临床生物化学检验常用技术__廖国玲

1、1 临床生物化学检验临床生物化学检验 常用技术常用技术 第三章第三章 2 本章主要内容本章主要内容 第一节第一节 光谱分析技术光谱分析技术 第二节第二节 电化学分析技术电化学分析技术 第三节第三节 干化学分析技术干化学分析技术 第四节第四节 电泳分析技术电泳分析技术 第五节第五节 基因扩增技术基因扩增技术 3 n教学目标和要求教学目标和要求 掌握掌握 1.1.光谱分析技术的基本原理及定性和定量方法。光谱分析技术的基本原理及定性和定量方法。 2.2.电位分析法的概念，离子选择性电极的结构及电位分析法的概念，离子选择性电极的结构及 类型。类型。 3.3.基因扩增技术的原理、反应体系的组成及注意基因

2、扩增技术的原理、反应体系的组成及注意 事项。事项。 熟悉：熟悉： 影响光谱分析技术、电泳技术的因素影响光谱分析技术、电泳技术的因素 各种分析技术在生化检验中的应用。各种分析技术在生化检验中的应用。 4 第一节第一节 光谱分析技术光谱分析技术 本节主要内容本节主要内容 一、一、光谱分析技术的基本光谱分析技术的基本 原理原理 二、光谱分析技术在临床二、光谱分析技术在临床 生物化学检验中的应用生物化学检验中的应用 补充：补充：分光光度计的基本分光光度计的基本 结构、操作方法结构、操作方法 5 一、光谱分析技术的基本原理：一、光谱分析技术的基本原理： 利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱谱系的特

3、利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱谱系的特 征，以此来确定物质性质、结构或含量。征，以此来确定物质性质、结构或含量。 n光谱分析技术分类：光谱分析技术分类： 发射光谱分析技术：发射光谱分析技术：火焰光度法、原子发射光谱法和荧光光谱法火焰光度法、原子发射光谱法和荧光光谱法 吸收光谱分析技术：吸收光谱分析技术：紫外、可见光分光光度法，原子吸收分光光紫外、可见光分光光度法，原子吸收分光光 度法和红外光谱法度法和红外光谱法 散射光谱分析技术：散射光谱分析技术：比浊法比浊法 6 （一）分光光度技术的基本原理（一）分光光度技术的基本原理 1. 1. 吸光度与透光度吸光度与透光度 A = -lgT

4、= -lgI/I0 = lgI0/I 当当 时，一部分光被散射；时，一部分光被散射； 一部份光被吸收；一部份光被吸收； 另有一部分光透过溶液。另有一部分光透过溶液。 设入射光强度为设入射光强度为I0I0，透射光强度为，透射光强度为I I，I I和和I I0 0之比称为透光之比称为透光 度度，表示透过光强度与入射光强度的比值即：表示透过光强度与入射光强度的比值即： T = I/I0 T T100100为为T%T%称为百分透光度。透光度的负对数称为吸光度称为百分透光度。透光度的负对数称为吸光度 即：即： 光线通过溶液光线通过溶液 7 完全吸收完全吸收 完全透过完全透过 吸收黄色光吸收黄色光 光谱示

5、意光谱示意表观现象示意表观现象示意复合光复合光 8 J朗伯朗伯- -比尔定律：比尔定律： I I0 0： ：入射光强度 入射光强度 C:C:溶液浓度溶液浓度 b:b:液层厚度液层厚度 I:I:透射光强度透射光强度 T:T:透光度透光度 A:A:吸光度吸光度 k:k:吸光系数吸光系数 kbc I I T 10 0 kbc TI I I I TA 1 lglglglg 0 0 b I0I 2. Lambert-Beer定律定律 9 Lambert-Beer定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层 厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础。厚度之间关系的

6、基本定律，该定律是分光分析的理论基础。 其表达式为：其表达式为： A = KLC 式中式中A为吸光度；为吸光度；K为比例常数，称为吸光系数；为比例常数，称为吸光系数；L为为 溶液层厚度，称为光径；溶液层厚度，称为光径；C为溶液浓度为溶液浓度 （Lambert-Beer定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀 非散射的液体。）非散射的液体。） 表示：吸光度与和溶液中吸光物质的浓度表示：吸光度与和溶液中吸光物质的浓度C和溶液的厚度和溶液的厚度L 的乘积成正比。的乘积成正比。 10 当溶液浓度当溶液浓度C的单位为的单位为g/L，溶液液层厚度，溶液液层厚度L的的 单

7、位为单位为cm时，时，K叫叫“吸光系数吸光系数”，用，用表示。其单表示。其单 位为位为L/gcm 当溶液浓度当溶液浓度C的单位为的单位为mol/L，溶液液层厚度，溶液液层厚度L 的单位为的单位为cm时，时，K叫叫“摩尔吸光系数摩尔吸光系数”，用，用 （psilon）表示。）表示。 其单位为其单位为L/molcm，此时：，此时： A= LC 的意义是：当液层厚度为的意义是：当液层厚度为1cm，物质浓度为，物质浓度为 1mol/L时在特定波长下的吸光度值。时在特定波长下的吸光度值。 11 是物质的特征性常数。是物质的特征性常数。 摩尔吸光系数越大，表示物质对波长为摩尔吸光系数越大，表示物质对波长为

