1 代植株表型判断突变的显隐性；通过 统计 F2 代群体中的分离比判断该突变体是否由单基因突变造 成。另外，通过正反交试验验证突变位点是否为细胞核遗传。1.2.3 图位克隆 首先将背景纯化的突变体与 Ler 生态型拟 南芥进行杂交，在杂交 F2 代植株中挑选具有突变体表型的植株 作为图位克隆的作图群体。 通过CTAB法提取约95棵突变体植物 DNA并进行混合构建1个DNA昆合池，利用已经公布的均匀分布 拟南芥 5 条染色体的 27 对分子标记为引