分子信标新型核酸分子探针教材

1、分子信标：新型核酸分子探针 摘要： 分子信标是基于荧光共振能量传递原理设计的一种发夹型寡聚核酸分子荧 光探针，能够与待测核酸序列分子相互作用发生结构变化产生不同强度的荧光信 号及电化学信号等，具有高灵敏度、高选择性、适于活体检测等优点。本文介绍 了分子信标的作用原理， 不同的分子信标类型以及应用， 最后对前景作出了预测。 关键词：分子信标 荧光探针 灵敏度 选择性 活体检测 引言： 从 20 世纪 60 年代初至今， 分子信标 ( Molecular beacon,MB)已被广泛地应 用于生物、药物、化学等多个领域 【1,2,3,4】。近年来，MB特别是基于 DNA 结构的 MB ，已成为一种

2、重要工具，用于核酸的复制、重组、翻译和表达的研究 【5,7,12】。 为了满足后基因组时代的发展需求， 人们通过各种分子工程策略， 发展了许多敏 锐性更高、选择性更优的 MB 。 自从 1996 年 Tyagi 和 Krame【 6】首次建立了分子信标探针，由于其独特的性 质和多功能性，如操作简单、灵敏度高、特异性强等。在它出色地完成了液相靶 标测定 (实时 PCR测定)任务之后，人们又将其应用于核酸实时定量测定、 活体分 析、化学与生物传感、疾病基因检测与诊断等研究中 【8,9,10,11】。又由于易于对其 进行修饰和改性， 在这十来年的发展中， 人们在经典分子信标模型的基础上， 设 计出了

3、许多新型的分子信标，如无茎分子信标，用 PNA【13】链代替 ssDNA 形成 的 PNA 分子信标，以及 LNA 分子信标等。 这些新型的分子信标是为了满足不同 的需要而设计的， 特异性更强，稳定性更好， 为许多新的研究领域提供了一个平 台。为了满足基因组学和蛋白质组学的发展， 对分子信标的固定化也成了必然的 发展趋势，自从谭蔚泓 【14】首次将分子信标固定在硅胶上以来， 固定化分子信标 也迅速发展起来。尤其是后来设计的将分子信标固定在金表面【15,16】，利用金的 强摩尔消光系数进行淬灭， 简化了分子信标的设计， 更加方便对其进行操作， 大 大促进了基因微阵列技术的发展。 1 分子信标的结

4、构和作用原理 分子信标的结构 （图 1） ：分子信标是一种设计巧妙的荧光探针。常规的分子信标 是由一段包含了茎一环结构的单链寡聚核苷酸组成， 形成一个发夹型结构。 在其 环状部分，一般是一段长度为 1530 碱基的序列，能与目标分子特异结合，茎 区是长度为 58 碱基的互补序列，茎区的两端分别连接有荧光基团和淬灭基团。 为了保证分子信标的灵敏度和热力学稳定性， 在其茎干区设计的碱基数目一般为 其环区的一半。过长，则灵敏度下降；过短，则稳定性下降。由于分子信标杂 交前后环状区与目标分子的双链结构之间存在热力学平衡关系， 使它的杂交特异 性明显高于常规的线状探针。 近来， Dubertret 等

5、17 用金纳米粒子簇代替 DABcYL 做淬灭剂，可以通过调节 金纳米簇的形状、 大小和组成而得到不同的淬灭剂。 由于金纳米簇对荧光试剂有 着更高的淬灭效率，所以用金纳米粒子代替 DABcYL 后，大大提高了分子信标 的灵敏度和特异性。其它的淬灭基团还有铜离子螯合物 【18】、超分子淬灭剂 【19】 以及直接利用碱基 【20】本身做淬灭剂等。 图1 典型分子信标结构 另一种结构的分子信标是无茎分子信标。 与经典分子信标结构类似， 无茎分 子信标只是不再含有双链结构的茎杆区， 只含有单链的环状结构， 具有很好的柔 韧性。目前的无茎分子信标有 PNA【21,22,23】和 DNA 【24,25,2

