分子生物学原理：第十章RNA的生物合成

1、目录目录 第十章第十章 RNA的生物合成的生物合成 RNA Biosynthesis ( Transcription ) 目录目录 潘东宁潘东宁 研究员研究员 基础医学院生物化学与分子生物学系基础医学院生物化学与分子生物学系 代谢与分子医学教育部重点实验室代谢与分子医学教育部重点实验室 东安路东安路130号号7号楼号楼329 Tel：54237798 Email： 目录目录 How Cells Read the Genome: From DNA to Protein DNA encodes hereditary information (genotype) - decoded into RNA

2、 - protein (phenotype) DNA Protein RNA Transcription Translation 目录目录 TRANSCRIPTION TRANSLATION DNA Ribosome Polypeptide mRNA Prokaryotic cell 目录目录 DNA Pre-mRNA Nuclear envelope mRNA Ribosome Polypeptide TRANSLATION TRANSCRIPTION RNA PROCESSING Prokaryotic cell Eukaryotic cell TRANSCRIPTION TRANSLAT

3、ION DNA mRNA Ribosome Polypeptide 目录目录 第一节第一节 RNARNA合成概述合成概述 转录模板转录模板 RNARNA聚合酶聚合酶 第二节第二节 原核生物的转录过程原核生物的转录过程 原核生物转录的起始原核生物转录的起始 原核生物转录的延长原核生物转录的延长 原核生物转录的终止原核生物转录的终止 第三节第三节 真核生物真核生物RNARNA的生物合成的生物合成 真核生物转录的起始真核生物转录的起始 真核生物转录的延长真核生物转录的延长 真核生物转录的终止真核生物转录的终止 第四节第四节 真核生物的转录后加工真核生物的转录后加工 第五节第五节 微微RNARNA的生

4、物合成的生物合成 目录目录 RNA的生物合成的生物合成是指将单核苷酸聚合成核是指将单核苷酸聚合成核 糖核酸链的过程，也称为糖核酸链的过程，也称为转录转录 (transcription) ， 转录将转录将DNA的碱基序列转抄成的碱基序列转抄成RNA序列序列。 转转 录录 RNADNA 目录目录 基因表达基因表达 (gene expression) 是新合成的是新合成的 RNA进一步参与、指导蛋白质合成的过程，使进一步参与、指导蛋白质合成的过程，使 生物体的遗传信息从基因的储存状态转变为工生物体的遗传信息从基因的储存状态转变为工 作状态作状态, 基因表达也包含基因表达也包含RNA的生物合成的生物合

5、成。 目录目录 RNA合成概述合成概述 第一节第一节 目录目录 在生物界，在生物界，RNARNA合成有两种方式：合成有两种方式： 一是一是DNA指导的指导的RNA合成（合成（DNA-dependent RNA synthesis)，也叫，也叫转录转录。此为生物体内主要的合成方式。此为生物体内主要的合成方式。 另一种是另一种是RNA指导的指导的RNA合成合成(RNA-dependent RNA synthesis)，也叫，也叫RNA复制复制(RNA replication)。常见于。常见于 RNA病毒。病毒。 一、一、RNARNA合成方式合成方式 目录目录 n参与转录的物质：参与转录的物质： 原

6、料原料: : NTP (ATP, GTP, CTP, UTP) 模板模板: : DNA 酶酶 : : RNA聚合酶聚合酶(RNA polymerase, RNA pol) 其他蛋白质因子其他蛋白质因子 合成方向合成方向: : 5 35 3 目录目录 二、转录模板与聚合酶二、转录模板与聚合酶 （一）、转录模板（一）、转录模板 DNA双链中按碱基配对规律能指引转录生成双链中按碱基配对规律能指引转录生成RNA 的一股单链，称为的一股单链，称为模板链模板链(template strand)，也称，也称 作作Watson链链。相对的另一股单链是。相对的另一股单链是非模板链非模板链 (nontemplat

7、e strand)，也称为，也称为编码链编码链(coding strand) 、或或Crick链链。 目录目录 目录目录 / 转录模板及其转录过程转录模板及其转录过程 目录目录 DNA分子上能转录出分子上能转录出RNA的区段，称为的区段，称为结构基结构基 因因(structural gene)。 转录是以转录是以不对称转录不对称转录(asymmetric transcription) 的方式完成的，它有两方面含义：一是某个基因的方式完成的，它有两方面含义：一是某个基因 的的DNA双链中，只有一股链可作为模板指引转双链中，只有一股链可作为模板指

