膳食纤维含量测定方法

1、酶-重量法 1. 原理： 样品分别用 a淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖苷酶进行酶解消化以去除蛋白质和可消化的淀粉。 总膳食纤维( TDF )是先酶解，然后用乙醇沉淀，再将沉淀物过滤，将 TDF 残渣用乙醇和 丙酮冲洗，干燥称重。不溶性和可溶性膳食纤维(IDF和SDF)是酶解后将IDF过滤，过 滤后的残渣用热水冲洗，经干燥后称重。 SDF 是将上述滤出液用 4 倍量的 95%乙醇沉淀， 然后再过滤，干燥，称重。TDF、 IDF 和 SDF 量通过蛋白质、灰分含量进行校正。 2. 适用范围 AOAC991.43 本方法适用于各类植物性食物和保健食品。 3. 仪器 3.1 烧杯： 400 或 600ml 高

2、脚型。 3.2过滤用坩埚：玻料滤板，美国试验和材 料学会(ASTM ) 40-60艸，Pyrex 60ml ( Corning No.36060 buchner ，或同等的) 。如下处理： (1) 在灰化炉525C灰化过夜。炉温降至 130C以下取出坩埚。 (2) 用真空装置移出硅藻土和灰质。 ( 3) 室温下用 2%清洗溶液浸泡 1 小时。 (4) 用水和去离子水冲洗坩埚；然后用 15ml 丙酮冲洗然后风干。 (5) 在干燥的坩埚中加 0.5g硅藻土，在130 C烘干恒重。 (6) 在干燥器中冷却 1 小时，记录坩埚加硅藻土重量，精确至0.1mg。 3.3 真空装置： ( 1 ) 真空泵或抽

3、气机作为控制装置。 (2) 1L 的厚壁抽滤瓶。 (3) 与抽滤瓶相配套的橡皮圈。 3.4 振荡水浴箱： (1) 自动控温使温度能保持在98 2 C。 (2) 恒温控制在 60 C。 3.5 天平：分析级，精确至 0.1mg。 3.6马福炉：温度控制在 525 C。 3.7干燥箱：温度控制在 105和130 3C。 3.8干燥器：用二氧化硅或同等的干燥剂。干燥剂两周一次在130 C烘干过夜。 精品 精品 3.9 PH 计：注意温控，用 pH4.0 、 7.0 和 10.0 缓冲液标化。 3.10移液管及套头：容量 100 和5ml。 3.11 分配器或量筒： (1 ) 15 0.5ml ，供分

4、配 78%的乙醇， 95%的乙醇以及丙酮。 (2) 40 .5ml，供分配缓冲液。 3.12. 磁力搅拌器和搅拌棒。 4. 试剂 全过程使用去离子水，试剂不加说明均为分析纯试剂 4.1 乙醇溶液： (1) 85% :力口 895ml95%乙醇在1L量筒中，用水稀释至刻度。 (2) 78% :力口 821ml95%乙醇在1L量筒中，用水稀释至刻度。 4.2 丙酮： 4.3供分析用酶：在0-5 C下储存。 (1) 热稳定 a淀粉酶溶液：Cat. No. A3306 , Sigma Chemical Co. , St. Louis, MO63178 , 或 Termamyl 300L ， Cat.

5、No. 361-6282 ， Novo-Nordisk ， Bagsvaerd， Denmark ，或等效的酶。 (2) 蛋白酶：Cat. No. P3910, Sigma Chemical Co.，或等效的。当天用 MES/TRIS 缓冲液 中现配 50mg/ml 酶溶液。 (3) 淀粉葡糖苷酶溶液： Cat. No. AMG A9913 ， Sigma Chemical Co. ，或等效的。 4.4 硅藻土：酸洗( Celite 545 AW， No.C8656， Sigma Chemical Co. ，或等效的) 。 4.5 洗涤液：两者挑一。 (1) 铬酸：120g重铬酸钠 Na2Cr

6、2O7 2H2O , 1000ml蒸馏水和1600ml浓硫酸。 ( 2) 实验室用液体清洁剂， 预备急需清洗的 ( Micro ， International Products Corp. ， Trenton， NJ08016，或等效的)。用水配制2%溶液。 4.6 MES-TRIS 缓冲液：0.05mol/L，温度在 24C时 pH 值为 8.2。 (1) MES : 2- ( N-吗啉代)磺酸基乙烷(No.M-8250 , Sigma Chemical Co.或等效的)。 (2) TRIS :三羟(羟甲基)氨基甲烷(No.T-1503 , Sigma Chemical Co.或等效的)。

7、在1.7L的蒸馏水中溶解 19.52gMES和12.2gTRIS ,用6mol/L NaOH调pH到8.2,用水定容 至2L。(注意：24 C时的pH为8.2，但是，如果缓冲液温度在20 C, pH就为8.3，如果温 度在28C, pH为8.1。为了使温度在 20-28 C之间，需根据温度调整pH值。) 4.7 盐酸溶液： 0.561mol/L ，加 93.5ml6mol/L 盐酸到 700ml 水中，用水定容至 1L 。 5. 操作方法 5.1. 样品制备： (1) 固体样品：如果样品粒度 0.5mm，研磨后过0.3-0.5mm ( 40-60目)筛。 (2) 高脂肪样品：如果脂肪含量10%

