细胞工程基础和植物部分

1、细胞工程：指应用细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的理论与方法，通过类似 于工程学的步骤,在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来对细胞的遗传表型进行定向改造，以获得新型生物或一定细胞产品的一门综合性科学技术。胚胎移植实质上是早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转换，而胚胎本身的遗传物质并不发生改变，因此各种性状均能保持其原来的优良特性。植物组织培养(Plant Tissue Culture):指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞、原生质体等培养在人工配置的培养基上，给予适当的培养条件，诱发产生愈伤组织、潜伏芽，或者长成新的完整植株的一种实验技术。主要用于植物快速繁殖的

2、组培技术植物细胞培养(plant cell Culture)：是指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培 养并使其增殖，获得大量细胞群体的一种技术。植物细胞全能性_ ( plant Cell Totipotency):植物每一个具有完整细胞核的体细胞，都含有植物体的全部遗传信息，在适当条件下，具有发育成完整植株的潜在能力。分化：细胞后代在形态结构和功能上发生稳定性的差异的过程。植物脱分化(Plant Cell Dedifferentiation ):也称去分化，指离体条件下生长的植物细胞、组织或器官经过细胞分裂或不分裂逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生状态，形成无组织结构的细胞团或愈伤组

3、织或不分化细胞的过程。再分化(redifferentiation):脱分化后的分生细胞(愈伤组织)在特定的条件下，重新恢复细胞分化能力，并经历器官发生形成单极性的芽或根，或经历胚胎发生形成双极性的胚状体，进一步发育成完整植物体的过程。愈伤组织(Callus):植物受到机械、动物或微生物等伤害后，创伤部位的细胞脱分化而不 断增殖形成松散排列、无特定结构和功能的非器官化组织。外植体(explant):指将用于离体培养的各种植物材料，如器官、组织、细胞和原生质体 等。当继代培养时，将原培养物切割或不切割转移至新的培养基中的部分也称之为外植体。器官发生(organogenesi :培养条件下的组织或细

4、胞团(愈伤组织)分化形成不定根(adventitious roots )、不定芽( adventitious shoots) 等器官的过程体细胞胚亦称胚状体(somatic embryo或embryoid):在体外，由体细胞(非合子细胞)经 胚胎发育产生的类似胚胎的结构。形态建成(morphogenesis):外植体细胞在适宜的培养条件下发生脱分化、再分化，产生芽 和根，或者形成胚状体，发育成苗或完整植株。人工种子(Artificial Seeds):指通过植物组织培养方法获得发育完全的个体(如胚状体)，将其用适当的方法保护起来用以代替天然种子的一种结构。人工种子包括：胚状体、人工种皮、人工胚

5、乳。体细胞杂交(somatic hybridization)又称为原生质体融合 (protoplast fusion):是指在人工控制 条件下，不经过有性过程，两种体细胞原生质体相互融合产生杂种细胞，并使之分化再生，形成新物种或新品种的技术。花药培养(anther culture):将发育到一定阶段的花药剥离下来(切去花丝部分)接种到培养基上进行培养，最终形成完整植株的过程花粉培养(pollen culture):又称小孢子培养(microspore culture)，或游离小孢子培养 (isolated microspore culture)，是指在无菌条件下，将花粉从花药中游离出来，使其分

6、散或游离态， 发育成单倍体植株的过程。单倍体(haploid):指细胞中含有正常体细胞的一半染色体数，即具有配子染色体数目的个体。动物细胞培养(animal cell culture )是用无菌操作的方法将动物体内的组织或器官取出， 模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养，并观察细胞的生长、发育及衰老等生命现象的 技术。接触抑制(con tact in hibition):细胞从接种到长满底物表面后，由于细胞繁殖数量增多相互 接触后，不再增加。密度抑制(Density Inhibition ):细胞密度增大，培养液中营养减少，代谢产物增多，导致 细胞不在增加培养细胞生命期：细胞在体外培养条件下

