2.2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(高中生物选修一教案系列)

1、课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、课题目标研究培养基对微生物的选择作用，进行微生物数量的测定。二、课题重点与难点课题重点：对土样的选取和选择培养基的配制。课题难点：对分解尿素的细菌的计数。学生活动教师组织与引导教学意图引导学生阅读教材p21-22引导学生阅读教材p22教师安排学生讨论。引导学生阅读教材p22（二）统计菌落数目引导学生观察教材p23图2-7样品的稀释和稀释液的取样培养流程示意图引导学生阅读教材p25操作提示通过上一节课的学习，我们知道，微生物和我们人类的关系非常紧密。目前，微生物在工业、农业、环境保护和医疗卫生方面有广泛的应用。我们也知道研究微生物最基本的方法是对微生物

2、进行培养、分离和计数。在上一个课题中，我们已经学习了微生物培养的原理和方法。在本节课中，我们将继续学习微生物的分离和计数。但是，微生物种类有很多，我们选择哪一种微生物来分离和计数呢？-引导学生阅读p21请看：co(nh2)2这是大家都知道的一种物质：尿素。今天，我们就学习一下从土壤中分离尿素细菌，并且计算1g土壤中尿素细菌到底含有多少个？并以它为载体来学习微生物的分离和计数的原理和方法。这就是我们今天学习的课题2的学习目标(板书展示)一、 尿素细菌的分离；二、尿素细菌的计数。师：要完成尿素细菌的分离，我们需要配制一个培养基。在上一课中我们学习了一个培养基的配制，叫什么培养基？生答：牛肉膏蛋白胨

3、固体培养基。师：我们选用牛肉膏蛋白胨培养基，能够从土壤中分离出尿素细菌吗？生答：不能。师：为什么呢？生答：略师总结：因为牛肉膏蛋白胨培养基上不仅有尿素细菌的生长，还有其他的微生物的生长，所以不可能分离出尿素细菌。（补充：含有多种微生物都能生长的培养基称为普通培养基）。师：我们怎样才能从土壤中分离出尿素细菌呢？生答:需要配制一种选择性培养基:只有尿素细菌能够在上面生长，而土壤中其他微生物是不能生长的。师：根据刚才的分析，你能给选择性培养基下一个定义吗？生答：选择性培养基是指在微生物学中，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。师展示(或引导学生阅读教材p22(二)统计

4、菌落数目一面一小段并学生阅读明确定义)：讨论1：培养基配方一： 培养基配方二： 培养基配方三：kh2po3 3g kh2po3 3g na2hpo3 1.4g na2hpo3 1.4g mgso47h2o 3g mgso47h2o 0.2gnano3 2g nano3 2g 尿素 1.0gmgso47h2o 3g 葡萄糖 10.0g na2hpo3 2.1g葡萄糖 10.0g 尿素 3.0g 葡萄糖 10.0g琼脂 15.0g 琼脂 15.0g 琼脂 15.0g分别加蒸馏水定容至于1000ml。 师：你认为，以上三个培养基配方中，哪个可以分离出尿离细菌？哪些不能分离出尿素细菌？原因是什么？生分

5、析配方一：任何细菌都能在上面生长。因为培养基配方中既提供了c源，又提供了n源，还有无机盐和水。生分析配方二：不可以。因为尿素细菌利用的唯一n源是尿素，而该培养基配方中有nano3存在，也提供了n源。其他以no3-作n源的微生物也能生长。生分析配方三：不可以。因为尿素细菌可以把尿素分解成氨。而固n细菌又能利用空气中的n，我认为固n细菌也能在上面生长。因此，也分离不出尿素细菌。师：我们说，每种微生物的生长，都有特定的条件，需要特定的一些营养物质。我们配制的培养基也可能有利于固n微生物的生长，也可能不能。但它只要有尿素提供n源，肯定能保证尿素细菌生长。这涉及选择性培养基的有没有选择性的问题。（为了降