8、，用石油醚去脂。每克样品用25ml，每次提取完静 置一会儿再小心将烧杯倾斜，慢慢将石油醚倒出，共洗三次。 (3) 高碳水化合物样品：如果样品干重含糖50%，用85%乙醇去除糖份，每克样品每次 10ml，共洗三次轻轻倒出，然后在40C烘箱中不时翻搅干燥过夜，并研磨过0.5mm筛。 5.2. 样品消化 (1) 准确称取双份1.000 .005g样品(M1和M2 ),置于高脚烧杯中。 (2) 在每个烧杯中加入 40ml MES-TRIS 缓冲液，在磁力搅拌器上搅拌直到样品完全分散。 (防止团块形成，使受试物与酶能充分接触) 。 (3) 用热稳定的淀粉酶进行酶解处理：加100卩1热稳定的淀粉酶溶液，低

9、速搅拌。用铝箔 片将烧杯盖住，在 95-100C水浴中反应30分钟。(起始的水浴温度应达到 95C)。 (4) 冷却：所有烧杯从水浴中移出，凉至60C。打开铝箔盖，用刮勺将烧杯边缘的网状物 以及烧杯底部的胶状物刮离， 以使样品能够完全的酶解。 用 10ml 蒸馏水冲洗烧杯壁和刮勺。 (5) 用蛋白酶进行酶解处理： 在每个烧杯中各加入 1001蛋白酶溶液。用铝箔盖住，在60 C 持续摇动反应30分钟(开始时的水浴温度应达60C),使之充分反应。 (6) pH值测定：30分钟后，打开铝箔盖，搅拌中加入5ml0.561mol/L HCL至烧杯中。60 C 时用1mol/L NaOH溶液或1mol/L

10、 HCL溶液调最终pH为4.0-4.7。(注意：当溶液为 60C时 检测和调整 pH ，因为在较低温度时 pH 会偏高。) (7) 用淀粉葡糖苷酶溶液酶解处理：搅拌同时加1001淀粉葡糖苷酶溶液。用铝箔盖住， 在60 C持续振摇反应30分钟，温度应恒定在 60 C。 5.3 测定 5.3.1.总的膳食纤维测定 (1) 用乙醇沉淀膳食纤维：在每份样品中，加入预热至60C的95%乙醇225ml，乙醇与样 品的体积比为4 ： 1。室温下沉淀1小时。 (2) 过滤装置：用15ml78%乙醇将硅藻土湿润和重新分布在已称重的坩埚中。用适度的抽 力把坩埚中的硅藻土吸到玻板上。 注意：如果一些样品 3) 酶解

11、过滤，用 78%乙醇和刮勺转移所有内容物微粒到坩埚中。 形成胶质，用刮勺破坏表面，以加速过滤。 ) (4) 抽真空，分别用 15ml 的 78%乙醇， 95%乙醇和丙酮冲洗残渣各 2 次，将坩埚内的残 渣抽干后在105 C烘干过夜。将坩埚置干燥器中冷却至室温。坩埚重量，包括膳食纤维残渣 和硅藻土，精确称至 O.lmg。减去坩埚和硅藻土的干重，计算残渣重。 (5) 蛋白质和灰分的测定 :取成对的样品中的一份测定蛋白质，用本书前述或 GB-960.52 方法测定。用(NX6.25作为蛋白质的转换系数)。 分析灰分时用平行样的第二份在525C灼烧5小时，在干燥器中冷却，精确称至O.lmg,减 去坩埚

12、和硅藻土的重量，即为灰分重量。 5.3.2 .不溶性膳食纤维测定： ( 1 ) 称适量样品按 5.2 进行酶解,过滤前用 3ml 水湿润和重新分布硅藻土在预先处理好的 坩埚上,保持抽气使坩埚中的硅藻土抽成均匀的一层。 (2) 过滤并冲洗烧杯，用10ml70 C水洗残渣2次，然后再过滤并用水洗，转移到 600ml 高脚烧杯,保留用以测定可溶性膳食纤维,按5.3.3。 (3) 用抽滤装置，分别用 15ml78%乙醇，95%乙醇和丙酮各冲洗残渣 2次。 (注意： 应及时用 78%乙醇、95%乙醇和丙酮冲洗残渣否则可造成不溶性膳食纤维数值的增 大。) (4) 按 5.3.1.5用双份样品测定蛋白质和灰分。 5.3.3.可溶性膳食纤维测定： (1) 将不溶性膳食纤维过滤后的滤液收集到 600ml 高脚烧杯中,对比烧杯和滤过液,估计 容积。 (2) 加约滤出液4倍量已预热至60C的95%乙醇。或者将滤液和洗过残渣的蒸馏水的混 合液调至80g，再加入预热至 60C的95%乙醇320ml。 (3) 室温下沉淀1小时。下面按