分析方法验证

1、2009-1-51 分析方法验证 2009-1-5 2009-1-52 目录 1.概述 2.分析方法验证 1.需要验证的检测项目 2.验证的内容 3.再验证 3.生物制品分析方法验证 2009-1-53 方法验证目的 n识别方法可能的误差的来源及其定量 n确定方法针对预期的用途是否可接受 n为方法可被用于作结果判定提供证明依 据 2009-1-54 方法验证的重要性 n分析测量的目的是得到一致、准确、可靠的数据 n错误的分析结果会导致巨大的浪费 n药品的生产过程中，原料、中间体、成品均需进 行检验，检验结果既是过程受控的依据，也是评 价产品质量的重要依据，检验结果应具有准确可 靠。 n为确保检

2、验方法的准确性和重现性，检验方法必 须进行验证。 n提供证据保证该方法是准确、可靠和可行的。 2009-1-55 方法验证的意义 n药品标准的建立和执行需要经验证的检验方法 n新药申报要求新药申报要求 n药典要求（药品标准组成：药典要求（药品标准组成：1、项目的规格标准或、项目的规格标准或 限度；限度；2、相应的检验方法和操作步骤）、相应的检验方法和操作步骤） n工艺过程的监控需要经验证的检验方法 n药品生产验证需要经验证的检验方法 n变更的再验证：工艺变更，药品组份变更，分析规变更的再验证：工艺变更，药品组份变更，分析规 程变更程变更 n药品的商业交换需要经验证的检验方法 ngmp的要求的要

3、求 2009-1-56 美欧gmp现场检查要点 n进入美欧市场需要满足的gmp六大系统 1.质量 2.设施和设备 3.物料 4.生产 5.包装/标签 6.实验室 2009-1-57 fda检查4大缺陷领域 n验证 n工艺控制 n记录 n实验室控制（缺陷率最高） n实验室仪器使用管理与保养 n仪器校验 n取样程序与执行 n标准品的使用 n留样及其稳定性监测方面 n分析方法验证 2009-1-58 分析方法验证的前提条件分析方法验证的前提条件 n人员已经培训、资格确认 n仪器已经确认、校正并在有效期内 n可靠的对照品 n可靠的实验试剂 n确认受试溶液的稳定性，在规定时间内无降解 n文件：经批准的验

4、证方案（操作过程、可接受 标准、记录等） 2009-1-59 检验仪器验证内容检验仪器验证内容 检验仪器分为： 1.测量仪器只进行测量不涉及分析过程。如计时器、温 度计、天平、ph计 2.计量仪器如空量瓶、移液管、滴定管 3.分析仪器大型分析仪器或参于分析过程，系统需要进 行分离，然后才进行检测仪器。如hplc、gc、紫外分光 光度计、红外分光光度计等。 4.分析设备不用于分析工作重要设备。如人工气候箱 2009-1-510 检验仪器验证的内容 n测量仪器只进行安装确认与校正。 n计量仪器只进行校正。 n分析仪器进行iq、oq、pq。 n分析设备进行iq、oq、pq。 2009-1-511 方

5、法验证的一般原则 n原则上每个检测项目采用的分析方法，均需要 进行方法验证。 n方法验证的内容应根据检测项目的要求，结合 所采用分析方法的特点确定。 n同一分析方法用于不同的检测项目会有不同的 验证要求。例如，采用高效液相色谱法用于制 剂的鉴别和杂质定量试验应进行不同要求的方 法验证，前者重点要求验证专属性，而后者重 点要求验证专属性、准确度、定量限。 2009-1-512 需要验证的检测项目 n检测项目是为控制药品质量，保证安全有效而 设定的测试项目。 n根据检测项目的设定目的和验证内容的不同要 求，将需验证的检测项目分为四类： n鉴别 n杂质检查（限度试验、定量试验） n定量测定（含量测定