6、低难度，固n菌问题可不作分析，整个实验过程中固n菌都无法排除）引入-引言：刚才，有的同学怀疑它没有选择性，不能选择出尿素细菌，还有其他的微生物。那你怎样设计一个简单的对照实验来证明呢？讨论2：怎样设计一个简单的对照实验证明配制的选择性培养基具有选择性？生答：将第三个培养基配方中的尿素去掉，其他的营养成分都保持不变，看一看，没有尿素的培养基有没有杂菌生长。如果有的话，证明第三个培养基中也会有杂菌生长。师分析：根据同学的回答，对选择性培养基设置对照：一个涂布土壤溶液，一个不涂布土壤溶液说明培养基是否被污染。仅仅设计这样一组对照，能体现出选择性培养基上生长的就是尿素细菌吗？我怀疑涂布土壤溶液的培养基

7、上长出的菌是土壤中所有的微生物。你说，是吗？生：应该做一个普通培养基作对照，能够满足多数微生物的生长(如牛肉膏蛋白胨培养基)。师总结：如果对照组是一个普通培养基，相对于选择性培养基，微生物的数量呢？(答：多)种类呢？(答：多)师：这样，数量多，种类多，而选择性培养基可能只有尿素细菌的生长。引言：通过这样一组实验，可以简单地证明分离出的就是尿素细菌。但今天我们的课题不仅仅从土壤中分离出尿素细菌，还要统计1g土壤中到底含有多少尿素细菌？师：在营养物质充足、环境适宜的条件下，一个细菌经过生长繁殖形成一个菌落。换句话说，一个菌落对应着一个活菌，菌落数反应了活菌的数量。所以我们可通过统计菌落的数目获取平

8、板上尿素细菌的数量。在前面课题中，我们学习了稀释涂布平板法。对土壤样品进行稀释的目的是什么呢？生答：平板上菌落密度太大、很难计数。师总结：就是说：获得在平板上的菌落数在30300之间，便于统计。如果低于30个，存在的误差较大，因为平板上只要有一个菌落的误差，那么考虑土壤样品稀释倍数，实际的微生物种群数量的误差将会非常大）；如果高于300个，统计起来比较困难，存在的误差也较大。师：如果要分离土壤中的微生物，为了便于统计，又减少误差，一些研究者对土壤的稀释倍数做了研究，结果如表格所示（微生物统计时土壤稀释倍数）：微生物的种类土壤稀释倍数目的分离土壤中所有细菌104105106平板上的菌落数应为30

9、-300个，便于准确计数。（学生完成）分离土壤中的放线菌103104105分离土壤中的真菌102103104分离土壤中的尿细菌104105106107师：为什么，针对不同的微生物稀释的倍数不一样呢？针对同一微生物做微生物计数时，土壤的稀释倍数也不一样呢？生答：在土壤中微生物的种群密度不一样；不同的地方，环境不同，同一微生物的数量也存在差异。（师：研究表明：1g表层干土壤中的细菌的数量是2000多万，放线菌的数量是500万左右；霉菌的数量约是20万左右。）师：尿素细菌的数量肯定比所有细菌的数量要少，稀释倍数是104-107师：对土壤进行稀释，我们应该怎么做呢？（观察图2-7，试用自己的话说出稀释

10、的流程）生答：首先，取1g土样，将土样倒入试管中，加9ml无菌水，振荡，就可得到稀释101倍的稀释液。然后从1号试管中移取1ml土壤稀释液，倒入2号试管，依次类推。我们可以得到101、102、103、104、105、106的稀释液师：经过稀释，我们得到了不同浓度的土壤稀释溶液，就可涂布接种了。是不是某一浓度的土壤稀释液只要涂布一个平板，培养后统计的菌落数就可作为计算1g土壤样品中尿素细菌的依据呢？为什么？（生答：我认为，每一个稀释倍数应涂布2-3个。如果只涂布一个培养基，容易产生误差。）师：每一个稀释倍数下的土壤溶液应涂布3-5个，例如我们选择了稀释了104倍的土壤溶液进行涂布接种时涂布3-5