8、的光的的光的 吸收能力越强，同时在分光光度法中测定的灵敏度吸收能力越强，同时在分光光度法中测定的灵敏度 也越大。也越大。 吸光系数大小取决于吸光系数大小取决于吸光物质的性质、入射光的波长吸光物质的性质、入射光的波长 及温度。及温度。 （1）物质不同，吸光系数不同。属于物质的特征常）物质不同，吸光系数不同。属于物质的特征常 数。数。 （2）溶剂不同，同一物质吸光系数也不同。）溶剂不同，同一物质吸光系数也不同。 （3）光波长不同，吸光系数不同。）光波长不同，吸光系数不同。 12 吸收定律的适用条件：吸收定律的适用条件： 必须是使用必须是使用单色光单色光为入射光；为入射光； 溶液为溶液为稀稀溶液；溶

9、液； 吸收定律能够用于彼此不相互作用的吸收定律能够用于彼此不相互作用的 多组分溶液。多组分溶液。 吸光度的加和性：吸光度的加和性：A总 总= A1+ A2+ A3+ An 溶液中有多种吸光物质时，总吸光度溶液中有多种吸光物质时，总吸光度 等于各吸光物质吸光度总和。等于各吸光物质吸光度总和。 13 （二）原子吸收分光光度法（二）原子吸收分光光度法（Atomic Absorption Spectrometry, AAS） 基本原理：基本原理：根据待测元素的气态原子，能吸收同根据待测元素的气态原子，能吸收同 种原子所发射的特征光辐射，吸收特征符合种原子所发射的特征光辐射，吸收特征符合Lambert-

10、 beer定律，即一定条件下，原子的吸光度同待测元素定律，即一定条件下，原子的吸光度同待测元素 基态原子的浓度成正比，计算出试样中待测元素的含基态原子的浓度成正比，计算出试样中待测元素的含 量，这种方法称为原子吸收光谱法。量，这种方法称为原子吸收光谱法。 14 四大部分组成：光源、单色器、原子化器、检测器。四大部分组成：光源、单色器、原子化器、检测器。 15 q1. 选择性高，干扰少。共存元素对待测元素干扰少，选择性高，干扰少。共存元素对待测元素干扰少， 一般不需分离共存元素。一般不需分离共存元素。 v原子吸收分光光度法特点：原子吸收分光光度法特点： q2. 灵敏度高。火焰原子化法：灵敏度高。

11、火焰原子化法：10-9g/mL；石墨炉：；石墨炉： 10-13g/mL 。 q3. 测定的范围广。测定测定的范围广。测定70多种元素。多种元素。 q4. 分析速度快。分析速度快。 q5. 精密度、准确度高。精密度、准确度高。火焰法火焰法误差误差1% ，石墨炉法，石墨炉法 3%-5。 16 v原子吸收分光光度法与紫外可见吸收光度法异同点原子吸收分光光度法与紫外可见吸收光度法异同点 p相同点：相同点： 1）都是依据样品对入射光的吸收进行测量的。）都是依据样品对入射光的吸收进行测量的。 2）两种方法都遵循朗伯）两种方法都遵循朗伯-比耳定律。比耳定律。 3）就设备而言，均由四大部分组成，即光源、单色器

12、、）就设备而言，均由四大部分组成，即光源、单色器、 吸收池（或原子化器）、检测器。吸收池（或原子化器）、检测器。 17 1. 在可见、紫外分光光度法中，吸光物质是溶液在可见、紫外分光光度法中，吸光物质是溶液 中中被测物质的分子或离子被测物质的分子或离子对光的选择吸收，原子吸对光的选择吸收，原子吸 收光谱法吸光物质是待测元素的收光谱法吸光物质是待测元素的基态原子基态原子对光的选对光的选 择吸收，这种择吸收，这种光是由待测元素制成的空心阴极灯光是由待测元素制成的空心阴极灯 ( (称元素灯称元素灯) )作光源作光源。 2. 单色器与吸收池的位置不同。单色器与吸收池的位置不同。 紫外可见：光源紫外可见

13、：光源单色器单色器比色皿。比色皿。 原子吸收：光源原子吸收：光源原子化器原子化器单色器。单色器。 p异同点：异同点： 18 二、光谱分析技术在临床生物化学检验中二、光谱分析技术在临床生物化学检验中 的应用的应用 （一）分光光度技术的定性方法（一）分光光度技术的定性方法 u定性依据：定性依据： 最大吸收波长最大吸收波长maxmax和摩尔吸光系数和摩尔吸光系数 2.2.摩尔消光系数摩尔消光系数方法方法 1.1.最大吸收波长最大吸收波长maxmax方法方法 确定是什么物质确定是什么物质 19 （二）分光光度技术的定量方法（二）分光光度技术的定量方法 1.1.标准曲线法标准曲线法 根据根据Lamber