6、） n其他特定检测项目（溶出度、释放度等） 2009-1-513 验证内容 n方法的验证是其性能特征的系统性评价的认证。 性能特征通过如下的参数来表示： 1.专属性 2.线性 3.范围 4.准确度 5.精密度 6.检测限 7.定量限 8.耐用性 9.系统适用性。 n验证内容就是方法的以上参数。 2009-1-514 各种检测方法通常需测定的参数 分析方法 参数 鉴别试验 杂质检查 含量分析 特殊分析 定量 限度 准确性* 精密度 重复性 * 精密度 中间精密度 * * * * 耐用性* 线性 范围 专属性* 检测限度 定量限度 注： 表示通常不需测定的参数 *在一些情况下可能不需要 表示通常需

7、测定的参数 * *如果做了重复性，可能不需要做 2009-1-515 1 专属性(一) n专属性系指在其他成分（如杂质、降解物、辅 料等）可能存在下，采用的分析方法能够正确 鉴定、检出被分析物质的特性。 n通常，鉴别、杂质检查、含量测定方法中均应 考察其专属性。如采用的方法不够专属，应采 用多个方法予以补充。 2009-1-516 1 专属性(二) 1、鉴别反应 鉴别试验应确证被分析物符合其特征。 专属性试验要求证明能与可能共存的物质或 结构相似化合物区分，需确证含被分析物的 供试品呈正反应，而不含被测成分的阴性对 照呈负反应，结构相似或组分中的有关化合 物也应呈负反应。 2009-1-517

8、 1 专属性(三) 2、杂质检查 n作为纯度检查，所采用的分析方法应确保可检出被分析物中杂质的含量， 如有关物质、重金属、有机溶剂等。因此杂质检查要求分析方法有一定 的专属性。 n在杂质可获得的情况下，可向供试品中加入一定量的杂质，证明杂质与 共存物质能得到分离和检出，并具适当的准确度与精密度。 n在杂质或降解产物不能获得的情况下，专属性可通过与另一种已证明合 理但分离或检测原理不同、或具较强分辨能力的方法进行结果比较来确 定。或将供试品用强光照射，高温，高湿，酸、碱水解及氧化的方法进 行破坏（制剂应考虑辅料的影响），比较破坏前后检出的杂质个数和量。 必要时可采用二极管阵列检测和质谱检测，进行

9、色谱峰纯度检查。 2009-1-518 1 专属性(四) n破坏性试验/强为降解试验 n强光照射:4500lx500lx n高温：60/ 40/110 n高湿：25、rh905 kno3饱和溶液 rh755 nacl饱和溶液 n酸水解：0.1n hcl n碱水解：0.1n naoh n氧化：3-30%h2o2 n可接受的降解水平比例为与供试品相比10-30%降解。 2009-1-519 1 专属性(五) 3、含量测定 n含量测定目的是得到供试品中被分析物的含量或效价的准确结果。 n在杂质可获得的情况下，对于主成分含量测定可在供试品中加入杂质 或辅料，考察测定结果是否受干扰，并与未加杂质和辅料的

10、供试品比 较测定结果。 n在杂质或降解产物不能获得的情况下，可采用另一个经验证了的或药 典方法进行比较，对比两种方法测定的结果。也可采用破坏性试验 （强光照射，高温，高湿，酸、碱水解及氧化），得到含有杂质或降 解产物的试样，用两种方法进行含量测定，比较测定结果。必要时进 行色谱峰纯度检查，证明含量测定成分的色谱峰中不包含其他成分。 2009-1-520 2 线性(一) n线性系指在设计的测定范围内，检测结果与供 试品中被分析物的浓度（量）直接呈线性（比 例）关系的程度。 n线性是定量测定的基础，涉及定量测定的项目， 如杂质定量试验和含量测定均需要验证线性。 2009-1-521 2 线性(二)