8、引转 录；二是基因组录；二是基因组DNA双链均可作为模板，并不双链均可作为模板，并不 只限于某一条链。只限于某一条链。 目录目录 （二）（二）RNA pol DNA依赖的依赖的RNA聚合酶聚合酶(DNA-dependent RNA polymerase)催化合成催化合成RNA； RNA合成的化学机制与合成的化学机制与DNA依赖的依赖的DNA聚合酶聚合酶 催化催化DNA合成相似。合成相似。 RNA pol的催化机制的催化机制 ( NMP )n + NTP ( NMP ) n+1 + PPi 目录目录 1. 原核生物原核生物RNA pol 目录目录 核心酶核心酶 (core enzyme) 全酶全

9、酶 (holoenzyme) 转录起始阶段转录起始阶段转录延长阶段转录延长阶段 w w 目录目录 RNARNA聚合酶聚合酶核心酶核心酶(core enzymes)(core enzymes)：大肠埃希：大肠埃希 菌的菌的RNA RNA polpol是由是由5 5种亚基种亚基2, , 2, , , w , w 和和 组组 成的六聚体蛋白，其中成的六聚体蛋白，其中2 2 (w)w)亚基组成亚基组成 的五聚体称为核心酶。核心酶可以催化转录的五聚体称为核心酶。核心酶可以催化转录 中中RNARNA链的延长。链的延长。 全酶全酶( (holoenzymeholoenzyme): ):核心酶加上核心酶加上

10、亚基称为全酶亚基称为全酶 ，全酶能与特定的起始位点结合并启动转录，全酶能与特定的起始位点结合并启动转录 。 目录目录 n 真核生物具有真核生物具有3种不同的种不同的RNA聚合酶聚合酶: RNA聚合酶聚合酶（RNA Pol） RNA聚合酶聚合酶（RNA Pol） RNA聚合酶聚合酶（RNA Pol ） 2 2、真核生物、真核生物RNA RNA PolPol 目录目录 3种真核生物种真核生物RNA Pol都是超过都是超过500,000的大分子的大分子 蛋白质，大约由蛋白质，大约由12个亚基组成，其中有个亚基组成，其中有2个大亚个大亚 基和若干小亚基。基和若干小亚基。 酶分子中某些亚基与大肠埃希菌酶

11、分子中某些亚基与大肠埃希菌RNA pol核心酶核心酶 亚基的序列有同源性。亚基的序列有同源性。 目录目录 羧基末端结构域羧基末端结构域 (carboxyl-terminal domain, CTD) 真核生物真核生物RNA Pol RNA Pol 最大亚基的羧基末端有一最大亚基的羧基末端有一 段共有序列为段共有序列为Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser重复序列重复序列 片段。片段。 这一序列仅存在于这一序列仅存在于RNA Pol IIRNA Pol II中。中。 所有真核生物的所有真核生物的RNA Pol IIRNA Pol II都具有都具有CTDCTD，只是共有序列，只是共

12、有序列 的重复程度不同。的重复程度不同。 磷酸化和去磷酸化的磷酸化和去磷酸化的CTDCTD在转录不同阶段发挥作用。在转录不同阶段发挥作用。 目录目录 原核生物的转录过程原核生物的转录过程 The Process of Transcription in Prokaryote 第二节第二节 目录目录 （一）启动子（一）启动子 操纵子操纵子(operon)是原核生物中一个相对独立的转是原核生物中一个相对独立的转 录区段，包括若干个基因的编码区及其上游录区段，包括若干个基因的编码区及其上游 (upstream)的调控序列。的调控序列。 转录起始点上游的调控序列中有一段特定的序转录起始点上游的调控序列中

13、有一段特定的序 列可被列可被RNA pol识别并结合，称为识别并结合，称为启动子启动子 (promoter)。 5 3 3 5 结构基因结构基因调控序列调控序列 RNA-pol 一、原核生物转录的起始一、原核生物转录的起始 目录目录 目录目录 调控序列中的启动子是调控序列中的启动子是RNA聚合酶结合模板聚合酶结合模板DNA 的部位，也是控制转录的关键部位。原核生物以的部位，也是控制转录的关键部位。原核生物以 RNA聚合酶全酶结合到聚合酶全酶结合到DNA的启动子上而起动转的启动子上而起动转 录，其中由录，其中由亚基辨认启动子，其他亚基相互配合。亚基辨认启动子，其他亚基相互配合。 对启动子的研究，