7、持续增殖和生长的时间原代培养(Primary Culture):亦称初代培养，指将机体取出的细胞或组织进行实效培养的 过程。原代细胞(primary culture cell ):指实效培养的细胞大约增殖10代左右，称为原代细胞。细胞系(cell line):指由初代培养产生的能进行无限次传代培养的细胞群。继代培养(secondary culture):指培养物在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯 竭，水分散失以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养，这个过程叫做继代培养。器官培养(organ culture):取出动物器官或进一步修整成器官型植块，将其培养使其存活 和生长的过程。

8、细胞融合(cell fusion)又称体细胞杂交，是指将不同来源的原生质体相融合并使之分化再生，形成新物种或新品种的技术。基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体同种细胞在培养时 2个靠在一起的细胞自发合并，称自发融合；异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合，称诱发融合抗原(antigen, ag):进入动物体内对肌体的免疫系统产生刺激作用的外源物质。抗体(antibody，ab):动物免疫系统分泌的中和或消除抗原物质的影响的糖蛋白，存在于血 清中，本质是免疫球蛋白。抗原决定簇(antigenic determinant ):是指抗原分子中决定抗原特异性的

9、特殊化学基团，又称表位(epitope).多克隆抗体(polyclonal antibody):针对多种抗原决定簇的混合抗体单克隆抗体(monoclonal antibody;McAb ):只针对某一抗原决定簇的抗体分子。单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞(myeloma cell)与经特定抗源免疫刺激的B淋巴细胞(antigen stimulated B lymphoblast)融合得到杂交瘤细胞 (hybridoma cell)，杂交瘤细胞既能象骨 髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术(hybridoma tech no l

10、ogy )。胚胎工程(embryo technology):指在胚胎发育过程中进行的生物技术。即对哺乳动物的胚 胎进行某种人为的工程技术操作，然后让它继续发育，获得人们所需要的成体动物的新技术。人工受精(Artificial fertilization ):是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完 成受精过程的技术。胚胎移植（Embryo transplantation ）:也称受精卵移植，是指一头母畜发情排卵并经过配种后， 在一定时间内从其生殖道取出受精卵或胚胎，然后把它们移植到另外一头与供体同时发情排卵、但未经配种的母畜的输卵管或子宫角。这个来自供体的胚胎能够在受体的子宫着床，并继

11、续生长和发育，最后产下供体的后代。胚胎分割（Embryo splitting）:指通过对胚胎的显微外科操作，把一个胚胎分割成两个或多个，由于胚胎发育早期， 每个卵裂球都具有发育成一个完整个体的潜在可能性，因此通过胚胎分割技术，可以人工制造同卵双胎或多胎，可成倍地增加胚胎数和产犊数。可看作是动物无性繁殖或克隆胚胎融合（Embryo fusion）:又称胚胎嵌合，就是将两个不同品种或不同种除去透明带胚（裸胚）粘合在一起，或者各自一分为二，然后各取一半，融合成新的胚胎，或将多个供体细胞 注射入受体胚胎中，移植给受体，产生具有杂交优势的新后代 一一嵌合体。性别控制（sex control）：指通过人为

12、干预或操作手段使母畜繁殖所需要的后代。试管动物（In vitro animal）：指将供体的精子和卵子在体外受精、体外培养胚胎，然后将发 育到一定程度的胚胎移植入受体，可以得到各种动物。由于体外受精一般在试管中进行，所以称为试管动物，也称体外受精动物”。克隆（clone）：克隆是指由一个细胞或个体，通过无性繁殖手段，获得遗传上相同的细胞群 或个体群。干细胞（stem cell）:是一类具有自我复制和分化潜能的细胞。即是一群尚未完全分化的细胞，同时具有分裂增殖成与本身完全相同的细胞，或分化成为多种特定功能的体细胞两种特性。单能干细胞：只能向一种或密切相关的两种类型的细胞分化。多能干细胞：具有分化

13、成多种细胞和组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力。全能干细胞:包括胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES细胞）生殖干细胞（embryonic germcells, EG细胞），具有全能性，能够分化成全身200多种细胞类型，进一步形成机体的任何组织和器官。全能细胞：（totipotent cell，TC）是能够表达生物体基因组的任何一种基因，并能分化出该生物体内任何一种类型的细胞，进而发育为一个完全相同的生物体。转基因动物（transgenic animal）:指通过基因工程技术将目的基因导入生殖细胞、早期胚胎干细胞或早期胚胎，使之整合到受体细胞的基因组中，经发育而产