11、 n应在设计的测定范围内测定线性关系。 至少制备5个浓度（浓度范围至少等于准确度测量的范 围） 。以测得的响应信号作为被测物浓度的函数作图， 观察是否呈线性。 制备一系列被测物质浓度的方法 直接精密称量（对于低浓度样品不适合，易引入称量误差） 由贮备液进行系列精密稀释（适合低浓度样品，可清除称量误差） 可接受标准： 活性成分 r0.999 杂质 r 0.990 2009-1-522 3 准确度(一) n准确度系指用该方法测定的结果与真实值或认可 的参考值之间接近的程度。有时也称真实度。 n通常用百分回收率或平均值与可接受的真值间的 差异及其置信区间来报告。 n一定的准确度为定量测定的必要条件，

12、因此涉及 到定量测定的检测项目均需要验证准确度，如含 量测定、杂质定量试验等。 2009-1-523 3 准确度(二) n准确度试验受如下条件影响 是否所有的分析物已经溶解了 可提取的和吸收损失 正确的检测 检测器对样品和标准品的响应 被分析物的相对响应值 2009-1-524 3 准确度(三) n准确度应在规定的范围内建立，对于制剂一般以回收率试验来进 行验证。 n在方法的范围内将已知量的被分析物加到空白对照或样品中 试验设计需考虑在规定线性范围内，制备3个不同浓度的试样，各测 定3次，共测定9次，即33水平 覆盖到范围（通常为正常的80、100和120） 检测结果与理论值比较确定回收率 n

13、通常主峰在98.0102.0 n对于杂质通常如下： n0.2以下 0.05 n0.21.0 相对的20 n1.0以上 相对的10 2009-1-525 3 准确度(四) 1、含量测定 n原料药可用已知纯度的对照品或符合要求的原料药进行测定，或用本 法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较。 n制剂可用含已知量被测物的各组分混合物进行测定。如不能得到制剂 的全部组分，可向制剂中加入已知量的被测物进行测定，必要时，与 另一个已建立准确度的方法比较结果。 2、杂质定量试验 n杂质的定量试验可向原料药或制剂中加入已知量杂质进行测定。如果 不能得到杂质，可用本法测定结果与另一成熟的方法进行比

14、较，如药 典方法或经过验证的方法。 n如不能测得杂质的相对响应因子，可在线测定杂质的相关数据，如采 用二极管阵列检测器测定紫外光谱，当杂质的光谱与主成分的光谱相 似，则可采用原料药的响应因子近似计算杂质含量(自身对照法)。并 应明确单个杂质和杂质总量相当于主成分的重量比或面积比。 2009-1-526 4 精密度(一) n精密度系指在规定的测试条件下，同一均质供试品，经多 次取样进行一系列检测所得结果之间的接近程度（离散程 度）。 n含量测定和杂质定量测定要做精密度考察。 n精密度一般用多次测量结果的偏差、标准偏差或相对标准 偏差表示。用标准偏差或相对标准偏差表示时，取样测定 次数应至少6次。

15、 n精密度可以从三个层次考察：重复性、中间精密度、重现 性。 2009-1-527 4 精密度(二) 1、重复性 n重复性系指在同样的操作条件下，在较短时间间 隔内，由同一分析人员测定所得结果的精密度。 n重复性测定可在规定范围内， n用9次测定结果进行评价，制备3个不同浓度的试样， 各测定3次，即33水平 n或100的浓度水平，用至少测定6次的结果进行评价。 n通常主峰2rsd，杂质20rsd 2009-1-528 4 精密度(三) 2、中间精密度 n中间精密度系指在同一实验室，由于实验室内部条件改变， 如时间、人员、仪器设备，对测定结果的精密度的影响。 n验证时可设计方案对各变动因素进行统

