免疫学实验诊断

1、 Ab Ab 的发现：的发现： 抗体与免疫球蛋白的发现（抗体与免疫球蛋白的发现（1939Tiselius and Kabat） Immune sera Normal sera 正常人血清电泳分离图正常人血清电泳分离图 -S-S- S-S S-S N C LL HH （以（以 IgG IgG 为例为例） -S-S- S-S S-S N C HH L L N -S-S- S-S S-S N N L H VL CL VH CH1 CH2 CH3 -S-S- S-S S-S N N C L H VH CH1 CH2 CH3 1.IgG: (IgG1_IgG4) 2. IgM: 3. IgA : 4.

2、IgD : 5.IgE : Ig测定临床意义测定临床意义 1. Ig减低减低 见于各类先天性和获得性体液免疫见于各类先天性和获得性体液免疫 缺陷、联合免疫缺陷的病人及长期使用免疫抑制缺陷、联合免疫缺陷的病人及长期使用免疫抑制 剂的患者。剂的患者。 2. Ig单克隆性增高单克隆性增高 仅有某一种仅有某一种Ig增高而其他增高而其他 Ig不增高。主要见于免疫增殖性疾病。如：多发不增高。主要见于免疫增殖性疾病。如：多发 性骨髓瘤、巨球蛋白血症等。性骨髓瘤、巨球蛋白血症等。 3. Ig多克隆性增高多克隆性增高 表现为表现为IgG、IgA、IgM均均 增高。常见于各种慢性感染、慢性肝病、肝癌、增高。常见于

3、各种慢性感染、慢性肝病、肝癌、 淋巴瘤以及系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等淋巴瘤以及系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等 自身免疫性疾病。自身免疫性疾病。 一、总补体溶血活性（一、总补体溶血活性（CH50）测定）测定 主要反映补体经典激活途径的活化程度。主要反映补体经典激活途径的活化程度。 CH50测定方法：测定方法： 致敏绵羊红细胞致敏绵羊红细胞+待测血清（补体）待测血清（补体） 绵羊红细胞溶血绵羊红细胞溶血 溶血率与补体活性溶血率与补体活性正正相关。相关。 50%溶血率即为溶血率即为CH50。 一、总补体溶血活性（一、总补体溶血活性（CH50）测定）测定 主要反映补体经典激活途径的活化程度。主

4、要反映补体经典激活途径的活化程度。 1. CH50增高增高 见于各种急性炎症、组织损伤见于各种急性炎症、组织损伤 和某些恶性肿瘤等。和某些恶性肿瘤等。 2. CH50减低减低 （1）补体成分大量消耗：血清病、链球菌感）补体成分大量消耗：血清病、链球菌感 染后肾小球肾炎、自身免疫性溶血性贫染后肾小球肾炎、自身免疫性溶血性贫 血、类风湿性关节炎及同种异体移植排斥反应。血、类风湿性关节炎及同种异体移植排斥反应。 （2）补体大量丢失：外伤、手术和大失血。）补体大量丢失：外伤、手术和大失血。 （3）补体合成不足：肝硬化、慢性肝炎和重）补体合成不足：肝硬化、慢性肝炎和重 型肝炎。型肝炎。 二、血清二、血清

5、C3测定测定 C3是含量最高的补体，由肝细胞及巨噬细胞是含量最高的补体，由肝细胞及巨噬细胞 合成，无论经典途径还是旁路途径合成，无论经典途径还是旁路途径C3都参与，可都参与，可 反映出补体的活化情况。反映出补体的活化情况。 参考范围：参考范围：0.8-1.55g/L 临床意义临床意义 C3增高各种急性炎症、传染病早期、增高各种急性炎症、传染病早期、 某些恶性肿瘤（以肝癌最明显）及排异反应等。某些恶性肿瘤（以肝癌最明显）及排异反应等。 临床意义临床意义 C3降低降低 补体合成补体合成能力降低能力降低：肝脏疾病。：肝脏疾病。 补体合成补体合成原料不足原料不足：营养不良。：营养不良。 补体补体消耗过