11、个。将这三个平板上的尿素细菌的菌落数进行统计并计算其平均值，就是计算样品中所含尿素细菌数目的依据。这一设计遵循了实验设计的什么原则呢？生答：平行重复实验。师：四位同学针对不同的土壤稀释度进行涂布接种。以下数据为各平板上菌落数，分析涂布情况，计算其平均值。平板1平板2平板3平板值平板1平板2平板3平板值24225031020286198统计一统计二平板1平板2平板3平板值平板1平板2平板3平板值2132251029 8120统计三统计四平板一分析：生答：应舍去平板3，平板1和2相加除以2即可。因为第3组超过了统计允许的最大值。师：获得在平板上的菌落数在30300之间，便于统计。平板2分析：生答：

12、应舍去平板2。因为平板2和其他两个相差太大。师：肯定。平板3分析：生甲答：三组相加除以3即可，因为它们都相差不大。生乙答：不可以，因为统计数应在30-300之间，而平板1和3超过了这一范围，误差较大。师：只有平板2介于30-300之间，是否说明菌落的平均数就是32呢？这一数值说明了什么？生答：不能。造成这一结果的原因是稀释度太大，误差很大。师：怎样才能得到准确的菌落呢？生答；降低稀释倍数。师:观察时记录(出示记录表格，课下完成记录) 培养基类型日期平板细菌数(土壤稀释度： )选择性培养基牛肉膏蛋白胨培养基涂布接种未涂布接种第一天第二天计算公式p22旁栏知识拓展：师：试计算：在稀释106倍的条件

13、下，三个平板培养基上的菌落数平均是2.54个。（生答:2.54109个）师：请大家预测一下，第一天和第二天的菌落比较有何区别？生答：第一天的菌落比较小；第二天的菌落比较大。师：有同学在做实验时发现：普通培养基上菌落几乎长满了；选择培养基上菌落较少；空白对照培养基未出现菌落，这一结果说明了什么？生答：实验是成功的，菌落应该是尿素细菌生长繁殖的结果。师：有同学在做实验时发现：在普通培养基上，菌落数少于选择性培养基。试分析其中原因。生答：略。师总结：普通培养基在涂布时，涂布器温度太高，杀死了大量的菌种。师：普通培养基上菌落比选择性培养基上的大的多。为什么？生答：略师总结：涂布时没有将微生物分开，涂布

14、不均匀。师：我在观察选择培养基上的尿素细菌的菌落时，发现有大有小，统计时，是否只统计大的，还是只统计小的，或大小都统计呢？生答：略师总结：大小都统计，因为分解尿素的细菌可能不只一种。师：在操作的时候，应该注意哪些问题呢？-引导学生阅读教材p25操作提示师总结：1、稀释土样时，应注意将装有稀释液的试管及时编号，用棉塞塞好试管口，同时注意不同让土壤稀释液沾上棉塞2、涂布时应在火焰旁边进行，还要完全打开培养皿盖，用滴管滴两滴土壤稀释液(0.1ml)在培养基上，再进行涂布，要特别注意涂布均匀。3、涂布完成后，用记号笔在培养皿盖上写上培养基的类型、土壤稀释倍数，涂布接种的时间和涂布接种人等。并将所有的平

15、板放在32的恒温箱中培养。师：接种时为何要在火焰旁边进行呢？生答：防止杂菌污染。师：涂布不均匀会出现什么情况？生答：出现菌落不均匀，难于统计。由于条件所限，我们不能到实验室亲自体验生物技术实践这门课操作的规范性、技术的含量及注意事项等。这个实验操作时同学易出现的问题总结起来有以下几点：涂布时，一些同学将培养皿盖打的太开，造成空气中的微生物进入培养皿，污染培养基；在涂布过程中，用力太大，将培养基弄破；有些同学涂布不均匀，微生物长到一起，不便于统计。分组实验结果展示：甲组乙组平板1平板2平板3平均值平板1平板2平板3平均值138613251570493454542师：在稀释度相同的情况下甲、乙两同