14、生的个体。动物生物反应器（Animal bioreactor）:指利用转基因活体动物的某种能够高效表达外源蛋白 的器官或组织来进行工业化生产活性功能蛋白的技术，这些蛋白一般是药用蛋白或营养保健蛋白。用于表达的生物反应器包括动物血液、泌尿系统、精囊腺、乳腺等，还包括禽蛋和昆 虫（例如家蚕）个体等。以下可能出填空题：无菌操作仪器设备：超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、过滤除菌装置、干热灭菌烘箱、接种器 械灭菌设备生长素类型：2,4-D（ 2,4-二氯苯氧乙酸）、IAA （吲哚乙酸）、IBA （吲哚丁酸）、NAA （萘 乙酸八IPA （吲哚丙酸）细胞分类素类型：6 BA（ 6-苄基氨基嘌呤）、KT （激动

15、素）、ZT （玉米素）、2ip、TDZ植物细胞全能性表达的条件：离体、一定的刺激植物细胞全能性实现的途径：体细胞、性细胞、原生质体、细胞融合、转基因从离体培养到器官发生经历的三个时期：诱导期、分裂期、分化期形态建成的两种途径：器官发生途径和体细胞胚途径器官发生途径的类型：先根后芽、先芽后根、根芽同时器官分化与植物再生过程：组织（细胞）（形成愈伤组织）T细胞分化T组织分化（拟分 生组织和维管组织结节）T器官分化（芽和根） T植株体细胞胚发育过程：细胞分化T持续细胞分裂增殖 T原胚期T球形胚T心形胚T鱼雷形胚T 子叶期体细胞胚的发生途径：直接从器官外植体上发生、愈伤组织发生、悬浮培养细胞发生、单倍

16、 体细胞发生、原生质体发生离体无性繁殖的类型：腋生枝型、不定芽型、体细胞胚型、原球茎型离体无性繁殖的程序：无菌培养物的建立 T中间繁殖体的增殖 T完整植株的形成（生根培养 T再生植物的驯化和移栽 T 再生植株的鉴定。花药培养的基本程序是：培养材料的选择-材料（花蕾）预处理一外植体消毒灭菌 一接种培养植株再生一诱导生根一单倍体植株的染色体加倍及驯化移栽花粉培养：选择单核中、晚期花粉花粉分离收集：机械挤压法（挤压法、研磨过滤收集法）、自然散落法、机械游离法（磁搅拌法、小型搅拌法）植物胚胎培养： 胚培养（embryo culture）（成熟胚培养、幼胚培养） 、胚珠培养（ovule culture）

17、、 子房培养（ovary culture） 胚乳培养 endosperm culture）、离体受精（in vitro pollination）等胚乳培养（三倍体）的程序：含胚乳的果实或种子 t表面消毒t无菌条件下胚乳的剥离 t接种培养基培养体外培养物的细胞生物学特性：相似性、两重性体外培养细胞的形态：贴附型细胞、非贴附型细胞动物细胞培养的过程：取幼龄动物的组织或器官 T剪碎组织T胰蛋白酶处理 T细胞培养动物培养基的基本条件：营养物质、缓冲能力、等渗性、无菌动物培养基类型：天然、合成、无血清动物细胞培养的传统方法：悬滴培养法、旋转管培养法、灌注小室培养法、培养瓶培养方法、 培养板培养法原代培养

18、分为两种：组织块培养法、组织消化培养（单层培养法）动物细胞大规模培养技术：悬浮培养技术、微载体培养技术、多孔载体培养、微囊化培养技 术、中空纤维法细胞保存需要考虑问题：冷冻速率、复温速率、冷冻保护剂、冷冻保存温度原生质体融合：非对称融合、对称融合细胞融合经历的主要过程：细胞相互靠近 t细胞桥形成T胞质渗透t细胞核融合细胞融合技术：生物法一仙台病毒法（HVJ ）、化学法一PEG结合高pH、高Ca+诱导法 物理法一电融合诱导法 细胞融合的类型：1）同核体一同源原生质体的融合 2）异核体一异源原生质体的融合体 3）多核 体一含有双亲不同比例核物质的融合体比较常用的杂种细胞筛选方法：遗传互补筛选法、抗

