基质细胞衍生因子

1、基质细胞衍生因子-1 a及其受体在糖尿病大鼠心肌病变中的表达及意义糖尿病心肌病变是由代谢紊乱触发，致心肌细胞凋亡增加， 纤维化， 出现心律失常， 进行性心功能不全的一种糖尿病慢性并 发症，是糖尿病病人死亡主要原因之一， 心肌内微血管病变是其 主要病理改变。基质细胞衍生因子 (stuomal cell-derived factor-1 a，SDF-1a) 是趋化作用细胞因子 (chemotaxis)CXC 亚 族的一员。研究表明， SDF-1a 在细胞迁移过程中发挥着重要作 用，与血管生成密切相关，通过与其特异性受体CXCR-4结合而发挥趋化作用，促进造血干/祖细胞逆SDF-1浓度梯度移行和增

2、殖，诱导新生血管形成。 在研究 SDF-1a 对人微血管内皮细胞的 作用时发现， SDF-1a 能促进内皮细胞增殖迁移，并能促进内皮 细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)，从而促进血管发生，表明 SDI、1a 参与了微血管内皮细胞形成新生血管的过程。本研究 通过链脲佐菌素 (STZ) 诱导建立糖尿病心肌病变动物模型，应用 免疫组化和RT-PCF方法研究糖尿病心肌病变心肌 SDF-1 a , CXCR-4及 VEGF的表达，探讨糖尿病心肌病变可能的发病机制。1 材料与方法1. 1 材料 雄性SD大鼠60只，体量200g 20g,由中南 大学医学动物部提供； 链脲佐菌素 (Streptozotoc

3、in ，美国 Sigma 公司)；罗氏血糖仪及试纸；SDF-1a , CXCR-4 VEGF及抗vWF单抗（武汉博士德公司）；S-P试剂盒（北京中杉金桥公司）；Trizol 和反转录试剂盒（Invitrogen公司）；Taq酶（大连Takara公司）;引物（上海生物工程公司合成）；PCFT增仪（德国Biometra公 司）； UVI.pro 凝胶成像与分析系统 （华粤公司 ）。1. 2方法 实验大鼠随机分成正常对照组（NC组）和糖尿 病（DM组），每组又分3个亚组，即1个月组（M1组）、3个月组 （MS组）、5个月组（M5组）各10只。禁食12h后，用新鲜配置 0.1mmol/L.pH4.5

4、的枸橼酸盐缓冲液稀释 STZ（10.g/L） ，以 60mg/kg 一次性腹腔内注射诱导建立糖尿病大鼠模型，正常组以 等体积枸橼酸盐缓冲液一次性腹腔内注射。1d及3d后尾静脉采血测血糖16.7mmol/L确定模型并纳入试验。每5d测大鼠体重、 血糖 1 次，普通颗粒饲料喂养，自由饮水。分别于造模后 1 个月、 3个月、 5个月末称体重、测空腹血 糖后处死大鼠，取心脏组织应用免疫组化 S-P 法检测心肌组织 SDF-1a , CXCR-4及 VEGF勺表达。抗vWF抗体染色心肌微血管计数，第哑因子相关抗原在血管内皮细胞表达，应用免疫组化S-P法对各组大鼠心肌组织中第哑 因子相关抗原进行测定，参照

5、 Weidner 法计数心肌微血管 （MV）。 取心肌置于去PdNA酶的冻存管液氮中保用于 Trizol提取心 肌总RNA测定纯度及含量。1. 3 统计学处理 采用 SPSS11.5 进行统计学分析，结果 以均数土标准差（x s）表示，采用成组设计资料两样本均数比较t 检验。2 结果2. 1 般状况观察结果 DM大鼠均成模，无血糖返回正 常现象，食量、饮水量及尿量均显著增加， 同时体质量增长缓慢， 并出现皮毛枯黄、皮下脓肿等。 NC组大鼠无死亡，DM组大鼠在 M3组、M5组各死亡1只。2. 2心肌微血管密度（MVD计数第哑因子相关抗原在血 管内皮细胞表达， 阳性点在光镜下为单个或呈团块、 柱状