16、学得到了相差很大的两组实验结果.就这一实验结果来看，他们甲、乙两组同学共同出现的问题是什么？ 学生分析：稀释浓度太低，造成单位面积上尿素细菌数量太高。师：这告诉我们，下一次再做实验的时候，应把稀释倍数再提高一些。师：这两组稀释倍数是一样的，为什么会出现这么大的误差。生答：涂布器可能温度太高，杀死了一部分微生物；吸取提取液时，振荡不均匀。师总结：取的土样不一样，微生物的数目不一样；稀释土样时，稀释的程度不均匀也会出现偏差；涂布器可能温度太高，杀死了一部分微生物；计数也是很关键的环节。师：甲组(稀释104生答：2.5108)、乙组 (稀释105生答：1.54109)烷丙组：(稀释106倍生答：2.

17、23109)师：稀释倍数不同，平板上尿素细菌的数目不同，随着稀释倍数的加大，平板上尿素细菌的数目多了一些，是什么原因造成这一结果呢？生答：统计时有误差。师总结：稀释倍数低的培养基上菌落有些菌落大很多，稀释倍数低的培养基上菌落小一些，统计时菌落大的作为一个来统计，菌落小的也作为一个来统计，而菌落大的很可能是多个细菌生长繁殖的结果，于是稀释倍数小的就出现了较大的误差。师总结：统计可见，1g土壤尿素细菌的数量还是很多的。1g土壤中不仅仅只有尿素细菌，还有其他的微生物。所以说，土壤中的微生物是非常丰富的。现在，我们一定确信这个平板上长出的细菌就是尿素细菌吗？我们还需要通过后绪的工作来鉴定它？例如：我们

18、可以观察这个菌落的形态，这个菌落的颜色。是否与尿素细菌的颜色、形态是一样的；也可以通过化学的方法来鉴定它：尿素细菌的代谢产物是氨。而氨溶解在水中呈碱性。于是，我们可以将酚红滴在菌落上，过一会儿，观察它的颜色。如果培养基出现颜色是红色的，我们可以氨的产生确认细菌是尿素细菌。如果没有红色，说明不是尿素细菌。思考：我们将课题完成了，在课题目标中，我们以尿素细菌为载体，学习微生物的分离和计数的原理和方法。这个课题的工作流程包括哪些具体的环节呢（或实验设计的流程是什么）？答：根据微生物的特性配制选择性培养基，取土样，稀释土样，涂布接种，观察计数，计算鉴定。师：应用这个原理和方法，我们能不能从土壤中分离出

19、其他的微生物？生答：分离出硝化细菌。生答：分离的是具有特殊性质的，在某一培养基只有它能生长，而其他微生物受抑制的微生物。师总结：除了细菌，还可以分离出其他的微生物吗？如真菌，放线菌。总之，土壤中有什么微生物，我们都可以根据它的特殊的性质，配制选择性培养基就可以把它分离出来。通过今天的学习：我们不仅仅满足于分离出尿素细菌，而是学习了一种方法。这种方法可以使我们从土壤中分离出很多很多我们需要的微生物。仅仅从土壤中分离出微生物是不够的。我们生活中有很多地方都会用到这种方法。随堂练习：大家最爱吃的冰激凌，某个商店的冰激凌，大家怀疑它大肠杆菌的数量超标了。运用今天你学习的这种原理和方法，你怎样拿到证据说明它确实超标了呢？(说出工作流程即可)生答：买一盒冰激凌，取出少量，称出质量，溶化，浓度稀释，在普通培养基上培养，然后用伊红-美蓝染色，观