16、一考察。 n色谱分析方法受外界因素的影响较大，一般需考察中间精密 度。 3、重现性 n指不同实验室之间不同分析人员测定结果的精密度。 n当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验。 2009-1-529 精密度和准确度 2009-1-530 5 范围(一) n范围系指能够达到一定的准确度、精密度和线性， 测试方法适用的试样中被分析物高低限浓度或量 的区间。 2009-1-531 5 范围(二) n范围是规定值，在试验研究开始前应确定验证的范围 和试验方法。可以采用符合要求的原料药配制成不同 的浓度，按照相应的测定方法进行试验。 n范围通常用与分析方法的测试结果相同的单位（如百 分浓度）表达

17、。涉及到定量测定的检测项目均需要对 范围进行验证，如含量测定、含量均匀度、溶出度或 释放度、杂质定量试验等。 n范围应根据剂型和（或）检测项目的要求确定。 2009-1-532 5 范围(三) 1、含量测定 范围应为测试浓度的80120或更宽。 2、制剂含量均匀度 范围应为测试浓度的70130。根据剂型特点，如气雾剂、 喷雾剂，必要时，范围可适当放宽。 3、杂质 n杂质测定时，范围应为杂质的报告水平至标准规定的120。 n有异常功效的、有毒的或有意外药理作用的杂质，其检测限和定 量限应与该杂质必须被限制的水平相当。 4、如果含量测定与杂质检查同时测定，用面积归一化法， 且仅使用100%的标准品

18、，则线性范围应覆盖杂质的报告 限度至含量标准的120。 2009-1-533 6 检测限(一) n检测限系指试样中的被分析物能够被检测到的 最低量，但不一定要准确定量。 n该验证指标的意义在于考察方法是否具备灵敏 的检测能力。因此对杂质限度试验，需证明方 法具有足够低的检测限，以保证检出需控制的 杂质。 n常用信噪比法确定检测限。 2009-1-534 6 检测限(二) 1、直观法 n直观评价可以用于非仪器分析方法，也可用于仪器分析方法。 n检测限的测定是通过对一系列已知浓度被测物的试样进行分析，并以能准 确、可靠检测被测物的最小量或最低浓度来建立。 2、信噪比法 n用于能显示基线噪音的分析方

19、法，即把已知低浓度试样测出的信号与噪声 信号进行比较，计算可检出的最低浓度或量。一般以信噪比为3：1时相应 的浓度或注入仪器的量确定检测限。 3、其他方法 n基于工作曲线的斜率和响应的标准偏差进行计算的方法。 dl=3.3/s 标准偏差 s曲线的斜率 n无论用何种方法，均应用一定数量的试样，其浓度为近于或等于检测 限，进行分析，以可靠地测定检测限。 2009-1-535 7 定量限(一) n定量限系指试样中的被分析物能够被定量测定 的最低量，其测定结果应具有一定的准确度和 精密度。 n定量限体现了分析方法是否具备灵敏的定量检 测能力。杂质定量试验，需考察方法的定量限， 以保证含量很少的杂质能够

20、被准确测出。 n常用信噪比法确定定量限。 2009-1-536 7 定量限(二) 1、直观法 n直观评价可以用于非仪器分析方法，也可用于仪器分析方法。 n定量限一般通过对一系列含有已知浓度被测物的试样进行分析，在准确度 和精密度都符合要求的情况下，来确定被测物能被定量的最小量。 2、信噪比法 n用于能显示基线噪音的分析方法，即把已知低浓度试样测出的信号与噪声 信号进行比较，计算出可检出的最低浓度或量。一般以信噪比为10：1时 相应的浓度或注入仪器的量进行确定。 3、其他方法 n基于工作曲线的斜率和响应的标准偏差进行计算的方法。 ql=10/s n无论用何种方法，均应用一定数量的试样，其浓度为近

21、于或等于定量 限，进行分析，以可靠地测定定量限。 2009-1-537 8 耐用性(一) n耐用性系指测定条件发生小的变动时，测定结果 不受影响的承受程度。 n耐用性主要考察方法本身对于可变试验因素的抗 干扰能力。开始研究分析方法时，就应考虑其耐 用性。如果测试条件要求苛刻，则建议在方法中 予以写明。 2009-1-538 8 耐用性(二) n典型的变动因素包括： n分析溶液的稳定性 n液相色谱法中的参数 参数 标准范围 n检测波长 4nm n流动相的组成 5 n流速 2 nph值 0.2 n色谱柱的不同供应商 三家 n柱温 5 n流速 2 2009-1-539 8 耐用性(三) n测定：条件

