基因工程与体外表达

1、1 第八章 基因工程与体外表达 Gene Engineering and Gene Expression 分子生物学研究中心 2 目的要求 掌握：限制性核酸内切酶的概念与特点；质粒 载体的特点；基因克隆的基本过程。 了解：其他常用工具酶的特点。 【重点】基因克隆的基本过程。 3 基因工程是指在体外对DNA分子按 照既定的目的和方案，对DNA进行剪切和 重新连接，然后把它导入宿主细胞，从而 能够扩增有关DNA片段，表达有关基因产 物，进行DNA序列分析，基因治疗，研究 基因表达的调节因子（如启动子、增强子 等），以及研究基因的功能等。 4 第一节 基因克隆的工具酶 一、限制性核酸内切酶 （res

2、triction endonuclease） 从双链DNA内部特异位点识别并且裂 解磷酸二酯键。 5 限制性核酸内切酶的特点 类型 限制性 修饰作用 识别位点 切割位点 型 有 有 特异 识别位点下游100100到1000bp1000bp 型 有 无 特异 可知、固定 型 有 有 特异 识别位点附近切割DNADNA， 切割位点很难预测。 6 2 2限制性内切酶的命名 EcoREcoR E E代表EscherichiaEscherichia属 coco代表coli coli 种 R R代表RY13RY13株 7 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 5 G 3 CTTAA AATTC3 G

3、5 5 5 3 3限制性内切酶的识别和切割位点 通常是4 46 6个碱基对、具有回文序列 （palindromepalindrome）的DNADNA片段，大多数酶是 错位切割双链DNADNA，产生55或33黏性末 端（sticky endsticky end）。 如EcoREcoR切割后产生55黏性末端： 8 PstPst切割后产生33黏性末端： 有一些酶沿对称轴切断DNA，产生平端或 钝端（Blunt end）, 如Sma： 5 -CTGCAG-3 5 -CTGCA G-3 3 -GACGTC-5 3 -G ACGTC-5 5 -CCCGGG-3 5 -CCC GGG-3 3 -GGGCCC

4、-5 3 -GGG CCC-5 9 二、 T4 DNA连接酶（T4 DNA ligase） 催化双链DNA一端3-OH与另一双链DNA的5端磷 酸根形成35磷酸二酯键，使具有相同黏性末端或 平端的DNA两端连接起来。 10 第二节 基因克隆的载体 载体是携带目的基因，使其在宿主细 胞内复制或表达的DNA分子。 11 一、常用的克隆载体 (一)质粒（plasmid） 是存在于多数细菌和某些真核生物染 色体外的双链环状的DNA分子。 12 作为克隆载体的质粒应具备下列特点： （1）分子量相对较小，能在细菌内稳定存 在，有较高的拷贝数。 （2）具有一个以上的遗传标志，便于对宿主 细胞进行选择，如抗生

5、素抗性基因， -半乳糖苷酶基因（Lac Z）等。 （3）具有多个限制性内切酶的单一切点，便 于外源基因的插入。 13 14 ( (二)噬菌体 野生型噬菌体经过改造，已衍生出100多种 克隆载体。 噬菌体载体分为插入型和替换型(置换 型)两类。 目前应用较广的是EMBL系列、gt系列和 Charon系列等。 15 gt10和gt11载体适用于建立cDNA文库。这 两个载体都属插入型载体，能克隆7kb以下的外 源DNA。 gt11为表达型载体。 16 ( (三) M13) M13噬菌体 (M13 phage) 一种大肠杆菌雄性特异丝状噬菌体。 感染细菌 后，经过复制转变为双链的复制型（RF）。复制

6、型 M13可用作克隆载体。 17 18 ( (四) )黏性质粒（cosmidcosmid） 是由噬菌体的黏性末端（cos区）与质 粒重新构建的载体，为双链、环状DNA。其 克隆容量可达4050 kb。 19 ( (五) ) 病毒载体 逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、 EB病毒等作为基因转移的载体。多数病毒 载体均已质粒化，病毒载体质粒主要由病 毒启动子、包装元件、选择性遗传标记， 以及pBR322的复制子组成。 20 二、表达载体 (一) 原核表达载体 表达载体中含有复制起始位点、抗性基 因 、克隆位点 、启动子 、核糖体结合位点和 转录终止信号。 21 multiple cloning si

7、te 22 (二) 真核表达载体 含有原核复制起始位点、抗生素抗性 基因. 还含有真核表达元件,包括启动子、 增强子、克隆位点、 转录终止信号和poly (A) 加尾信号. 23 第三节 基因克隆的基本过程 基因克隆主要步骤： 制备目的基因和选择相关载体 目的基因和有关载体进行连接 重组的DNA导入受体细胞 DNA重组体的筛选和鉴定 DNA重组体的扩增、表达和其他研究 24 （二）从cDNA文库中获得 （三）PCR扩增特定基因 （四）人工合成 一、 目的基因的获得 （一）从基因组文库中获得 25 几种常用克隆载体的比较 注：+ +表示可用；- -表示不可用 比较内容 质 粒 噬菌体 黏性质粒

8、M13噬菌体 克隆容量 10 kb 22 kb 4050 kb 1 kb 基因组DNA文库 - + + - cDNA文库 + + - - 亚克隆 + - - + 序列分析 + + - + E.coli表达 + + - - 二、载体的选择与准备 26 三、DNADNA分子的体外连接 （一）黏性末端 （二）人工接头的使用 （三）加入同聚体尾 （四）平端连接 27 （一）黏性末端 28 （二）人工接头 29 （三）加入同聚体尾 待克隆DNADNA片段 重组质粒 混合、退火 空白质粒 30 （四）平端连接 31 四、外源DNADNA导入宿主细胞 （一）转化（transformation） （二）感染（

9、infection） （三）转染（transfection） 32 五、目的基因的筛选和鉴定 外源基因导入宿主细胞后，筛选含有 目的基因的阳性克隆并加以扩增。 所用的方法主要有遗传学方法、免疫 学方法、核酸杂交法、PCR等。 33 （一） 遗传学方法 插入灭活法 1. 34 2. 蓝-白筛选（互补） 许多载体（如M13M13系列、pUCpUC系列、pGEMpGEM系列）都 含有-半乳糖苷酶基因（laclacZ Z）的调控序列和氨基端 145145个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多 克隆位点。这种载体适用于可编码-半乳糖苷酶羧基 端部分序列的宿主细胞。宿主和载体编码的片段各自 均无酶活性，但它们可以互补形成具有活性的-半乳 糖苷酶，使人工底物X-X-galgal转化成蓝色的代谢产物，出 现蓝色的菌落。如果在多克隆位点上插入外源DNADNA片段， 将使lac Zlac Z基因灭活，不能生成有活性的-半乳糖苷 酶，结果菌落呈现白色。 35 36 37 （二） 免疫学方法 如果克隆基因的产物是已知的，并且 在菌落或噬菌斑中表达，因而可用相应的抗 血清或单克隆抗体，通过放射免疫、化学发 光或显色反应进行筛选。 38 （三） 核