14、t-Beer定律，液体的浓度在一定范定律，液体的浓度在一定范 围内与吸光度成正比关系。配制一系列浓度的标准围内与吸光度成正比关系。配制一系列浓度的标准 品溶液（浓度应包含高、中、低浓度范围），按标品溶液（浓度应包含高、中、低浓度范围），按标 本处理方法作相同处理，在特定波长下测定吸光度，本处理方法作相同处理，在特定波长下测定吸光度， 以标准液浓度为横座标，以吸光度为纵座标以标准液浓度为横座标，以吸光度为纵座标，按最，按最 小二乘法的原理，将对应各点连成一条通过原点的小二乘法的原理，将对应各点连成一条通过原点的 直线，这条直线称为标准曲线。待测溶液测定吸光直线，这条直线称为标准曲线。待测溶液测定

15、吸光 度后，从标准曲线上可查出其相应的浓度。度后，从标准曲线上可查出其相应的浓度。 u方法：方法： 确定有多少物质（浓度）确定有多少物质（浓度） 20 21 u制作和应用标准曲线时应注意下面几点：制作和应用标准曲线时应注意下面几点： （1 1）测定条件发生变化时（如更换标准品和试剂等），应重新）测定条件发生变化时（如更换标准品和试剂等），应重新 绘制。绘制。 （2 2）标准品应有高的纯度，标准液的配制应准确。）标准品应有高的纯度，标准液的配制应准确。 （3 3）当待测液吸光度超过线性范围时，应将标本稀释后再测定。）当待测液吸光度超过线性范围时，应将标本稀释后再测定。 （4 4）标本测定的条件应

16、和标准曲线制作时的条件完全一致。）标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致。 （5 5）标准曲线上应标明制作日期、制作人和名称。）标准曲线上应标明制作日期、制作人和名称。 22 2 2比较法比较法 C Cu u=(A=(Au uC Cs s)/A)/As s 己知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白，己知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白， 同时测定标准管和标本的吸光度，根据测定的吸光度及标准同时测定标准管和标本的吸光度，根据测定的吸光度及标准 品浓度，可直接计算出标本的浓度，计算公式为：品浓度，可直接计算出标本的浓度，计算公式为： 其中其中C Cu u和和A Au u

17、为标本管浓度和吸光度，为标本管浓度和吸光度，C Cs s和和A As s分别为标准分别为标准 管浓度和吸光度。用标准品法定量时，标准品的浓度应尽量管浓度和吸光度。用标准品法定量时，标准品的浓度应尽量 和标本管浓度相近。和标本管浓度相近。 23 3 3其它分析方法其它分析方法 包括差示法、多组份混合物分析和利用包括差示法、多组份混合物分析和利用 摩尔吸光系数分析等方法。摩尔吸光系数分析等方法。 24 1光学因素：光学因素： 要求入射光是单色光。入射光的谱带越宽，其误差越要求入射光是单色光。入射光的谱带越宽，其误差越 大。大。 2化学因素：化学因素： 浓度、浓度、pH、溶剂和温度等因素可影响化学平

18、衡。、溶剂和温度等因素可影响化学平衡。 三、光谱分析技术的影响因素三、光谱分析技术的影响因素 25 补充补充 分光光度计的基本结构分光光度计的基本结构 最常用的是最常用的是可见分光光度计可见分光光度计和和紫外紫外- -可见光分光光度计可见光分光光度计 光源光源单色器单色器比色杯比色杯检测器检测器显示器显示器 五大部分五大部分 n结构：结构： 0.575 26 27 （一）光源（一）光源 u光源光源 是一种可以发射出供溶液或吸收物质选择性吸收的光。光是一种可以发射出供溶液或吸收物质选择性吸收的光。光 源应在一定光谱区域内发射出连续光谱，并有足够的强度和良源应在一定光谱区域内发射出连续光谱，并有足

19、够的强度和良 好的稳定性，在整个光谱区域内光的强度不应随波长有明显的好的稳定性，在整个光谱区域内光的强度不应随波长有明显的 变化。变化。 u光源种类：光源种类： 可见光分光光度计常用光源是可见光分光光度计常用光源是钨灯或卤钨灯，钨灯或卤钨灯，可发射可发射 3202500nm 。 紫外光光度计常用紫外光光度计常用氢灯和氘灯氢灯和氘灯作为光源。作为光源。 150400nm。 28 （二）单色器（二）单色器 u定义：定义： 将来自光源的复合光分散为单色光的装置称为分将来自光源的复合光分散为单色光的装置称为分 光系统或单色器。由入射狭缝、准直镜、色散元件、光系统或单色器。由入射狭缝、准直镜、色散元件、