6、多消耗过多：多见于免疫性疾病进展期如：多见于免疫性疾病进展期如： SLE， 膜增殖性肾炎等。膜增殖性肾炎等。 补体补体丢失过多丢失过多：大失血、大面积烧伤。：大失血、大面积烧伤。 先天性补体缺乏：遗传性先天性补体缺乏：遗传性C3缺乏症。缺乏症。 肾炎的病因鉴别：链球菌感染肾炎血清肾炎的病因鉴别：链球菌感染肾炎血清C3减减 少，病毒性肾炎血清少，病毒性肾炎血清C3含量正常。含量正常。 免疫细胞免疫细胞 n免疫细胞 淋巴细胞 中性粒细胞 T淋巴细胞 B淋巴细胞 NK细胞 流式细胞术淋巴细胞亚群分析流式细胞术淋巴细胞亚群分析 流式细胞术（流式细胞术（flow cytometry） Flow Cell

7、 Injector Tip Sheath fluid 白细胞分化抗原白细胞分化抗原 白细胞分化抗原（leukocyte differentiationantigen, CD） 是指在血细胞在分化成熟为不同谱系，分 化的不同阶段及细胞活化过程中，出现或 消失的细胞表面标记分子。 白细胞分化抗原除表达在白细胞外，也表 达在红细胞系和巨核细胞系/血小板，还广 泛分布于非造血细胞，CD大都是跨膜的蛋 白或糖蛋白。 常用的淋巴细胞表面标志物常用的淋巴细胞表面标志物 淋巴细胞亚群 T细胞： CD3+ B细胞： CD19+ NK细胞： CD3- CD16+ CD56 + 染料的选择和标记染色保证了荧光信号的

8、产生染料的选择和标记染色保证了荧光信号的产生 免疫荧光标记最常用的荧光染料免疫荧光标记最常用的荧光染料 荧光染料荧光染料 激发波长（激发波长（nm) 发射波长（发射波长（nm) 颜色颜色 FITC 488 525 深蓝色 PE(RDI) 488 575 橙色 ECD 488 620 橙红色 PeCy-5 488 670 红色 PeCy-7 488 755 深红色 PI 488 620 橙红色 APC 633 670 红色 免疫分析中常用的荧光染料与标记染色免疫分析中常用的荧光染料与标记染色 荧光的测定 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染 料受激发后产生

9、，发射的荧光波长与激发光料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光 波长不同。波长不同。 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色， 通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的 荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细 胞上的多个不同特征。胞上的多个不同特征。 FITCFITC Texas redTexas red PE.PC.APCPE.PC.APC PEcy5PEcy5 FL1 FL2 FL3 FL4 激光激光

10、 细细 胞胞 悬悬 液液 异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素 得州红得州红 能量传递复合染料能量传递复合染料 藻胆蛋白类藻胆蛋白类 T细胞膜表面分子具有不同的抗原性，主要细胞膜表面分子具有不同的抗原性，主要 有有CD3、 CD4、 CD8 等。等。 （1）CD3分子分子:表达于所有成熟的表达于所有成熟的T淋巴细胞淋巴细胞 表面，表面，T细胞特有标志，反映细胞特有标志，反映T细胞总数的变化。细胞总数的变化。 （2） CD4分子分子:辅助性辅助性T细胞（细胞（Th）表达。）表达。 （3）CD8分子分子:是抑制、杀伤性是抑制、杀伤性T细胞的标志。细胞的标志。 （4） CD4/ CD8比值比值:降低提示免疫