14、常采用一种巧妙的方法即对启动子的研究，常采用一种巧妙的方法即RNA pol保护法保护法。 目录目录 nRNA pol 保护法保护法 n用用RNA聚合酶保护法研究转录起始区聚合酶保护法研究转录起始区 启动子的结构启动子的结构 目录目录 0 25 50 75 100 Frequency of nucleotides at each position (%) G A T C TTAGCATATAAT 15-19 nucleotides-35-10 目录目录 共有序列：共有序列：原核生物基因各操纵子转录上游区段的序原核生物基因各操纵子转录上游区段的序 列有一致性，列有一致性，-35-35区的共有序列是

15、区的共有序列是TTGACATTGACA，-10-10区的共区的共 有序列是有序列是TATAATTATAAT，又名又名PribnowPribnow盒（盒（PribnowPribnow box)box)。 识别序列识别序列: : -35-35区是原核生物转录起始时区是原核生物转录起始时RNA polRNA pol的识别的识别 序列，一旦序列，一旦RNA polRNA pol识别并与此序列结合后即向下游移识别并与此序列结合后即向下游移 动至动至PribnowPribnow盒，形成相对稳定的酶盒，形成相对稳定的酶-DNA-DNA复合物而开始复合物而开始 转录。转录。 目录目录 转录起始是指转录起始是指

16、RNA pol识别并结合到识别并结合到DNA 模板上，然后模板上，然后DNA 双链局部解开，再加入第双链局部解开，再加入第 1个个NTP形成转录起始复合物的过程。形成转录起始复合物的过程。 （二）转录起始（二）转录起始 目录目录 2. DNA双链局部解开，形成双链局部解开，形成开放转录复合物开放转录复合物 (open transcription complex) ；在；在RNA聚合酶聚合酶 作用下发生第一次聚合反应，形成首个磷酸二作用下发生第一次聚合反应，形成首个磷酸二 酯键：酯键： 1. RNA聚合酶全酶依赖聚合酶全酶依赖 因子因子与启动子结合，形与启动子结合，形 成成闭合转录复合物闭合转录

17、复合物(closed transcription complex) ； 5 -pppG -OH + NTP 5 -pppGpN - OH 3 + ppi n转录起始过程：转录起始过程： n大肠埃希菌转录的起始、延长及终止过程大肠埃希菌转录的起始、延长及终止过程 目录目录 转录全过程，转录全过程，DNA模板解链范围通常是模板解链范围通常是17+1。 与复制不同，转录起始无需引物。与复制不同，转录起始无需引物。 第一个磷酸二酯键生成后，第一个磷酸二酯键生成后，亚基即从转录起亚基即从转录起 始复合物上脱落，核心酶连同始复合物上脱落，核心酶连同5-pppGpN- OH-3，继续结合于，继续结合于DNA

18、模板上，酶沿模板上，酶沿DNA 链前移，进入延长阶段。链前移，进入延长阶段。 转录起始复合物：转录起始复合物： RNA-pol ( 2) - DNA - pppGpN- OH 3 目录目录 复制复制转录转录 模板模板两股链均复制两股链均复制模板链转录（不对称转录）模板链转录（不对称转录） 原料原料dNTPNTP 酶酶DNA聚合酶聚合酶RNA聚合酶聚合酶 产物产物子代双链子代双链DNA (半保留复制半保留复制) 单链单链RNA 配对配对A-T, G-CA-U, T-A, G-C 引物引物需要需要不需要不需要 复制和转录的比较复制和转录的比较 目录目录 二、二、 原核生物转录的延长原核生物转录的延

19、长 1. 亚基脱落，亚基脱落，RNA pol核心酶变构，与模板结核心酶变构，与模板结 合松弛，沿着合松弛，沿着DNA模板前移；模板前移； 2. 在在核心酶核心酶作用下，作用下，NTP不断聚合，不断聚合，RNA链链 不断延长。不断延长。 (NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPi RNA pol-DNA-RNA转录复合物（转录空泡）转录复合物（转录空泡） 配对的方式和稳定性配对的方式和稳定性: GCA=TA=U 目录目录 目录目录 n原核生物转录过程中的共翻译现象原核生物转录过程中的共翻译现象 在同一在同一DNA模板上，有多个转录同时在进行；模板上，有多个转录同时在进行； 转录尚