22、变化时与正常条件下结果比 较 n耐用性评估的结果：建立一系列的系统 适用性参数，以确保在任何时候使用该 分析方法都是有效的。 2009-1-540 9 系统适用性试验 n对一些仪器分析方法，在进行方法验证时，有必要将分 析设备、电子仪器与实验操作、测试样品等一起当作完 整的系统进行评估。系统适用性便是对整个系统进行评 估的指标。系统适用性试验参数的设置需根据被验证方 法类型而定。 n色谱方法对分析设备、电子仪器的依赖程度较高，因此 所有色谱方法均应进行该指标验证，并将系统适用性作 为分析方法的组成部分。具体验证参数和方法参考药典 有关规定。 2009-1-541 试验程序 n一些试验可以一起进

23、行 例如：精密度和准确度 n标准的程序: 1.专属性 2.检测限和定量限 3.线性 4.准确度 5.精密度 6.耐用性(可以做为开发试验的一部分来完成) n在验证试验开始前进行系统适应性试验 2009-1-542 方法验证计划 n确定耐用性的重要试验参数 n方法验证的材料 n已知相关物质的可靠样品 n重要的药品(用于精密度和专属性) n重要的空白对照（用于专属性） n用于准确度的空白对照(用于加样试验) 2009-1-543 方法验证方案 n方案要列出进行验证的方法进行验证的 详细要求 n验证目的和范围 n验证参数 n可接受标准 nsop n偏差和修正 2009-1-544 方法验证报告 验证

24、报告应包括 n验证的目的和范围 n方法的说明 n验证试验过程 n试验结果：图表、图谱、统计数据和认可标准 n偏差和修正的概述 n附录中参考文献 2009-1-545 方法的来源（种类） n原则上，对于各类方法均需进行验证， 但依方法来源的不同对于验证的要求有 所不同。 n根据分析方法的来源，可将方法分为两 大类，即标准方法和非标准方法。 2009-1-546 标准方法 n标准方法也称为正式方法、法定方法 n一般是指已有国家标准的分析方法，who推 荐的分析方法也可作为重要参考。此类方法 在被确定为标准方法前已经过了适当的验证。 在首次采用此类方法前，也应对该方法进行 适当的验证，如进行专属性和

25、精密度的验证， 以便证明在实际的使用条件下该方法也是适 用的。 2009-1-547 非标准方法 1.标准方法的替代方法标准方法的替代方法 此类方法系指由申报者提出的可取代标准方法的替代方法。申 报者在决定采用此类方法时应持慎重的态度，并需提供表明新 方法等同于或优于原方法的依据以及全面的验证资料，包括两 种方法的比较性资料。 2.来自参考文献的方法来自参考文献的方法 是指在专业杂志或著作上发表并介绍的方法，一般要认真对待 此类方法，并需进行全面的验证。应说明参考文献的出处，附 原文及译文。 3.自己建立的方法自己建立的方法 对于某些产品，尤其是创新性产品来讲，由于缺少可参考的方 法，通常需要

26、自己建立一种新的分析方法，对于这类方法需进 行全面而严格的验证。 2009-1-548 标准方法的确认 nusp通论1226标准方法的确认。 n不需要完整的验证 n确认已确信方法起作用 n通过评估验证特征的子数据集来完成 2009-1-549 标准方法通常需确认的参数 分析方法 参数 杂质检查 含量分析 定量 限度 hplc/gc专属性 精密度 专属性 定量限度 专属性 检测限度 精密度 分光光度计 专属性 精密度 定量限度 专属性 检测限度 精密度 滴定法精密度 精密度 tlc专属性 精密度 定量限度 专属性 检测限度 凝胶电泳专属性 精密度 定量限度 专属性 检测限度 原料药和辅料 200