11、抑制降低提示免疫抑制;升高升高 提示亢进提示亢进,免疫性疾病。免疫性疾病。 T淋巴细胞及其亚群分析淋巴细胞及其亚群分析 nCD3+ T细胞，细胞，计算计算T细胞总数。细胞总数。 n CD4+ CD4+T细胞，细胞，计算计算CD4+T细胞细胞 数。数。 n CD8+CD8+ T细胞，细胞，计算计算 CD8+亚群亚群T 细胞数细胞数 n 计算计算CD4+ / CD8+比例比例 T淋巴细胞及其亚群分析淋巴细胞及其亚群分析 1、Th 细胞：细胞： CD3+ CD4 + CD8- T细胞，能辅助细胞，能辅助B 细胞分化成熟生细胞分化成熟生 成抗体产生细胞成抗体产生细胞 （桨细胞），参（桨细胞），参 与促

12、进细胞介导与促进细胞介导 的免疫应答。的免疫应答。 T淋巴细胞及其亚群分析淋巴细胞及其亚群分析 2 2、TcTc细胞：细胞： CD3+ CD4 - CD8 +T细胞，细胞， 能特异性直接杀伤能特异性直接杀伤 靶细胞，所有表达靶细胞，所有表达 MHC I类分子的靶类分子的靶 细胞。抗肿瘤免疫，细胞。抗肿瘤免疫， 抗病毒感染，移植抗病毒感染，移植 排斥反应和自身免排斥反应和自身免 疫疾病中均起了重疫疾病中均起了重 要作用。要作用。 B B细胞约为细胞约为5%-10%5%-10%，标志，标志 为为BCRBCR、SmIgSmIg。表达。表达CD19CD19、 CD20CD20、CD21CD21、CD2

13、2CD22分子。分子。B B 细胞也是免疫系统重要的细胞也是免疫系统重要的 免疫细胞，主要功能是介免疫细胞，主要功能是介 导体液免疫导体液免疫、抗原递呈细抗原递呈细 胞，同时还能分泌细胞因胞，同时还能分泌细胞因 子调节免疫应答。子调节免疫应答。 ( (二）二）B B淋巴细胞及其亚群淋巴细胞及其亚群 1、 B1(CD19+CD5+) 产生IgM型自身抗体, 参与免疫调节、与自身 免疫病的发生有关。 2、 B2(CD19+CD5-) 受外来抗原刺激, 产生高 亲和性特异性抗体。 B Cell Subsets nCD19是最重要的是最重要的B细胞标记分子。细胞标记分子。 n B细胞细胞升高见于升高见

14、于B细胞系统的恶性肿瘤细胞系统的恶性肿瘤 ； B细胞细胞降低见于体液免疫缺陷病及降低见于体液免疫缺陷病及 使用化疗或免疫抑制剂后。使用化疗或免疫抑制剂后。 一组大颗粒的淋巴细胞，一组大颗粒的淋巴细胞， 约约5%-10% 5%-10% ，标志，标志CD16CD16、 CD56CD56、CD2CD2、CD11a/CD18CD11a/CD18。 用三色荧光标记将用三色荧光标记将CD3CD3- - CD16CD16+ +CD56CD56+ +淋巴细胞定为淋巴细胞定为 NKNK细胞。主要功能是参与细胞。主要功能是参与 细胞免疫，在肿瘤免疫、细胞免疫，在肿瘤免疫、 抗病毒感染中均起重要作抗病毒感染中均起重

15、要作 用。用。 （三）（三）NKNK细胞分析细胞分析 第四节第四节 临床常用的肿瘤标志物检查临床常用的肿瘤标志物检查 n肿瘤标志物（tumor marker,TM） 在恶性肿瘤发生和增殖的过程中，由肿 瘤细胞合成分泌或者由机体对肿瘤细胞反 应而产生和升高的，反映肿瘤存在生长的 一类物质。 包括肿瘤抗原、激素、酶与同工酶、多包括肿瘤抗原、激素、酶与同工酶、多 胺及癌基因产物等百余种。胺及癌基因产物等百余种。 存在于血液、体液、细胞或组织中。存在于血液、体液、细胞或组织中。 一、蛋白质类肿瘤标志物检测一、蛋白质类肿瘤标志物检测 （一）血清甲胎蛋白（一）血清甲胎蛋白（alpha fetoprotei