19、性互补筛选、生长特性筛选法、物理特性筛选法、其它方法抗原的特点：外源性、结构性、特异性第一章论述题：植物培养基的配置方法与流程：1植物细胞培养基的组成及其配制主要包括：无机营养物质有机化合物生长调节物质水固化剂和悬浮剂辅助性物质2贮备液（母液）的配制与保存母液：将所用培养基配方的化学成分按一定的比例配成浓缩液。配制母液目的：a）方便;b）准确（有些成分量太小）。3详见书本28页-1）.配制溶液 2）.调pH 3）.分装 4）.包扎 5）.培养基的灭菌培养基配制流程图）移母液f |水|培养尊熬制F摄种j F灭茵（4 扎分装（第二章细胞工程实验室组成及无菌操作技术1植物细胞工程实验室的基本组成与要

20、求。细胞工程实验室它必须满足三个基本的需要，即:实验准备，包括培养基配制，洗涤与灭菌等；无菌操作；控制培养。组成：准备室、无菌操作室、培养室2. 无菌操作技术注意事项有哪些？答：（1）进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。（2）不能用手触及已消毒器皿， 如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。（3）为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在 右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。（4） 工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。 同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封

21、闭瓶口直立可 增加落菌机会。（5）吸取营养液、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大 污染或导致细胞交叉污染。（6） 工作中不能面向操作区讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。（7）手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到 瓶口，则应将吸管丢掉。3. 植物外植体的消毒程序如何？如何选择外植体？答：外植体消毒步骤：（1）选择无病斑、虫害植株作为取材母株。将采来的植物材料去掉多 余的部分后，置于自来水龙头下冲洗几分钟至数小时，冲洗时间视材料清洁程度而定。（2） 将流水冲洗干净的材料置于超净工作台上进行边淼浸润消毒。一般先用

22、70%乙醇浸泡2030s。由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用，加之70%乙醇穿透力强，也很容易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长。（3） 用消毒剂对外植体进行消毒处理。表面消毒剂种类较多， 可根据情况选择不同消毒剂。（4）无菌水冲洗外植体的选择： 选择优良的基因型：试验首先要明确目的。例如，蔬菜、作物等的脱毒 快繁，是为了脱去病毒，提高产量和质量，就应选择当地栽培确认的高产优质的品种作为脱 毒的材料，并且品种一定要可靠。花卉、观赏植物的快繁，也应选择有价值的植物。（2）取材：从生长旺盛、健壮、无病虫害的植株上取材。母柱代谢旺盛期切取的外植体再生 能力强，试验容易成功。（3）外植体大小选择：

23、因外植体不同而不同。如利用茎尖培养，茎尖大小对脱毒效果非常明 显。再如幼胚培养，胚龄也非常重要。（4）选择外植体的时期：外植体的生长动态往往与该物种的生长规律（生物钟）有关。因此， 最好在植物生长的最适宜时期取材培养。会得到较好的结果。4. 动植物细胞培养基的组成成分有哪几类，在离体培养中的功能是什么？答：植物：无机营养物质：培养的动植物组织、器官、细胞或者原生质体需要连续的供给某些无机化学 物质，除了 C、H、O之外，需要量比较多的元素叫大量元素，需要量比较少的元素叫微量有机化合物：1维生素类物质：维生素类物质在酶系统中有催化功能。2、AA类物质：绝大多数AA适量时对培养效果都有正向效应。3

24、糖类（碳水化合物）:糖在培养基的作用：a）为细胞提供合成新物质的碳骨架；b）为细胞的呼吸代谢提供底物和能量；c）维持渗透压植物生长调节物质：植物激素是在植物体内合成的，对植物生长发育有显著调节作用的微量 有机物，而植物生长调节剂是外源的调节植物生长发育的物质。固化剂：琼脂、琼脂糖悬浮剂：Ficoll （聚蔗糖）辅助性物质：抗生素、抗氧化物活性炭：具吸附作用；茎尖初代培养可防褐化；促进新梢增殖（浓度0.10.2%）;促进生根；防止组培苗玻璃化（浓度 0.3% ）。利于胚胎培养。水：是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。动物：氨基酸：合成蛋白质原料 ；维生素：调节生长和代谢 ；糖