27、9-1-550 标准方法通常需确认的参数 分析方法 参数 鉴别试验 杂质检查 含量分析 定量 限度 hplc专属性 精密度 专属性 定量限度 专属性 检测限度 精密度 专属性 线性、范围 分光光度计 专属性 精密度 定量限度 专属性 检测限度 精密度 线性、范围 滴定法精密度 精密度 线性、范围 tlc专属性 精密度 定量限度 专属性 检测限度 凝胶电泳专属性 精密度 定量限度 专属性 检测限度 制剂 2009-1-551 各种检测方法通常需测定的参数 分析方法 参数 鉴别试验 杂质检查 含量分析 特殊分析 定量 限度 准确性* 精密度 重复性 * 精密度 中间精密度 * * * * 耐用性*

28、 线性 范围 专属性* 检测限度 定量限度 注： 表示通常不需测定的参数 *在一些情况下可能不需要 表示通常需测定的参数 * *如果做了重复性，可能不需要做 2009-1-552 方法再验证 n需要不需要再验证？ n再验证原则：根据改变的程度进行相应的再验 证。 n方法再验证是对分析方法的完善过程，应根据 实际改变情况/定期评估决定是否需要进行再 验证，从而保证所采用的分析方法能够控制药 品的内在质量。 2009-1-553 方法再验证 n在某些情况下需要再验证： n原料药合成工艺改变：可能引入新的杂质，杂质检查方法和含 量测定方法的专属性就需要再进行验证，以证明有关物质检查 方法能够检测新引

29、入的杂质，且新引入的杂质对主成份的含量 测定应无干扰。 n杂质概况发生改变 n制剂处方改变、辅料变更：可能会影响鉴别的专属性、溶出度 和含量测定的准确度，因此需要对鉴别、含量测定方法再验证。 当原料药产地来源发生变更时，可能会影响杂质检查和含量测 定的专属性和准确度，因此需要对杂质检查方法和含量测定方 法进行再验证。 n分析方法发生部分改变：采用高效液相色谱法测定含量时，检 测波长发生改变，则需要重新进行检测限、专属性、准确度、 精密度、线性等内容的验证，证明修订后分析方法的合理性、 可行性。 n分析仪器大修、发现系统偏差、定期评估 2009-1-554 对方法验证的评价 对于方法验证，有以下

30、几个方面值得关注。 1、有关方法验证评价的一般考虑 n总体上，方法验证应围绕验证目的和一般原则来进行， 方法验证内容的选择和试验设计方案应系统、合理， 验证过程应规范严谨。 n并非每个检测项目的分析方法都需进行所有内容的验 证，但同时也要注意验证内容应充分，足以证明采用 的分析方法的合理性。如杂质限度试验一般需要验证 专属性和检测限，而对于精密度、线性、定量限等涉 及定量测定的项目，则一般不需要进行验证。 2009-1-555 对方法验证的评价 2、方法验证的整体性和系统性 n方法验证内容之间相互关联，是一个整体。因此方法验证应注重 整体性和系统性。 n例如，对于鉴别项目所需要的专属性，一般一

31、种分析方法不太可 能完全鉴别被分析物，此时采用两种或两种以上分析方法可加强 鉴别项目的整体专属性。 n在方法验证内容之间也存在较多的关联性，可以相互补充。如原 料药含量测定采用容量分析法时，由于方法本身原因，专属性略 差，但假如在杂质检测时采用了专属性较强的色谱法，则一般认 为整个检测方法也具有较强的专属性。 n总之，由于实际情况较复杂，在方法验证过程中，不提倡教条地 去进行方法验证。此外，越来越多的新方法不断被用于质量控制 中，对于这些方法如何进行验证需要具体情况具体分析。 2009-1-556 生物制品分析方法验证 n生物制品的理化分析方法验证原则与化学药品基本相 同，但同时需结合生物制品