16、n, AFP）测定）测定 胎儿发育早期，由肝和卵黄囊合成的血清胎儿发育早期，由肝和卵黄囊合成的血清糖糖 蛋白蛋白，出生后不久逐渐消失。出生后不久逐渐消失。 参考值：血清参考值：血清25ug/L（25ng/ml ） 临床意义临床意义 1.AFP是目前诊断是目前诊断肝细胞癌肝细胞癌最特异的标志物，最特异的标志物， 常高于常高于300ug/L 。 2.病毒性肝炎、肝硬化时，受损肝细胞的修复病毒性肝炎、肝硬化时，受损肝细胞的修复 再生，幼稚化的肝细胞重新具有产生再生，幼稚化的肝细胞重新具有产生AFP的能力的能力 ，但常低于，但常低于300ug/L。 临床意义临床意义 3.妊娠及生殖腺恶性肿瘤亦可高。妊

17、娠及生殖腺恶性肿瘤亦可高。 4.孕妇血清中孕妇血清中AFP异常升高，考虑胎儿有神经管异常升高，考虑胎儿有神经管 缺损畸形的可能。缺损畸形的可能。 5.18%的肝癌患者的肝癌患者AFP不升高不升高,需结合需结合a-L-a-L-岩藻糖岩藻糖 苷酶检测苷酶检测。 6. AFP异质体：不同来源异质体：不同来源AFP对小扁豆凝集素（对小扁豆凝集素（ LCA）的结合能力不同。）的结合能力不同。 LCA结合型结合型25%提示原发性肝癌提示原发性肝癌 25%提示良性肝病。提示良性肝病。 （二）癌胚抗原（二）癌胚抗原（CEA）测定）测定 CEA最初发现于结肠癌组织中。最初发现于结肠癌组织中。 参考值：血清参考值

18、：血清5ug/L 临床意义：临床意义：恶性肿癌患者的血清中可恶性肿癌患者的血清中可 发现发现CEA含量异常升高。常用于诊断含量异常升高。常用于诊断消化消化 器官的癌症器官的癌症（结肠癌、胃癌、胰腺癌、转（结肠癌、胃癌、胰腺癌、转 移性肝癌等）。移性肝癌等）。 CEA是一种是一种广谱广谱肿瘤标志物，在乳癌、肿瘤标志物，在乳癌、 肺癌及其他恶性肿瘤时也可升高。肺癌及其他恶性肿瘤时也可升高。 （三）前列腺特异抗原测定（三）前列腺特异抗原测定 前列腺特异抗原（前列腺特异抗原（prostate specific antigen, PSA ）是一种由前列腺上皮细胞分泌的蛋白酶，）是一种由前列腺上皮细胞分泌

19、的蛋白酶， 在在前列腺癌前列腺癌时，前列腺腺管破坏导致血清时，前列腺腺管破坏导致血清PSA水水 平明显升高。平明显升高。 临床意义临床意义 1、前列腺癌患者血清、前列腺癌患者血清PSA升高。升高。 2、前列腺肥大、前列腺炎、肾和泌尿生殖系统疾、前列腺肥大、前列腺炎、肾和泌尿生殖系统疾 病，病， PSA轻度轻度升高。升高。 3、5%前列腺癌患者血清前列腺癌患者血清PSA正常，需结合前列腺正常，需结合前列腺 酸性磷酸酶（酸性磷酸酶（PAP）检测。）检测。 （四）组织多肽抗原（四）组织多肽抗原（TPA）测定）测定 TPA是一种是一种非特异性非特异性肿瘤标志物，其水肿瘤标志物，其水 平与肿瘤细胞的增殖