20、未完成，翻译已在进行。转录尚未完成，翻译已在进行。 这种形状说明：这种形状说明： 目录目录 n原核生物转录过程中的共翻译现象原核生物转录过程中的共翻译现象 目录目录 依赖依赖Rho 因子的转录终止因子的转录终止 非依赖非依赖Rho因子的转录终止因子的转录终止 三、原核生物转录三、原核生物转录 的终止的终止 n依据是否需要蛋白质因子的参与，原核生物依据是否需要蛋白质因子的参与，原核生物 转录终止分为：转录终止分为： 目录目录 （一）（一） 不依赖不依赖 因子的转录终止因子的转录终止 此种转录终止方式无需外加因子参与，此种转录终止方式无需外加因子参与， 核心酶能在特定位点上停止转录，这些位点核心酶

21、能在特定位点上停止转录，这些位点 被称为内源性终止子（被称为内源性终止子（intrinsic terminator)。 目录目录 5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3 5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3 RNA 5 TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT. 3 DNA (coding strand) UUUU. UUUU. 5UUGCAGCCUGACAA

22、AUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3 结构特征结构特征1：DNA模板靠近转录终止处有回文结模板靠近转录终止处有回文结 构，能形成发夹构，能形成发夹(hairpin)结构，且富含结构，且富含GC配对。配对。 目录目录 结构特征结构特征2：DNA 模板转录终止点有高模板转录终止点有高 度保守的度保守的3A重复序列重复序列 ，导致其转录产物的，导致其转录产物的 3末端常有末端常有6个以上连个以上连 续的续的U，与发夹结构一，与发夹结构一 起阻止转录继续进行起阻止转录继续进行. 目录目录 原核生物转录终止蛋白，原核生物转录终止蛋白，有有ATP酶活性

23、和解酶活性和解 螺旋酶螺旋酶(helicase)的活性。的活性。在依赖在依赖r r因子的转因子的转 录终止中需要录终止中需要r r因子参与。因子参与。 因子是由相同亚基组成的六聚体蛋白质，因子是由相同亚基组成的六聚体蛋白质， 亚基分子量亚基分子量46kD。 因子能结合因子能结合RNA，又以对，又以对poly C的结合力的结合力 最强。最强。 （二）依赖（二）依赖因子的转录终止因子的转录终止 n因子：因子： 目录目录 rut位点：新合成的RNA在转录终止点上游出现富含C的序列, 能够被r因子识别和结合，促使转录终止。 n依赖依赖因子的转录终止因子的转录终止 r r因子到达转录空泡将因子到达转录空

24、泡将RNARNA水水 解下来这一过程，发挥了解下来这一过程，发挥了ATPATP 酶活性及酶活性及ATPATP依赖性依赖性RNA-RNA- DNADNA解旋酶活性。解旋酶活性。 目录目录 目前认为，目前认为，因子终止转录的作用是：与因子终止转录的作用是：与RNA转转 录产物结合，结合后录产物结合，结合后因子和因子和RNA聚合酶都可发聚合酶都可发 生构象变化，从而使生构象变化，从而使RNA聚合酶停顿，解螺旋聚合酶停顿，解螺旋 酶的活性使酶的活性使DNA/RNA杂化双链拆离，利于产物杂化双链拆离，利于产物 从转录复合物中释放从转录复合物中释放 。 目录目录 转录，模板，模板链，编码链，不对称转录转录

25、，模板，模板链，编码链，不对称转录 原核生物原核生物RNA Pol：核心酶和全酶：核心酶和全酶, 因子因子 真核生物真核生物RNA Pol：I, II, III, 羧基末端结构域羧基末端结构域 (CTD) 原核生物转录过程：原核生物转录过程： 目录目录 真核生物真核生物RNARNA的生物合成的生物合成 The Process of Transcription in Eukaryote 第三节第三节 目录目录 真核生物真核生物RNA Pol不能直接与模板不能直接与模板DNA结合，结合， 需要辅助因子协助。需要辅助因子协助。 真核生物真核生物DNA模板位于核内，转录产物必须转模板位于核内，转录产物