25、类：提供碳源和能源 ； 无机盐：作为辅基、维持细胞的渗透压和pH生长类因子及激素5. 各种植物激素的作用是什么？如何选择？ 答：生长素的生理作用：促进细胞生长和细胞分裂；诱导受伤组织表面细胞恢复分裂能力； 形成愈伤组织，促进生根；与一定量的细胞分裂素配合共同诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的诱导。细胞分裂素：a）促进细胞的分裂和分化；b）诱导芽的分化；c）促进侧芽的萌发和生长；d）抑制衰老赤霉素（GA3）生理作用：a）诱导茎的细胞伸长，对矮生型植物恢复成高生型特别有效，对根无效b）对形成层的细胞分化有影响，往往同生长素有协同作用。IAA/GA比值高有利于木质部的分化，比值低有利于韧皮

26、部的分化。c）破除种子、鳞茎、块茎休眠，使之提前萌发。d）对生长素和细胞分裂素的活性有增效作用脱落酸（ABA）生理作用：a）抑制蛋白质的合成 b）抵消和抑制生长素、细胞分裂素、GA的作用c）诱导休眠、促进衰老和脱落6 如何筛选培养基？ 筛选合适的培养基 一一组培成功的基础在建立一个新的实验体系时，为了能研制出一种适合的培养基，最好先由一种已被广泛使用的基本培养基（如 MS培养基或B5培养基）开始。当通过一系列的实验，对这种培养 基做了某些定性和定量的小变动之后，即有可能得到一种能满足实验需要的新培养基，选择最佳培养基。筛选：在多种培养基上培养，根据培养物的生长情况，确定较适宜的培养基。调整：根

27、据培养物的生长情况或培养目的的不同，对培养基进行调整，探索新的培养基。如：改良 MS、改良B5培养基、N6培养基等。基本培养基：一般在现有培养基配方中选择。可以参考前人的经验，例如：MS是广谱性培养基，N6用于单子叶植物的培养。豆科多用B5培养基。植物生长调节剂： 必须进行筛选试验。总体原则 -当诱导愈伤组织形成时，细胞分裂素 和生长素相对平衡；诱导芽分化时，细胞分裂素水平应高于生长素，诱导根则要低。天然复合物：如进行器官和组织培养， 一般不加复杂有机成分，而进行细胞和原生质体培养则要加。第三章植物组织与细胞培养的基本原理1. 全能性只是一种可能性，要把这种可能性变为现实性必须满足两个条件：（

28、1） 具有较强全能性的细胞从植物组织抑制性影响下解脱出来，使其处于独立发育 的离体条件下；（2）是要给予它们适当的刺激，即给予它们一定的营养物质，并使它们受到一定的 激素的作用。 细胞全能性的表达，离体是前提，激素是重要调控方式。2. 胚状体可从离体培养的各种外植体上直接或间接地发生，大致分为五种:直接从器官外植体上发生（以叶片为例） 愈伤组织发生 悬浮培养细胞发生 单倍体细胞发生 原生质体发生3. 人工种子结构：由胚状体（或芽等）、人工种皮、人工胚乳组成。胚状体：是有生命的物质结构人工胚乳：是人工配制的保证胚状体生长发育需要的营养物质， 一般以生成 胚状体的培养基为主，外加一定量的植物激素、

29、抗生素等物质，尽可以提供胚状 体正常萌发所需条件。人工种皮：提包裹在最外层的胶质化合物薄膜。4. 胚状体发生途径与器官发生途径形成植株的异同点答：胚状体发生途径与器官发生途径（不定芽/根）形成植株的区别：胚状体具有两极性（double polarity）,即有茎端和根端。器官发生是单极性.胚状体维管组织的分布是独立的“ Y ”字形，与外植体组织无结构上的联系，出现所谓的生殖隔离现象，器官发生中，不定芽一般在愈伤组织的表面，不定根一般发生在愈伤组织较深的部位，且两者与外植体或愈伤组织的维管组织相联系胚状体形成的再生植株遗传性相对稳定，变异性小于由器官发生的植株5. 器官发生方式再生植株的三种方式