6、或已分 化成管腔状的内皮细胞， 细胞质呈棕黄色至棕褐色， 糖尿病大鼠 心肌微血管数自造模后 M1组开始较NC组就有减少，但无统计学 意义，M3组具有统计学意义。2. 3 SDF-1a, CXCR-4及VEGF在心肌组织中免疫组化染 色镜下见SDF-1 a , CKCR-4及 VEGF在正常大鼠及糖尿病大鼠均 有表达，表现为心肌微血管内皮细胞胞浆及 （或）胞膜棕黄色显 色，同时心肌细胞染色也可见棕黄色显色。在DM大鼠心肌中的表达较正常大鼠为明显且其显色强度随DM病程延长逐步增强。2. 4 SDF-1a .CXCR-4及VEGFmRN的表达量 DM组大鼠心 肌组织中SDF-1 a , CXCR4及

7、VEGFmRNA勺表达量与同龄 NC组 大鼠比较，1个月时mRNA表达就明显升高，5个月时增高最明显。3 讨论SDF-1a 是新近发现的具有趋化活性的细胞因子，广泛表达 于多种组织器官中。近年来研究发现它与血管新生有着密切关系，SDF-1a通过与其特异性受体 CXCR-4吉合，促进CD34+造血 干/祖细胞逆SDF-1 a浓度梯度移行和增殖，抑制 CD34+造血干 祖细胞凋亡，诱导新生血管形成。 Tachibana 等研究 CXCR-4 或 SDF-1 基因缺乏鼠胚胎期血管系统发生过程时发现， 与野生鼠 比较，基因缺乏鼠在胚胎期第 13.5 天循环网就有区别，在野生 鼠胚胎中可见肠系膜动静脉的

8、大小分支，而在CXCR-4基因缺乏鼠胚胎中即使血管是正常的其大的分支也被丢失，在SDF-1缺乏鼠胚胎中存在类似表现；另见 CXCR-4基因缺乏鼠死于宫内并且 在心血管发育中存在缺陷，因而认为SDF-1/CXCR-4是器官及血管形成的重要信号系统。 SDF-1 a /CXCR-4轴在CD34+造血干/祖 细胞的归巢过程起着重要作用，并能诱导血管内皮细胞迁移增 殖。 Mirshahi 等研究 SDF-1 对人微血管内皮细胞的作用时发现， SDF-1 能促进内皮细胞增殖迁移，并能促进内皮细胞表达血管内 皮生长因子，从而促进血管发生，表明SDF-1参与了微血管内皮细胞形成新生血管的过程。VEGF是一类

9、与血管内皮细胞增殖及血管新生密切相关的血小板源性蛋白， 具有增加血管尤 其是微血管渗透性的功能， 同时还能选择性地促进血管内皮细胞 分裂进而促进血管新生。虽然正常组织也表达VEGF但研究证实VEGF的高表达与病理性微血管异常增生关系密.切。Salcedo等研究发现VEGF能诱导人血管内皮细胞 CXCR-4表达增加。Hiada 等报道SDF-1 a基因转染的内皮祖细胞通过 VEGF/eNO途径增加 缺血诱导的血管形成和血管新生。阻断SDF-1/CXCR-4轴能通过VEGF依赖性途径抑制薪生血管形成从而延缓肿瘤的生长。SDF-1a和VEGR以协同作用机制促进卵巢癌血管新生，在用人 卵巢癌细胞成瘤的

10、小鼠实验中发现，高浓度的SDF-1 a或VEGF均能诱导肿瘤内血管发生，病理性浓度的SDF-1 a和VEGF协同作用诱导肿瘤内血管发生，缺氧同步刺激肿瘤细胞产生 SDF-1a 和VEGF SDF-1 a和VEGF协同增强血管内皮细胞迁移、扩增和 存活。糖尿病大鼠心肌微血管结构扭曲变形、 微血管数目减少且密度降低、血管内皮细胞数目减少，STZ诱导糖尿病大鼠心肌细胞超微结构的改变发生在糖尿病病程 8周12周，心功能改变发 生在糖尿病病程6周14周。本实验用STZ大鼠饲养到20周， 在 3 个月时糖尿病大鼠心肌内微血管数量就有明显减少，5 个月时减少更明显， 具有糖尿病心肌病的改变。 本实验免疫组化检测SDF-1a , CXCR-4及VEGF在正常大鼠及 DMI大鼠的心肌均有一定的表达，测灰度值比较显示 DM组大鼠在3个月、5个月时SDF-1a、CXCR-4表达均明显增高，但 VEGF表达无明显改变;相对光密度结果显示SDF-1a , CXCR-4及 VEGFmRN在 NC大鼠及DM大鼠的心肌亦均有一定的表达，但 DM大鼠心肌中SDF-1 a ,CXCR-4的