20、 聚焦元件和出射狭缝等几部分组成。聚焦元件和出射狭缝等几部分组成。 u色散元件色散元件种类：种类： 滤光片滤光片棱镜棱镜光栅光栅 其核心部分是色散元件，起分光的作用。其核心部分是色散元件，起分光的作用。 29 入射狭缝入射狭缝 准直透准直透 镜镜 棱棱 镜镜 聚焦透聚焦透 镜镜 出射狭缝出射狭缝 白光白光 红红 紫紫 1 1 2 2 800 600 500 400 30 熔融石英熔融石英晶体石英晶体石英玻璃玻璃NaCl 170nm3.6 m *200600nm 2 m3.5 m *360nm2.5 m*200nm15 m KClKBrCsI 200nm18 m*230nm25 m 230nm5

21、0 m （三）比色杯（三）比色杯 又称为吸收池或比色皿又称为吸收池或比色皿。 u材料：材料： 常用无色透明、耐腐蚀和耐酸碱的玻璃或石英材料做成常用无色透明、耐腐蚀和耐酸碱的玻璃或石英材料做成 表表1：一些材料的有效透明区：一些材料的有效透明区 31 32 （五）显示器（五）显示器 （四）检测器（四）检测器 检测器是将透过溶液的光信号转换为电信号，检测器是将透过溶液的光信号转换为电信号， 并将电信号放大的装置。常用的检测器为光电管和并将电信号放大的装置。常用的检测器为光电管和 光电倍增管。光电倍增管。 是将光电管或光电倍增管放大的电流通过仪表是将光电管或光电倍增管放大的电流通过仪表 显示出来的装

22、置。显示出来的装置。 33 分光光度计的操作方法分光光度计的操作方法 1.1.开开721-A721-A分光光度计的开关，将比色池的盖子打开，通电分光光度计的开关，将比色池的盖子打开，通电2020分分 钟使仪器预热。钟使仪器预热。 2.2.将波长旋至测定的波长。将波长旋至测定的波长。 3.3.将空白液、校准液或待测液放入比色池，将空白液置于光路中。将空白液、校准液或待测液放入比色池，将空白液置于光路中。 4.4.将开关置于将开关置于T T位，打开比色池盖子，用光量粗调和光量细调调位，打开比色池盖子，用光量粗调和光量细调调 节节T T为为0.0,0.0,关上比色池盖子，关上比色池盖子， 调节调节T

23、 T为为100.0100.0。 5.5.将开关置于将开关置于A A，用消光调零，用消光调零 调节调节A A为为0.00.0 6.6.重复步骤重复步骤4 4和和5 5 7.7.将校准液或待测液推入光将校准液或待测液推入光 路，测量溶液的吸光度（路，测量溶液的吸光度（A A） 34 （二）吸光度的校正（二）吸光度的校正 铬酸钾的标准液可用于校正分光光度计的吸铬酸钾的标准液可用于校正分光光度计的吸 光度。在光度。在25，将，将4mg铬酸钾溶于铬酸钾溶于100ml的的 0.05mol/L KOH中，放入比色池中，在不同波长中，放入比色池中，在不同波长 下测定吸光度值，与己知的标准吸光度校正表进下测定吸

24、光度值，与己知的标准吸光度校正表进 行比较，可检测仪器吸光度的准确度行比较，可检测仪器吸光度的准确度。 （三）波长的校正（三）波长的校正 镨钕滤光片：镨钕滤光片：528nm处有最大吸收峰。处有最大吸收峰。 干涉滤光片：干涉滤光片：589nm处有最大吸收峰。处有最大吸收峰。 35 第二节第二节 电化学分析技术电化学分析技术 本节主要内容本节主要内容 一、一、电化学分析技术的基电化学分析技术的基 本原理本原理 二、二、电极分析法在临床检电极分析法在临床检 验中的应用验中的应用 三、电极分析法的影响因三、电极分析法的影响因 素素 36 一、电化学分析技术的基本原理 37 38 电位分析法：以测定电池

25、两极间电位差或电电位分析法：以测定电池两极间电位差或电 位差的变化来进行定量分析的电化学分析方位差的变化来进行定量分析的电化学分析方 法称电位分析法（法称电位分析法（Potentiometruy）。）。 39 电位分析法的理论依据电位分析法的理论依据 能斯特方程能斯特方程 表示电极电位与溶液中对应离子活度之表示电极电位与溶液中对应离子活度之 间存在的定量关系。间存在的定量关系。 单个电极的电位是无法测量的，因此，由单个电极的电位是无法测量的，因此，由指指 示电极示电极与与参比电极参比电极组成电池用电位计测量该电池组成电池用电位计测量该电池 的电动势，即可得到该电极的相对电位。相对于的电动势，即

26、可得到该电极的相对电位。相对于 同一参比电极的的不同电极的相对电位是可以相同一参比电极的的不同电极的相对电位是可以相 互比较的，并可用于计算电池的电动势。互比较的，并可用于计算电池的电动势。 40 原电池：由指示电极和参比原电池：由指示电极和参比 电极构成电极构成 1. 指示电极指示电极 电极电位随被测物质活度变电极电位随被测物质活度变 化的电极（化的电极（离子选择性电极）。）。 2. 参比电极参比电极 与被测物质无关，提供测量电位与被测物质无关，提供测量电位 参考的电极。具有恒定电位值的电极。（参考的电极。具有恒定电位值的电极。（甘汞电极和银-氯 化银电极） 41 离子选择电极分析法（离子选