26、必须转 运出核外才能作为翻译模板。运出核外才能作为翻译模板。 真核生物转录产物必须经过加工才能成为有功真核生物转录产物必须经过加工才能成为有功 能的产物。能的产物。 n真核生物基因序列示意图真核生物基因序列示意图: 目录目录 真核生物转录起始点上游真核生物转录起始点上游-25区常有共同的区常有共同的 TATAAAA序列，称为序列，称为TATA盒盒(TATA box)， 与转录起始点一起形成与转录起始点一起形成核心启动子核心启动子。 转录起始点序列也称为转录起始点序列也称为起始子起始子 (initiator, Inr)。 一、真核生物转录的起始一、真核生物转录的起始 目录目录 目录目录 启动子上

27、游元件启动子上游元件是位于是位于TATA盒上游的盒上游的DNA序列，序列， 多在转录起始点上游约多在转录起始点上游约-40-100nt的位置，比较的位置，比较 常见的是常见的是GC盒和盒和CAAT盒。盒。 增强子增强子(enhancer)是能够结合特异基因调节蛋白，是能够结合特异基因调节蛋白， 促进邻近或远隔特定基因表达的促进邻近或远隔特定基因表达的DNA序列。序列。 真核生物转录起始点上游具有调控转录功能的真核生物转录起始点上游具有调控转录功能的 DNA序列，如启动子，启动子上游元件和增强子序列，如启动子，启动子上游元件和增强子 等，这些序列统称为等，这些序列统称为顺式作用元件顺式作用元件(

28、cis-acting element)。 目录目录 UAS = upstream activator sequence RE = regulatory elements INR = initiator sequence DPE = downstream promoter elements 目录目录 （一）（一） 转录因子转录因子 能直接或间接识别和结合启动子顺式作用元件，能直接或间接识别和结合启动子顺式作用元件， 以参与或调控真核生物转录起始过程的蛋白质以参与或调控真核生物转录起始过程的蛋白质 称为称为转录因子转录因子(transcriptional factor, TF), 也称也称 为为反

29、式作用因子反式作用因子(trans-acting factors)。 反式作用因子中，直接或间接结合反式作用因子中，直接或间接结合RNA Pol的，的， 则称为则称为通用转录因子通用转录因子(general transcriptional factors, TF)。 目录目录 上游因子上游因子（upstream factor): 真核基因的转录起真核基因的转录起 始过程中有一些与启动子上游原件如始过程中有一些与启动子上游原件如GC盒，盒， CAAT盒等顺式作用原件结合的蛋白质。盒等顺式作用原件结合的蛋白质。 可诱导因子可诱导因子（inducible factor): 在某些特殊生理在某些特殊生

30、理 或病理情况下被诱导产生的反式作用因子，参与或病理情况下被诱导产生的反式作用因子，参与 调控真核基因的转录起始过程。调控真核基因的转录起始过程。 目录目录 起始子起始子 TATATATA盒盒 核心启动子核心启动子 GCGC盒盒 CAATCAAT盒盒 启动子上启动子上游元件游元件 （近端）（近端） 增强子增强子远端调控序列远端调控序列 顺式作用原件顺式作用原件 ciscis-acting element-acting element 上游因子上游因子 可诱导因子可诱导因子 转录因子转录因子 oror 反式作用因子反式作用因子 transtrans-acting factor-acting fa

31、ctor 通用转录因子通用转录因子 oror 基本转录因子基本转录因子 参与参与RNA-pol转录起始的转录起始的TF 目录目录 型基因中的四类转录因子型基因中的四类转录因子 转录因子转录因子 具体组分具体组分 结合序列结合序列 功能功能 基本组分基本组分 TBP,TFA,B, E,G,F和和H TBP结合结合 TATA盒盒 转录起始定位；转录起始定位； 转转 录起始和延长录起始和延长 辅激活因子辅激活因子 TAFs和中介和中介 子子 在可诱导因子和上游在可诱导因子和上游 因子与通用转录因子因子与通用转录因子 /RNA聚合酶结合中聚合酶结合中 起联结和中介作用起联结和中介作用 上游因子上游因子