30、： 可能先长芽后长根（常见）。 形成根，根上再长出芽（少见）。 在愈伤组织不同部位分别形成根和芽。以上三种方式，可通过器官直接发生途径外植体t器官（不定芽）或器官间接发 生途径外植体t愈伤组织 t器官完成第四章植物离体无性繁殖和脱毒技术离体无性繁殖（clonal propagation in vitro）又称微繁殖（micropropagation）或离体快 繁（rapid vegetative progagatio n）指利用组织培养方法进行将优良植株的茎尖、腋 芽、叶片、鳞片等器官、组织和细胞进行离体，在短期内获得大量遗传性一致个体的方法。所获得的株群称单株无性系或单芽无性系1. 植物离体

31、无性繁殖的概念、类型、程序答：离体无性繁殖又称微繁殖或离体快繁指利用组织培养方法进行将优良植株的茎尖、腋芽、叶片、鳞片等器官、组织和细胞进行离体，在短期内获得大量遗传性一致个体的方法。 所获得的株群称单株无性系或单芽无性系。离体无性繁殖的类型：腋生枝型（腋芽萌发）；不定芽型；原球茎型；体细胞胚型（前 3个为器官发生型）程序：1.无菌培养物的建立2.中间繁殖体的增殖；3.完整植株的形成（生根培 养）；4.再生植物的驯化和移栽；5.再生植株的鉴定。2. 无性繁殖过程中三大问题产生的原因及防治方法答：三大问题：污染、褐变和玻璃化。（1） 污染的途径，主要是由外植体带菌（主要原因） 、培养基及器皿灭菌

32、不彻底或操作人员 未遵守操作规程而引起； 培养过程中，培养室内不洁净， 培养容器内外气体交换也会引起污 染。防治方法：在建立培养体系时， 对初期培养物要进行严格审查，除去任何已污染的培养物。对那些缓慢生长或难以直接观察到的污染的检测，可利用一些细菌学培养基，通过微生物方法进行检测。通过采取外植体热处理、取小的茎尖培养或使用抗生素等方法可以防止外 植体带菌引起的污染。（2）外植体褐变是指在接种后，其表面开始 褐变，有时甚至会使整个培养基褐变的现象。它的出现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞的代谢发生变化所致。褐变的避免方法：向培养基中添加抗氧化剂或吸附剂；用抗氧化剂溶液预处理外植体，

33、或在抗氧化剂溶液中切割、 剥离外植体；将褐变外植体及时地转移到新鲜培养基上；将培养物置于相对较低温度及黑暗或弱光条件下有助于减轻褐变。（3）培养基成分、培养条件等多种因素对玻璃化苗的产生有重要影响。玻璃化避免方法：增加培养基中蔗糖和琼脂的浓度或加入渗透剂，降低培养基渗透势； 降低铵态氮、提高硝态氮的含量； 降低培养温度，增加自然光照； 改善容器的气体交换情况，降低容器内的相对湿度； 在培养基中添加间苯三酚、根皮苷或生长抑制剂等物质； 降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑加入适量脱落酸，调整激素配比。3. 植物脱毒的方法及原理（1）物理方法：热处理法：依据病毒对高温（35C40C）的敏感，寄主耐

34、高温。利用这一差异， 选择适当的温度和处理时间，进行高温处理，就能使寄主体内病毒浓度降低，传 递速度减慢或失去活性，而寄主细胞仍然存活，并加快分裂和生长。热处理不能 杀死病毒。只能钝化病毒的活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止， 而失 去浸染能力。低温处理法（2）化学方法（3）生物学方法1茎尖分生组织培养：主要是利用病毒在植物体内分布的不均匀性：植物体病毒的移动主 要靠2条途径：一是通过维管系统，而分生组织中尚未形成维管系统；二是通过胞间连丝， 但这条途径病毒移动速度非常慢， 赶不上茎尖和根尖细胞不断分裂和活跃的生长速度。当植物细胞分裂 DNA复制时，病毒 DNA随着复制。因此，植物细胞分