27、择电极分析法（ion selective electrode， ISE）是利用电极电位和离子活度的关系来测定）是利用电极电位和离子活度的关系来测定 被测离子活度的一种电化学分析法。被测离子活度的一种电化学分析法。 离子选择性电极分为离子选择性电极分为玻璃膜电极和敏化电极玻璃膜电极和敏化电极 带有对被测离子选择性响应的敏感膜，膜带有对被测离子选择性响应的敏感膜，膜 内外的离子活度的差异引起离子从高浓度向低浓内外的离子活度的差异引起离子从高浓度向低浓 度迁移，从而产生电位改变（度迁移，从而产生电位改变（电极电位电极电位）。）。 1. 离子选择电极基本结构离子选择电极基本结构 42 电极管电极管敏感

28、膜敏感膜 内（参比）内（参比） 电极电极 内参比内参比 溶液溶液 43 膜内外被测离子活度的不同而产生电位差膜内外被测离子活度的不同而产生电位差 能斯特方程能斯特方程 44 45 x f x C nF RT k ISE Eln 303. 2 46 （一）常用的离子选择电极（一）常用的离子选择电极 1. 玻璃膜电极玻璃膜电极 敏感膜由玻璃材料制成，是发现较早的敏感膜由玻璃材料制成，是发现较早的ISE。 由于其敏感膜的组成不同，现已有由于其敏感膜的组成不同，现已有pH、Na+、K+ 、 Li+、Ag+ 、 Ca2+、iCa2+、Mg等玻璃电极。分为等玻璃电极。分为 固态和液态两种。固态和液态两种。

29、Na+电极就是利用玻璃膜对离电极就是利用玻璃膜对离 子的选择性透过制成的固态电极；而子的选择性透过制成的固态电极；而K+电极是在电极是在 聚乙烯膜上结合缬氨霉素制成的液态电极。聚乙烯膜上结合缬氨霉素制成的液态电极。 二、电化学分析法在临床检验中的应用 47 2. 气敏电极气敏电极 是基于界面化学反应对气体敏感而设计的一类敏化电极。是基于界面化学反应对气体敏感而设计的一类敏化电极。 二氧化碳气敏电极，它是由二氧化碳气敏电极，它是由pH玻璃膜电极构成，在玻璃玻璃膜电极构成，在玻璃 电极上围着蓄有碳酸氢钠薄液层的透气膜，透气膜允许二电极上围着蓄有碳酸氢钠薄液层的透气膜，透气膜允许二 氧化碳扩散进出碳

30、酸氢钠溶液，从而引起氧化碳扩散进出碳酸氢钠溶液，从而引起pH的变化，便的变化，便 可测定二氧化碳的含量。其他的还有测定氨、氯等气敏电可测定二氧化碳的含量。其他的还有测定氨、氯等气敏电 极。极。 指示电极通常选用玻璃电极，作用是对待测气体的浓指示电极通常选用玻璃电极，作用是对待测气体的浓 度或分压变化做出选择性响应。度或分压变化做出选择性响应。 48 3. 酶电极酶电极 是指一类将含酶的凝胶涂布于离子选择电极是指一类将含酶的凝胶涂布于离子选择电极 的敏感膜上组成的生物传感器。的敏感膜上组成的生物传感器。 在酶电极法测定葡萄糖时，葡萄糖在葡萄在酶电极法测定葡萄糖时，葡萄糖在葡萄 糖氧化酶的作用下被

31、氧化生成葡萄糖酸内酯和过糖氧化酶的作用下被氧化生成葡萄糖酸内酯和过 氧化氢，而氧的消耗或过氧化氢的生成均可被氧氧化氢，而氧的消耗或过氧化氢的生成均可被氧 电极或过氧化氢电极测得，从而以间接方式得知电极或过氧化氢电极测得，从而以间接方式得知 样品中葡萄糖的含量。常用的酶电极还有测定尿样品中葡萄糖的含量。常用的酶电极还有测定尿 素、尿酸、肌酐、维生素素、尿酸、肌酐、维生素C、乙醇、乳酸、蛋白、乙醇、乳酸、蛋白 质等酶电极。质等酶电极。 49 （二）离子选择电极的分析方法（二）离子选择电极的分析方法 1. 标准曲线法标准曲线法 2. 标准比较法标准比较法 3. 标准加入法标准加入法 50 （三）样品