20、分化有关，血清中平与肿瘤细胞的增殖分化有关，血清中TPA 增高主要用于辅助诊断增高主要用于辅助诊断迅速增殖的恶性肿瘤迅速增殖的恶性肿瘤， 且在恶性肿瘤的疗效观察方面敏感性较高。且在恶性肿瘤的疗效观察方面敏感性较高。 参考值：血清参考值：血清5ug/L （五）鳞状细胞癌抗原（五）鳞状细胞癌抗原（SCC）测定）测定 鳞状细胞癌抗原鳞状细胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen, SCC),是一种是一种鳞癌鳞癌肿瘤标志物。肿瘤标志物。 参考值：血清参考值：血清1.5ug/L 临床意义临床意义 1、诊断鳞癌，检测其疗效、复发、转移。、诊断鳞癌，检测其疗效、复发、转移。

21、2、肝炎、肝硬化、胰腺炎、肺炎、肾衰竭、肝炎、肝硬化、胰腺炎、肺炎、肾衰竭 等等SCC也可升高。也可升高。 3、血液标本应避免体液污染。、血液标本应避免体液污染。 二、糖脂类肿瘤标志物检测二、糖脂类肿瘤标志物检测 （一）癌抗原（一）癌抗原15-3（CA15-3）测定）测定 CA15-3是一种是一种乳腺癌乳腺癌相关抗原，对乳腺相关抗原，对乳腺 癌的诊断及术后随访临测有一定的价值。癌的诊断及术后随访临测有一定的价值。 （二）（二）糖链抗原糖链抗原125（CA125）测定）测定 CA125为一种糖蛋白性肿瘤相关抗原，存为一种糖蛋白性肿瘤相关抗原，存 在于卵巢肿瘤的上皮细胞及患者血清中，在于卵巢肿瘤的

22、上皮细胞及患者血清中， 主要用于辅助诊断恶性浆液性和上皮性主要用于辅助诊断恶性浆液性和上皮性卵卵 巢癌巢癌等。等。 （三）糖链抗原（三）糖链抗原19-9测定测定 CA19-9又称又称胃肠癌胃肠癌相关抗原。相关抗原。 临床意义临床意义 1、胃癌、大肠癌、肝癌的诊断。、胃癌、大肠癌、肝癌的诊断。 2、可作为胰腺癌、胆管癌等的辅助诊断指标。、可作为胰腺癌、胆管癌等的辅助诊断指标。 3、急性胰腺炎、胆囊炎、肝硬化、肝炎等也可不、急性胰腺炎、胆囊炎、肝硬化、肝炎等也可不 同程度升高。同程度升高。 （四）糖链抗原（四）糖链抗原72-4测定测定 CA72-4是监测是监测胃癌胃癌的首选肿瘤标志物。的首选肿瘤标

23、志物。 卵巢癌时卵巢癌时 CA72-4也升高，可与也升高，可与CA125联合检测。联合检测。 三、酶类肿瘤标志物检测三、酶类肿瘤标志物检测 （一）前列腺酸性磷酸酶（一）前列腺酸性磷酸酶（PAP）测定）测定 PAP 是前列腺分泌的酶。是前列腺分泌的酶。 PAP测定特异性高于前列腺特异性抗原测定特异性高于前列腺特异性抗原 （PSA）,敏感性低于敏感性低于PSA，常联合检测用于，常联合检测用于 前列腺癌前列腺癌的诊断。的诊断。 三、酶类肿瘤标志物检测三、酶类肿瘤标志物检测 （二）（二） a-L-岩藻糖苷酶（岩藻糖苷酶（AFU）测定）测定 AFU是溶酶体酸性水解酶。广泛存在于细是溶酶体酸性水解酶。广泛存在于细 胞溶酶体内及血液、体液中。胞溶酶体内及血液、体液中。 AFU与与AFP联合测定用于联合测定用于原发性肝癌原发性肝癌诊断。诊断。 （三）神经元特异性烯醇化酶（三）神经元特异性烯醇化酶（NSE）测定）测定 NSE是是小细胞癌和神经母细胞瘤小细胞癌和神经母细胞瘤的肿瘤的肿瘤 标志物。标志物。 四、激素类肿瘤标志物检测四、激素类肿瘤标志物检测 （一）（一） 人绒毛膜促性腺激素（人