35、裂和病毒繁殖之 间存在相互竞争。在旺盛分裂的分生组织中，代谢活动很高，正常核蛋白合成占优势， 使病毒无法进行复制。 茎尖中存在高水平内源激素，可抑制病毒的增殖。 在植物体内存在有一种 病毒钝化系统”，在分生组织中的活性最高，因而使分生组织不受 侵染2微茎尖嫁接脱毒是一种将茎尖脱毒与嫁接结合的方法。微茎尖嫁接脱毒主要程序：无菌砧木培养t茎尖准备t嫁接t嫁接苗培养t移植3. 愈伤组织培养脱毒愈伤组织细胞带病毒不均一，部分细胞不带病毒。多次继代的愈伤组织中病 毒浓度下降。甚至检测不出病毒。愈伤组织细胞生长比病毒复制更迅速；愈伤组织细胞在增殖过程中发生了抗病毒突变。4. 珠心胚脱毒法柑橘类多胚品种中除

36、了一个受精胚以外，尚有多个由珠心细胞形成的无性胚，称为珠心胚。珠心胚与维管束系统无联系，因此由珠心胚产生的植株全部均 无病毒。但珠心胚 大多是不育的，必须分离培养才能发育成正常的幼苗。第五章植物细胞培养和次生代谢产物生产1. 单细胞分离与培养的方法答：分离：1）机械法：指通过机械磨碎、切割植物体从而获得游离的单细胞。优点：细胞不受酶伤害。 缺点：只适合于排列松散的薄壁细胞、效率低、产量少。2 ）酶解法：指用专一的水解酶（纤维素酶、果胶酶、琼脂酶等）在温和条 件下分解胞间层，分离细胞。优点：最有效的一种方法。缺点：成本较高，酶对细胞有一定伤害。（1） （2）是从完整细胞中分离3）由培养组织分离单

37、细胞：指将愈伤组织反复继代，再转移至液体培养基 振荡培养。添加生长素或酶有利。培养：（1）平板培养法：指将一定量细胞接种到或混合到一薄层固体培养基里进行培养的方法。（2）看护培养：是指用一块活跃生长的愈伤组织来促进培养细胞持续分裂和增殖的培养 方法。（3）悬浮培养：指将细胞接种于液体培养基中，在保持良好的分散状态下培养（4）微室培养：是指在人工制造的无菌小室中， 将一滴悬浮细胞液培养在少量培养基上， 使其分裂增殖形成细胞团的方法。补充：饲养层培养：是用处理过的、无活性或分裂慢的细胞来饲养所需培养的细胞，使其 分裂和生长。液体浅层静置培养法： 指将一定密度的悬浮细胞放在培养皿中形成一浅薄层，封口

38、静止培养。该方法优点：易于补加新鲜培养基，便于镜检2.植板率植板率是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞总和中所占的比例每个平板形成的细胞团数11板率每个平板接种的细胞总数3植物细胞大规模培养的方法及其优缺点主要有悬浮培养（成批培养、连续培养和半连续培养）和固定化培养（包埋法和吸附法）植物细胞大规模悬浮培养的优点1）可以增加培养细胞与培养液的接触面，促进营养吸收。2）可带走培养物产生的有害代谢产物，避免高浓度积聚对细胞的伤害。3）保证良好的混合状态，从而获得良好的气体传递效果细胞固定化指将游离的细胞包埋在多糖或多聚化合物制备成的网状支持物中，培养液呈流动状态，进行无菌培养的一种技术。优点：1）细胞

39、生长较慢，有利于次生代谢物的积累。2）易控制化学环境、收获次生代谢产物。3）细胞经包埋后受剪切力损伤小。4）有利于进行连续培养和生物转化。4.细胞株的指标 答：细胞株指标有（1）分散性好，适合大规模悬浮培养。（2）均一性好，细胞大小、生理状态一致。（3）生长速度快，培养周期短，不易染菌。（4）目标产物含量高，容易分离提取。（5）细胞遗传稳定。5影响次生代谢产物生产的影响和提高次生代谢产物生产效率的途径与方法影响次级代谢产物的因素1）生物因素-细胞株、细胞凋亡、细胞团、生物合成机制2）化学因素：主要通过合适的培养基选择来控制，包括营养盐、前体、诱导子（狭义诱 导子和广义诱导子）、反馈抑制和调节因