32、测定方式（三）样品测定方式 51 （四）电极分析法在临床检验中的应用（四）电极分析法在临床检验中的应用 52 53 54 三、电极分析法的影响因素 离子强度 络合剂 干扰物质 空气湿度、温度 其他 55 第三节第三节 干化学分析技术干化学分析技术 （自学）（自学） 56 第四节第四节 电泳技术电泳技术 本节主要内容本节主要内容 一、一、电泳的基本原理电泳的基本原理 二、二、电泳技术的分类电泳技术的分类 三、影响电泳的因素三、影响电泳的因素 四、常用电泳技术四、常用电泳技术 五、电泳区带的测定五、电泳区带的测定 六、特殊电泳技术六、特殊电泳技术 57 电泳：电泳： 指带粒子在电场中向着与其所带电

33、荷相反的电指带粒子在电场中向着与其所带电荷相反的电 极移动的现象。极移动的现象。 电泳技术（电泳技术（electrophoresis technique） 利用各种带电粒子电泳速度不同，对多组分物质利用各种带电粒子电泳速度不同，对多组分物质 进行分离，然后进行定性、定量分析的技术。进行分离，然后进行定性、定量分析的技术。 58 主要用于蛋白质、核酸等的分离、鉴定和定量目主要用于蛋白质、核酸等的分离、鉴定和定量目 前已经发展到自动化的电泳系统，整个电泳过程前已经发展到自动化的电泳系统，整个电泳过程 包括点样、电泳、脱色、扫描定量都实现了自动包括点样、电泳、脱色、扫描定量都实现了自动 化操作。同时

34、用半干胶技术取代液体缓冲液，使化操作。同时用半干胶技术取代液体缓冲液，使 得电泳操作更规范简便，电泳结果重现性更好。得电泳操作更规范简便，电泳结果重现性更好。 59 （一）溶液中粒子的带电状态（一）溶液中粒子的带电状态 许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可 解离的基团，在一定的解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电下，这些基团会带上正电 或负电。或负电。 在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电 荷相反的电极移动。荷相反的电极移动。 电泳利用了待分离样品中各种分子电泳利用了待分离样品中各

35、种分子带电性质带电性质的差异的差异 以及以及分子本身的大小，形状分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生的不同，使带电分子产生 不同的不同的迁移速度迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。，从而实现样品中各种分子的分离。 一、电泳分析的基本原理一、电泳分析的基本原理 60 电泳迁移率：指带电粒子在单位电场强度作用下电泳迁移率：指带电粒子在单位电场强度作用下 的移动速度，即每厘米电压下降的移动速度，即每厘米电压下降1V的电场强度下的电场强度下 带电粒子每秒内移动的距离。带电粒子每秒内移动的距离。 （二）电泳的迁移率（二）电泳的迁移率 61 一定的一定的pH条件下，能吸附其他带电粒子或本身带有可

36、解离基团的物质颗粒，条件下，能吸附其他带电粒子或本身带有可解离基团的物质颗粒， 在电场中必然受到电性相反的电极吸引而移动。在电场中必然受到电性相反的电极吸引而移动。 电泳速度（电泳速度（ V ）与颗粒带电量（）与颗粒带电量（ Q ）及电场强度（）及电场强度（ E ）成正比，与粒子半）成正比，与粒子半 径（径（ r ）和介质粘度（）和介质粘度（ ）成反比。）成反比。 V = EQ/6r 电泳迁移率大小与颗粒带电量、大小和电泳迁移率大小与颗粒带电量、大小和 形状及介质粘度有关形状及介质粘度有关。 62 三、影响电泳的因素三、影响电泳的因素 （一）分子的形状和性质（一）分子的形状和性质 （二）电场强

37、度（二）电场强度 （三）电泳缓冲液（三）电泳缓冲液 缓冲溶质缓冲溶质 溶液的溶液的pH值值 离子强度离子强度 （五）支持介质（五）支持介质 1. 电渗作用电渗作用 2. 吸附作用吸附作用 决定了带电颗粒解离的程度，也决定决定了带电颗粒解离的程度，也决定 了物质所带净电荷的多少。了物质所带净电荷的多少。 是指单位长度支持物体上的电位降是指单位长度支持物体上的电位降。 溶液的离子强度越高，带电颗粒泳动溶液的离子强度越高，带电颗粒泳动 速度越慢，反之越快；通常缓冲液离速度越慢，反之越快；通常缓冲液离 子强度选择在子强度选择在0.050.1 molL之间。之间。 即介质对样品的滞留作用即介质对样品的滞

38、留作用。 （六）蒸发（六）蒸发 63 电场强度：粒子在电场中的移动速度，与电场强电场强度：粒子在电场中的移动速度，与电场强 度成正比。度成正比。 电场中因施加的端电压不同，分为常压和高压电电场中因施加的端电压不同，分为常压和高压电 泳。常压电泳一般在泳。常压电泳一般在500V 以下，电势梯度约为以下，电势梯度约为 1020V/cm；高压电泳一般在；高压电泳一般在500V以上，电势以上，电势 梯度约为梯度约为20200V/cm。 高压电泳会产生大量的热，所以高压电泳仪有配高压电泳会产生大量的热，所以高压电泳仪有配 套的冷却装置和安全防护装置。套的冷却装置和安全防护装置。 64 缓冲液：缓冲液：