32、 SP1、ATF、 CTF等等 启动子上游启动子上游 元件元件 协助通用转录因子，协助通用转录因子， 提高转录效率和专一提高转录效率和专一 性性 可诱导因子可诱导因子 如如MyoD、 HIF-1等等 增强子等远增强子等远 隔调控序列隔调控序列 时间和空间（组织）时间和空间（组织） 特异性地调控转录特异性地调控转录 TBP: TATA binding protein; TAF: TBP associated factor 目录目录 目录目录 （二）（二） 转录起始转录起始 真核生物真核生物RNA-pol不与不与DNA分子直接结合，分子直接结合， 而需依靠众多的转录因子，形成而需依靠众多的转录因子

33、，形成转录前起始复合转录前起始复合 物物(pre-initiation complex, PIC) 。 nRNA pol II 催化的催化的 转录过程转录过程 TFIIHTFIIH具有解旋酶和蛋白激酶活性，具有解旋酶和蛋白激酶活性， 使使CTDCTD磷酸化磷酸化 目录目录 二二 、真核生物转录的延长、真核生物转录的延长 真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，真核生物转录延长过程与原核生物大致相似， 但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。 需要延长因子协助。需要延长因子协助。 RNA Pol前移处处都遇上核小体。前移处处都遇上核小体。 转录延长过程

34、中可以观察到核小体移位和解聚转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚 现象。现象。 转转 录录 延延 长长 中中 的的 核核 小小 体体 移移 位位 目录目录 RNA-Pol RNA-Pol RNA-Pol nucleosome moving direction 目录目录 三、真核生物转录的终止三、真核生物转录的终止 真核生物的转录终止，是和转录后修饰密切相真核生物的转录终止，是和转录后修饰密切相 关的。关的。 真核生物真核生物mRNA有聚腺苷酸有聚腺苷酸(poly A)尾巴结构，尾巴结构， 是转录后才加进去的。是转录后才加进去的。 转录不是在转录不是在poly A的位置上终止，而是超出数的位

35、置上终止，而是超出数 百个乃至上千个核苷酸后才停顿。已发现，在百个乃至上千个核苷酸后才停顿。已发现，在 读码框架的下游，常有一组共同序列读码框架的下游，常有一组共同序列AATAAA， 再下游还有相当多的再下游还有相当多的GT序列。这些序列称为序列。这些序列称为 转录终止的修饰点转录终止的修饰点。 n真核生物的转录终止及加尾修饰真核生物的转录终止及加尾修饰 目录目录 RNA RNA PolPol没有校对功能的没有校对功能的3-53-5核酸外切酶活核酸外切酶活 性，因此转录产物中发生差错比复制多。由于一性，因此转录产物中发生差错比复制多。由于一 个基因可转录出多个个基因可转录出多个RNA,RNA,

36、且转录产物有一定的半且转录产物有一定的半 寿期，最终会被清除，故转录产生的差错对细胞寿期，最终会被清除，故转录产生的差错对细胞 的影响比复制少得多。的影响比复制少得多。 目录目录 Cold-inducible Zfp516 activates UCP1 transcription to promote browning of white fat and development of brown fat. Molecular Cell, 2015, 57, 235. Reporter AssayReporter Assay 荧光素酶报告基因分析荧光素酶报告基因分析 目录目录 Chromatin

37、Chromatin ImmunoprecipitationImmunoprecipitation 染色质免疫沉淀染色质免疫沉淀 ( (ChIPChIP) ) Gel Shift AssayGel Shift Assay ElectrophoreticElectrophoretic Mobility Shift Assay Mobility Shift Assay 电泳迁移率改变分析电泳迁移率改变分析 Molecular Cell, 2015, 57, 235. 目录目录 真核生物的转录后加工真核生物的转录后加工 Post-transcriptional Modification of Euka

38、ryotic RNA 第四节第四节 目录目录 真核生物转录生成的真核生物转录生成的RNA分子是初级分子是初级RNA转转 录物录物(primary RNA transcript)，几乎所有的初，几乎所有的初 级级RNA转录物都要经过加工，才能成为具有功转录物都要经过加工，才能成为具有功 能的成熟的能的成熟的RNA。 加工主要在细胞核中进行。加工主要在细胞核中进行。 目录目录 一、一、mRNA的转录后加工的转录后加工 （一）（一）5-端的修饰端的修饰 大多数真核大多数真核mRNA的的5-末端有末端有7-甲基鸟嘌呤甲基鸟嘌呤 的帽结构。的帽结构。 这个真核这个真核mRNA加工过程的起始步骤由加工过程