32、的特点考虑。 n生物制品具有多样性和复杂性的特点，分析方法也会 各有特色。 n相对于理化分析方法而言，生物学测定具有更大的可 变性，一般要使用动物、细胞或生物分子，因此对于 生物学测定的判断标准可适当灵活掌握，但是对于定 量测定方法应尽可能减少方法的变异，验证的结果仍 应能证明该方法具有相当的准确性和可靠性，并应以 能够有效控制产品质量为基本标准。 2009-1-557 生物学测定常用方法生物学测定常用方法 n酶反应试验酶反应试验 是指在体外能促进酶分子的活化或本身具备酶的活性，通 过底物的变化检测酶活性。主要用于酶、辅酶、激酶、激活 剂、抑制剂等的活性测定。这类方法的变异相对较小，结果 比较

33、准确。 n结合试验结合试验 是基于产品与某种物质的结合特性而设计的试验，如免疫 结合试验。目前主要用于生物制品的鉴别。由于在结合试验 中测定的分子不一定都具有生物活性，所以一般不用作制品 的活性（或效力）测定。这类方法的变异也相对较小。 2009-1-558 生物学测定常用方法生物学测定常用方法 n细胞测定试验细胞测定试验 是指产品可以诱导细胞产生可测定的应答，如细胞增殖、聚集、分 化、死亡、迁移或产生特定的化学物质等。细胞测定试验一般能较好地 反映制品的生物学活性，常用于各种生物制品的活性（效力）测定。与 上述两类方法相比，这类方法的变异较大。与使用传代细胞相比，使用 原代细胞的方法变异更大

34、。 n动物试验动物试验 是指以整体动物为试验材料检测制品生物学活性（或效力）的试验 方法，如动物保护力试验，一般用于疫苗的效力测定。由于动物实验的 成本高、周期长和变异大，所以一般仅用于成品检定。对于某些治疗用 的制品，由于其作用机理或本身化学性质的原因，难以建立体外测活的 方法，也可以采用动物试验方法测定，但由于这类方法的变异一般相对 较大，在进一步的研究中应尽可能以体外法代替。 2009-1-559 生物制品分析方法验证 n生物制品分析方法的准确性和可靠性与技术方 法本身（包括方法的原理和方法的技术特点等） 密切相关。 n分析方法的验证就是根据方法的需要，测定该 方法的专属性、准确性、精密

35、度、线性、范围、 检测限度、定量限度、耐用性等几个指标中的 一个或几个，用于不同检测目的的试验方法需 进行不同参数的测定。 2009-1-560 各种检测方法通常需测定的参数 分析方法 参数 鉴别试验 杂质检查 生物活性 (效价)测定 含量测定 定量 限度 准确性 精密度 耐用性 线性 范围 专属性 检测限度 定量限度 注： 表示通常不需测定的参数 表示通常需测定的参数 2009-1-561 专属性专属性生物制品分析方法验证 n生物学测定方法的专属性与测定方法及产品组成密 切相关，所以应首先从测试原理、测试用材料和供 试品组成等方面分析方法的专属性，进而再进行必 要的验证。 n由于生物制品的性

36、质和组成多样，检定方法各不相 同，难以提出统一的专属性验证要求。下面以生物 技术产品常用的几种检定方法为例，进行具体分析 及说明。 2009-1-562 专属性专属性生物制品分析方法验证 1、如采用免疫印迹试验进行生物制品的鉴别，应首先对所使用抗体的特 异性进行分析；若供试品中还存在其它组分，则应进一步验证被检测 物中其它物质能否引起非特异性免疫反应。 2、如采用细胞测定方法检测生物活性，应首先说明被测物质与特定的细 胞应答之间的相关性，如二者的相关性较好，则一般认为该方法的特 异性较好。为表明细胞测定方法的特异性，可进行相关试验进行验证， 如加入抗体或特异抑制剂的封闭实验等。如果成品中加入了