39、缓冲液应选用使分离的物质稳定，而且不与缓冲液应选用使分离的物质稳定，而且不与 其发生反应的体系。其发生反应的体系。 缓冲液的缓冲液的pH直接影响分子的解离和带电性直接影响分子的解离和带电性 质、状态，因而会影响迁移率和分离效果。质、状态，因而会影响迁移率和分离效果。 缓冲液的离子强度，一般以缓冲液的离子强度，一般以0.05 0.10mol/L浓度为宜。离于强度低，产热少，电泳浓度为宜。离于强度低，产热少，电泳 快，区带明显扩散；离子强度高，区带尖锐，泳快，区带明显扩散；离子强度高，区带尖锐，泳 动距离短，产热多。动距离短，产热多。 65 v电渗电渗就是指在电场中，液体对固体支持物的相对就是指在

40、电场中，液体对固体支持物的相对 移动。移动。 66 二、常用电泳分析技术二、常用电泳分析技术 1.1.移动界面电泳移动界面电泳 2.2.区带电泳区带电泳 3.3.稳态电泳稳态电泳 67 （一）醋酸纤维素薄膜电泳（一）醋酸纤维素薄膜电泳（cellulose acetate electrophoresis） 以醋酸纤维素薄膜为支持介质。以醋酸纤维素薄膜为支持介质。 v分辩力好，对蛋白质吸附极少，拖尾现象轻微；分辩力好，对蛋白质吸附极少，拖尾现象轻微； 不吸附染料，对区带周围的染料能完全洗去，不干不吸附染料，对区带周围的染料能完全洗去，不干 扰测定；样品需要量少、介质又可以透明后定量扫扰测定；样品需

41、要量少、介质又可以透明后定量扫 描等优点。描等优点。 68 临床生物化学上分离血临床生物化学上分离血 清蛋白、糖蛋白、脂蛋清蛋白、糖蛋白、脂蛋 白、血红蛋白、甲胎蛋白、血红蛋白、甲胎蛋 白及同工酶等大分子物白及同工酶等大分子物 质。质。 69 琼脂琼脂 琼脂糖琼脂糖 琼脂胶琼脂胶 脱去脱去SO42- 丙酮酸酯基丙酮酸酯基 （二）（二） 琼脂或琼脂糖凝胶电泳琼脂或琼脂糖凝胶电泳 优点：优点：1. 含液体量大，疏松。扩散小。对蛋白吸附极弱。含液体量大，疏松。扩散小。对蛋白吸附极弱。 2. 均匀，区带整齐，分辨率高。均匀，区带整齐，分辨率高。 3. 电泳速度快。电泳速度快。 4. 透明度好。透明度好

42、。 5. 区带易着色，样品易洗脱。区带易着色，样品易洗脱。 6. 干膜可长期保存。干膜可长期保存。 70 71 （三）聚丙烯酰胺凝胶电泳（三）聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE） 聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶。聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶。 以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物是目前分辨率最以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物是目前分辨率最 高的支持物之一。高的支持物之一。 适用：适用： 1. 分离各种蛋白质组分；分离各种蛋白质组分； 2. 测定蛋白质或核酸分子量、核酸序列分测定蛋白质或核酸分子量、核酸序列分 析；析； 3. 基因变异或同

43、功酶研究。基因变异或同功酶研究。 72 丙烯酰胺 甲叉双丙烯酰胺 聚丙烯酰胺凝胶具聚丙烯酰胺凝胶具 有一定的网状结构。有一定的网状结构。 如果形成的孔径大小如果形成的孔径大小 接近于所分离样品分接近于所分离样品分 子的平均半径子的平均半径，样品，样品 分子在通过凝胶孔洞分子在通过凝胶孔洞 时，所受到的时，所受到的阻力就阻力就 会和样品分子的大小会和样品分子的大小 及形状有关。及形状有关。 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 73 （1） 分子筛效应分子筛效应 蛋白质进入分离胶，由于凝胶蛋白质进入分离胶，由于凝胶 有一定的孔径，不同的蛋白质分子大小不同，受到有一定的孔径，不同的蛋白质分子大小不

44、同，受到 的阻力不同，小分子受阻力小，走在前面，大分子的阻力不同，小分子受阻力小，走在前面，大分子 受阻力大，走在后面。受阻力大，走在后面。 （2）电荷效应）电荷效应 同一般电荷。同一般电荷。 v电荷效应及电荷效应及分子筛分子筛的功能，大大提高了分离能力，的功能，大大提高了分离能力， 是目前分辨率最高的电泳支持介质。是目前分辨率最高的电泳支持介质。 74 （四）电泳区带的测定（四）电泳区带的测定 电泳区带的定性、定量测定可用直接法或染色法。电泳区带的定性、定量测定可用直接法或染色法。 1. 区带定性分析区带定性分析 区带染色区带染色 蛋白区带染色用氨基黑蛋白区带染色用氨基黑10B、溴酚蓝、考马

