iso-seq应用系列(二)可变剪切分析

1、iso-seq应用系列(二)可变剪切分析 一、什么是可变剪切？可变剪切是指mRNA前体通过不同的 剪接方式产生不同的mRNA剪接异构体，从而使一个基因产生多 个不同的mRNA转录本，进而能够翻译成多种不同的蛋白。可变 剪切是调节基因表达和产生蛋白质多样性的重要原因，是真核生 物转录组复杂性和多样性的重要原因。可 变剪切的发生是通过剪接体 (spliceosome)识别mRNA前体 中内含子与外显子连接边界的剪接位点，通常是保守的二碱基序列 GT-AG。一个mRNA前体通常含有多个剪接位点，从而产生多条 可变剪切异构体，编码多个具有不同功能的蛋白。 根据剪接位点位置的不同，可变剪切可以分为以下5

2、种类型： ES:外显子跳跃A3SS: 3端可变剪切A5SS: 5 端可变剪 切 MEX :外显子选择性跳跃IR :内含子保留还有一些软件将可变剪 切事件分为7种类型，加上可变的起始或末端外显子 (Alternative first/last exon ),这两种形式更有可能是可变 启动子、可变polyA位点形成的。根据目前的研究表明，在动物 中Exon skipping占主导地位，而在植物中Intron retention 占主要地位。二、可变剪切的功能可变剪切是真核生物基因中非 常普遍的一种现象，在人和植物中，分别有约95%和 60%的多外显子基因会发生可变剪接的。因此，可变剪切在转录调 控

3、、基因功能方面具有重要作用。 可变剪切在动物的生长发育、细胞分化、细胞功能等方面具有重要 作用。可变剪切在肿瘤中经常发生，与肿瘤发生发展 密切相关。研 究发现可变剪切影响了那些在肿瘤中经常发生突变的蛋白基因家 族，改变了肿瘤相关信号通路中的蛋白-蛋白相互作用，说明可 变剪切也是驱动肿瘤发生的一种重要原因(AS drivers ) 1。 在植物中，可变剪切在植物的生长发育、抗逆应答等方面同样起着 重要的作用。其中，可变 剪切在植物抗生物、非生物胁迫时起着重 要的调控作用。研究表明植物的非生物胁迫能显著影响转录本前体 的可变剪 接，可变剪接的基因会出现过量表达2。三、可变剪 切的检 测方法目前利用

4、二代Illumina高通量测序方法进行可变剪切的 检测与分析非常普遍，但由于二代测序的读长短，在准确预测完 整的isoform全长序列方面无能为力，同时存在难以判断转录起 始位点(TSS)和转录终止位点(TTS)的位置、难以判断哪些外 显子是连接在一起的问题3。 而基于单分子实时测序技术(SMRT)的三代全长转录组，具有读 长超长的优势，可以直接获取mRNA全长，因此可轻松判断TSS 和TTS的位置、剪接位点的位置，轻松获取各 个spliced isoforms的全长序列，在可变剪切研究方面具有独 特的优势。 下面我们通过具体的文章来看看利用SMRT技术检测可变剪切的 优点：文章的标题为利用S

5、MRT技术和Illumina测序 分析与比 较草莓发育过程中的可变剪切事件4。这篇发表在 Plantjournal上的文章分别用PacBio RS平台和Illimina HiSeq2500平台，对野生草莓(F. vesca YW5AF7 ) 5个发育阶 段(small green, big green, turning, pink, red )的花托混 样进行测序，比较两个平台鉴定到的可变剪切事件。1发生可变 剪切的基因数目比较发生可变剪切的基因数，发现PacBio平台 有57. 67%的多外显子基因发生了可变剪切，而Illumina平台 只有33. 48%的多外显子基因发生了可变剪切(图1

6、d),说明 PacBio平台 鉴定到发生可变剪切的基因数比Alumina多，证明了 SMRT技术 在AS检测鉴定方面更优秀。另外，分析剪接位点在基因上的分 布和类型，发现两个平台的结果相似(图1 b,c)。 图1. b,剪接位点的分布；c,剪接位点的类型比例；d,发生 可变剪切基因的比例2可变剪切事件分析 从Table2可以看出，PacBio平台鉴定到了更多的可变剪切事 件(total events: PacBio 17260: Illumina 12080 )；可变剪 切事 件类型的比例在两个平台的结果中相似，都是IR类型占最 多，但三代测序鉴定到了更多的其他类型事件，说明SMRT技术在 鉴定新可变剪切异构体方面的能力比Illumina更优秀。 3可变剪切功能分析 对发生可变剪切的基因结构进行分析，发现可变剪切导致了基因功 能结构域的丢失或获得，或者导致了转录本的提前终止，从而影响 了基因编码蛋白的功能。 在草莓的发育过程中，AS