40、子等。3）物理因素：主要包括：光照、温度、通气、搅拌、pH值等4）工程技术问题：培养液的流变特性、气体传递、搅拌与剪切力、泡沫与器壁表面粘附性 培养设备：选择或设计合适的生物反应器。培养工艺：诱导子添加、前体喂养、添加竞争途径代谢产物抑制剂、培养条件（培养基、环境条件）优化与控制、流加培养、起始材料的选择。培养技术：固定化培养技术、两相培养技术、两步法培养（第1步细胞生长；第2步产物积累）、毛状根培养技术、冠瘿培养技术、反义技术）。5植物细胞大规模培养生产次生代谢物的基本程序：诱导植物产生旺盛生长的愈伤组织和悬浮细胞系；筛选高产细胞系（株）； 在生物反应器中进行大规模培养，获得所需次生代谢物；

41、第六章植物原生质体培养和体细胞杂交原生质体（protoplast）是指除去细胞壁后裸露的有生活力的原生质团。原生质体的特性：去壁的原生质体容易实现外源遗传物质的导入和吸收。原生质体具有细胞全能性。不同来源的原生质体具有彼此融合的能力。1原生质体纯化的方法 答：原生质体的纯化方法有：1）过滤-离心法：利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中，先进行过滤然后低速 离心，使纯净完整的原生质体沉积于试管底部。优缺点：纯化原生质体比较简单。由于原生质体沉积于试管底部，造成相互挤压，常引起原生质体的破碎。2）漂浮法：采用比原生质体密度大的高渗溶液（蔗糖、Percoll、Ficoll），使原生质体漂浮在液体表

42、层的纯化方法。优点：（1）可以避免分离的原生质体因震荡被组织碎片撞击而破损。（2）所用药品简单，成本低。缺点及补救措施：对离心力要求比较严格，掌握不好，原生质体则不易漂浮。可采用不同浓 度和不同离心速度分次漂浮的方法。3）界面法：又称不连续梯度法，采用两种密度不同的溶液形成不连续梯度，通过离心使原 生质体与破损细胞分别处于不同液相中，从而纯化原生质体的方法。优点：可以收集到数量较大的纯净原生质体，同时避免收集过程中原生质体因相互挤压而破碎。2制备和培养原生质体的步骤（不确定）3原生质体融合的类型答：原生质体融合的类型有1）自发融合：同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并，称自发融合；2）诱

43、发融合：指将植物原生质体制备出来后，再加入诱导剂或用其他方法促使两亲本原 生质体融合的方法。4原生质体融合有哪几种方法？答: 1）化学诱导融合：无机盐诱导融合法、高pH-高Ca2+诱导融合法、PEG诱导融合法、PEG- 高pH-高Ca2+诱导融合法2）电诱导融合法：利用改变电场来诱导原生质体彼此连接成串，再施以瞬间强脉冲使质膜发生可逆性电击穿而使原生质体融合的方法。3）自发融合：同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并，称自发融合第七章植物花药和花粉培养及单倍体育种1花药培养和花粉培养的异同点答：花药培养（anther culture）:将发育到一定阶段的花药剥离下来（切去花丝部分）接种到培养基上进行培养，最终形成完整植株的过程。（属于器官培养）花粉培养（pollen culture）:又称小孢子培养 （microspore culture），或游离小孢子培养 （isolated microspore culture），是指在无菌条件下，将花粉从花药中游离出来，使其分散或游离态，发 育成单倍体植株的过程。（属于细胞培养）两者之间的异同：培养目的相同，均获得小孢子植株。花药培养其外植体是植物雄性生殖器官的一部分，就培养方法和技术来讲，属于器官培养； 而花粉培养属于细胞培养。花粉培养没有药壁组织干扰；可计数小孢子产胚率；可观察雄核发育的全过程；单