37、可能影响 活性测定的辅料，应进行相关验证以排除此种影响。 3、如采用elisa法检测重组产品的残余宿主蛋白含量，可采用与表达体 系相同的宿主细胞的蛋白作为免疫原制备抗体，若采用与产品相似工 艺进行处理后再免疫动物，则所获得抗体的特异性更好。另外，产品 中存在的大量目的蛋白可能影响残余宿主蛋白的测定，应进行相关验 证以排除此种影响。 2009-1-563 准确性准确性生物制品分析方法验证 n对于化学药品一般可采用填加和回收实验来测定，即 对已知量的供试品进行测定，比较测定值和真实值之 间的差异。但对于生物制品而言，由于没有纯的标准 物质，往往难以获得确切的准确性数据，所以一般不 需要准确地测出该

38、参数。然而，仍有一些问题与生物 活性测定方法的准确性密切相关，值得研究者注意。 n生物制品的生物学活性为相对活性，一般与同时进行 测定的标准品/参考品进行比较而得，所以应对单位有 一个适当的定义或以适用的标准品/参考品作为对照经 计算而得。为得到准确的测定结果，应注意以下几点： 2009-1-564 准确性准确性生物制品分析方法验证 1、必须同时测定供试品和标准品/参考品的剂量反应曲线， 而且两条曲线必须具有平行性，即供试品和标准品/参考 品的活性成分仅是量的不同而没有质的区别。如果两条 曲线不具备平行性，则说明供试品和标准品/参考品中的 活性成分可能不同或者该测试系统不具有适用性，这种 情况

39、下，将难以准确计算出相对活性的结果。 2、应尽可能使供试品随机分布及保证测试系统的平衡性。 需对引起系统偏差的某些因素进行分析排除，如不同的 试验平板、平板的不同位置（如边缘效应）、检测次序、 动物实验中的笼子效应等。 2009-1-565 专属性、准确性专属性、准确性生物制品分析方法验证 n专属性和准确性不是每个生物学测定方法都 需要测定的参数，但同样重要，只是对于不 同品种的不同方法应有不同的考虑，在进行 方法验证过程中能有所考虑。 2009-1-566 精密度精密度生物制品分析方法验证 n与理化测定方法相比，各种生物学测定方法的变异均较大， 且不同类制品的生物学测定方法的变异也不同。对精

40、密度 的要求可根据产品的性质、用途以及测定方法的特点有所 区别。在测定方法与生物活性、药理作用或效力相关性较 好的情况下，应尽可能采用变异较小的测定方法。 n由于生物活性（或效价）测定是生物制品质控中的主要指 标，该方法的可靠性会直接影响产品的可控性，所以对生 物活性测定方法的精密度验证工作应非常重视。如果在成 品检定项目中生物活性指标是唯一的测定有效成分含量水 平的指标，则必须采用定量的测定方法，并尽可能减少方 法的变异。 2009-1-567 精密度精密度生物制品分析方法验证 n对于不同测定方法，其精密度可有较大不同，一般情况 下， n酶法：小于20%； n结合试验：小于20%； n细胞试验：小于30%； n动物试验：小于50%。 n对于一些尚不成熟的试验方法或某些特殊方法（如噬斑试验）， 其方法变异可能会更大些。 n当然，对于方法精密度的可接受标准还应从多方面进行 考虑。比如，有些药物的临床效应（包括疗效及不良反 应）对给药剂量的变化非常敏感，这时需对生物活性测 定方法的精密度提出更高的要求。 2009-1-568 精密度精密度生物制品分析方法验证 n从理论上考虑，测定次数主要取决于方法学的误差，变 异大的方法应增加测定次数； n从可操作性角度考虑，对于复杂、成本高及周期长的方 法，重复次数太多，试验难度将很大。 n所以关于验证次数的设计，需综合考虑，应以基本达