45、、溴酚蓝、考马 斯亮蓝、丽春红等。斯亮蓝、丽春红等。 脂蛋白染色常用苏丹红、苏丹黑等。脂蛋白染色常用苏丹红、苏丹黑等。 核酸区带染色常用溴乙啶。核酸区带染色常用溴乙啶。 多发性骨髓瘤多发性骨髓瘤M带带 肝硬化肝硬化 桥。 75 2. 区带定量分析区带定量分析 （1）光密度扫描法）光密度扫描法 （2）洗脱比色法）洗脱比色法 76 三、自动电泳分析技术三、自动电泳分析技术 四、电泳分析技术在临床中的应用四、电泳分析技术在临床中的应用 一、蛋白电泳一、蛋白电泳 1. 1. 血清蛋白电泳血清蛋白电泳 新鲜血清经醋酸纤维薄膜或琼脂糖电泳、染色新鲜血清经醋酸纤维薄膜或琼脂糖电泳、染色 后，通常可见后，通常

46、可见5条带，即清蛋白、条带，即清蛋白、 1、 2、 和和 球球 蛋白。蛋白。 血清蛋白电泳图谱血清蛋白电泳图谱 77 2. 2. 免疫固定电泳免疫固定电泳 常用于临床常规常用于临床常规M蛋白的分型与鉴定。一般用于蛋白的分型与鉴定。一般用于 单克隆单克隆Ig增殖病、单克隆增殖病、单克隆Ig病、本周氏蛋白和游离轻病、本周氏蛋白和游离轻 链病、多组分单克隆链病、多组分单克隆Ig病、重链病、病、重链病、CSF寡克隆蛋白寡克隆蛋白 鉴别、多克隆鉴别、多克隆Ig病的诊病的诊 断和鉴别诊断。断和鉴别诊断。 免疫固定电泳图谱免疫固定电泳图谱 78 3. 3. 脂蛋白电泳脂蛋白电泳 检测各种脂蛋白（包括胆固醇和

47、甘油三酯）主要检测各种脂蛋白（包括胆固醇和甘油三酯）主要 用于高脂用于高脂 血症的分型、冠心病危险性估计，以及动血症的分型、冠心病危险性估计，以及动 脉粥样硬化性及相关脉粥样硬化性及相关 疾病的发生、发展、诊断和治疾病的发生、发展、诊断和治 疗效果观察的研究等。疗效果观察的研究等。 脂蛋白电泳图谱脂蛋白电泳图谱 79 4. 4. 尿蛋白电泳尿蛋白电泳 主要目的是：主要目的是： 确定尿蛋白的来源；确定尿蛋白的来源； 了解肾脏病变的严重程度，从而有助于诊断和了解肾脏病变的严重程度，从而有助于诊断和 预后的判断。预后的判断。 尿蛋白电泳图谱尿蛋白电泳图谱 80 81 5. 5. 血红蛋白及糖化血红蛋

48、白电泳血红蛋白及糖化血红蛋白电泳 鉴别患者血液中鉴别患者血液中Hb的类型及含量，对于贫血类型的类型及含量，对于贫血类型 的临床诊断及治疗具有重大意义。的临床诊断及治疗具有重大意义。 06-19 血红蛋白电泳图谱血红蛋白电泳图谱 82 （二）（二） 同工酶电泳同工酶电泳 同工酶电泳用于临床上常见的同工酶或同工酶亚同工酶电泳用于临床上常见的同工酶或同工酶亚 型分析。型分析。 1 1乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶( (LD/LDH) )同工酶同工酶 2 2肌酸激酶（肌酸激酶（CK）同工酶）同工酶 3 3CK同工酶亚型同工酶亚型 同工酶电泳图谱同工酶电泳图谱 83 84 第五节 基因扩增技术 聚合酶链式反应（p

49、olymerase chain reaction,PCR）主要用于病毒、细菌、支原体及其他病原体的检测。 85 一、PCR反应基本原理 （一）基本原理 是在试管中进行的DNA复制反应。 重复进行DNA复制的过程，每次循环复制包括3个步骤：变 性、退火和延伸。 变性被复制DNA在高于其熔点温度（ 9495）加热， DNA双螺旋的氢键断裂，成为两条单链，以便与引物结合， 为下一轮反应做准备。 退火将温度降至引物的熔点温度以下（ 4070 ）， 使引物与模板链互补结合。 延伸将温度升至72 左右，在反应体系中DNA聚合酶 作用下，按模板连序列，碱基配对和半保留复制原则，把 dNTP加至引物的3端，杂交双链不断延伸。 86 （二）反应体系 1. 模板 2. 引物 3. 脱氧核苷三磷酸（dNTP） 4. Taq DNA聚合酶 5. 镁离子浓度 6. 其他反应因素 87 （三）注意事项 1. 实验室的布局要求 2. 操作人员必须进行上岗培训 3. 标本收集 4. 血液标本 5. 痰液标本 6. 标本的保存与运输 7. 避免污染 88 二、荧光定量PCR基本原理（自学） 新的基因检测技