39、的起始步骤由5-帽帽 合成酶合成酶(capping enzyme)催化完成，它是由催化完成，它是由鸟鸟 苷酸转移酶（苷酸转移酶（guanylytransferase)和和甲基转移甲基转移 酶酶(methyltransferase) 形成的复合体，与形成的复合体，与RNA Pol的的CTD末端相结合。末端相结合。 目录目录 n5-帽结构：帽结构： 5帽合成酶：鸟苷酸转移酶 鸟嘌呤-7-甲基转移酶 n5-帽结构的合成：帽结构的合成： n5-帽结构在帽结构在CTD 末端合成：末端合成： cap-binding protein 目录目录 n帽子结构的意义：帽子结构的意义： 可以使可以使mRNA免遭核酸

40、酶的攻击；免遭核酸酶的攻击； 与帽结合蛋白质复合体与帽结合蛋白质复合体(cap-binding complex of protein)结合，并参与结合，并参与mRNA和核糖体的结合，和核糖体的结合， 启动蛋白质的生物合成。启动蛋白质的生物合成。 目录目录 尾部修饰是和转录终止同时进行的过程。尾部修饰是和转录终止同时进行的过程。 poly A的有无与长短，是维持的有无与长短，是维持mRNA作为翻译模作为翻译模 板的活性，以及增加板的活性，以及增加mRNA本身稳定性的因素。本身稳定性的因素。 一般真核生物在胞浆内出现的一般真核生物在胞浆内出现的mRNA，其，其poly A 长度为长度为100至至2

41、00个核苷酸之间，也有少数例外。个核苷酸之间，也有少数例外。 （二）（二）3-poly (A)的添加的添加 真核真核mRNA 3-poly(A)的生成过程的生成过程 聚腺苷酸化特异性因子，CPSF 断裂激动因子，CStF 断裂因子I/II，CF I/II 多聚腺苷酸聚合酶， PAP 多聚腺苷酸结合蛋白II，PAB II 目录目录 目录目录 DNA分子上能转录出分子上能转录出RNA的区段，称为的区段，称为结构基因结构基因 (structural gene)。 断裂基因断裂基因(splite gene)： 真核生物结构基因由若干真核生物结构基因由若干 个外显子和内含子互相间隔连接而成，其转录产物个

42、外显子和内含子互相间隔连接而成，其转录产物 去除内含子再连接后，可转变为成熟去除内含子再连接后，可转变为成熟mRNAmRNA，后者，后者 才能作为翻译模板，这样的基因称为断裂基因。才能作为翻译模板，这样的基因称为断裂基因。 CABD 外显子外显子 A、B、C、D 内含子内含子 （三）（三）mRNA的剪接与剪切的剪接与剪切 目录目录 外显子外显子(exon)和内含子和内含子(intron) 外显子：外显子：在真核生物初级转录产物及成熟在真核生物初级转录产物及成熟mRNA 中均出现的核酸序列。中均出现的核酸序列。 内含子：内含子：真核生物基因中隔断基因的线性表达而真核生物基因中隔断基因的线性表达而

43、 在剪接过程中被除去的核酸序列。在剪接过程中被除去的核酸序列。 卵卵 清清 蛋蛋 白白 基基 因因 及及 其其 转转 录、录、 转转 录录 后后 加加 工工 目录目录 鸡卵清蛋白成熟鸡卵清蛋白成熟mRNA与与DNA杂交电镜图杂交电镜图 DNA mRNA 目录目录 目录目录 mRNA的剪接的剪接 除去除去hnRNAhnRNA中的内含子，将外显子连接。中的内含子，将外显子连接。 剪接中的二次转酯反应剪接中的二次转酯反应 目录目录 snRNP: mRNA剪接是在剪接体上进行的，它是剪接是在剪接体上进行的，它是 一种核内特异的一种核内特异的RNA-蛋白质复合体蛋白质复合体,称为核小核称为核小核 糖核蛋白颗粒。糖核蛋白颗粒。 每一种每一种snRNP含有一种核小含有一种核小RNA（small nuclear RNA,