6、6】两种，自由状态时， 由于荧光分子与淬灭分子之间的疏水作用使得无茎分子信标近似于一个闭环结 构。当分子信标与靶序列结合后， 探针与靶标形成的双链由于具有刚性使得荧光 分子与淬灭分子分开， 荧光恢复。 无茎分子信标与标准分子信标相比， 由于其柔 韧性增加，所以在体系中检测时，对靶标的响应加快，特异性也增强，又因为其 不需要茎的结构， 在设计和合成上相对简单， 成本降低。但其结构上缺少了茎区， 稳定性有所下降，背景荧光相对增强。 分子信标作用原理： 在自由状态下， 分子信标以发夹结构存在， 茎区的碱基 互补配对，使连接在探针的 5端荧光基团及 3端的淬灭基团相互接近 （约为 7 10 nm）。当

7、一定波长的激发光照射时， 荧光分子和淬灭分子之间发生荧光共振 能量转移。荧光基团受激所产生的荧光被淬灭基团吸收，并以热量的形式散发， 荧光几乎完全淬灭，此时荧光背景极低 （如图 2）。加入与环状区互补的靶核苷酸 序列后，分子信标可与之形成相对刚性并且更加稳定的双链体， 使茎干区的互补 链被拉开，从而使得荧光基团与淬灭基团分开，空间距离增大，根据 Forster 理 论，中心荧光能量转移效率与两者距离的 6 次方成反比。 杂交后， 分子信标的荧 光几乎完全恢复。 并且荧光强度与溶液中靶标序列的量成正比， 所以可以用来作 定量分析。 图 2. 分子信标作用原理 2 分子信标的类型 2.1 双重荧光

8、共振能量转移 (FRET) 分子信标 双重荧光共振能量转移 (FRET)( 图 3)分子信标是指在一个体系中同时设 计了两种分子信标， 只有通过这两种分子信标的相互作用才能实现检测。 其中一 个分子信标包含一个荧光给体基团和一个淬灭基团， 另一个分子信标包含一个荧 光受体基团和一个淬灭基团。 在自由状态时， 荧光给体基团和荧光受体基团都处 于荧光淬灭状态， 当在体系中加入目标分子时， 这一对分子信标同时打开， 荧光 给体基团与荧光受体基团头对头地与目标分子特异性结合， 此时，两基团彼此挨 得很近 (6 nm)，发生荧光共振能量转移，给体分子将能量传递给受体分子，受 体分子获得能量发出特征荧光。

9、 通常用来做荧光给体的是镧系元素螯合物， 有机 荧光团作为荧光受体。因为镧系元素螯合物的荧光发光寿命很长 (约 1 ms)，发出 的光的带分布很窄， 在某一些波长区域， 几乎不发荧光， 而且还能有效地降低荧 光受体基团、 实验中干扰物以及池子自身的荧光， 使得在某一些波长区域的背景 荧光几乎接近零， 大大地提高了信噪比， 从而提高了检测的灵敏度， 所以很适合 于作为荧光给体材料。 因为常规的分子信标用于活体检测时， 由于细胞内的环境 比较复杂， 如可能被细胞内的核酸酶降解或非特异性地与核酸结合蛋白结合， 而 导致假阳性信号。但采用这种双重荧光共振能量转移 (FRET) 分子信标，因为只 有当荧

10、光给体基团与荧光受体基团同时发生杂交时， 才能发出受体基团的特征荧 光，所以能大大地减小假阳性信号。 与以前的双线型探针相比， 采用这种方法能 显著地降低由于光谱重叠而产生的高背景信号， 提高检测灵敏度， 还能区分单碱 基多态性 【28,29】。因此，这种分子信标将会成为基因表达实时监测，活体细胞定 量检测的有力工具 【30,31】。 图 3 FRET 双分子信标 2.2 超级猝灭基团分子探针 (SQ-MB) SQ-MB 是一个一端具有多个猝灭基团的荧光分子探针 【32,33】，如图 4 所示。近年 来，MB 被广泛地应用于生物技术研究的各个领域。 但由于 MB 结构中的荧光基 团不能被有效地

11、猝灭， 较高的背景噪音严重影响了实际应用过程中测试结果的准 确性。因此，通过结构的优化以降低体系的背景噪音越来越受到关注。据报道， 应用多个猝灭基团与一个荧光基团配对， 可以有效地提高猝灭效率。 这是由于多 个猝灭基团可以提高吸收效率、 增强猝灭基团与荧光基团问的偶极一偶极配位能 力，从而提高猝灭效率。 图 4 包含 3个淬灭基团的分子信标 2.3 锁定分子信标 随着分子生物学的发展， 对分子信标的应用也不仅仅限于体外检测。 活体检 测是目前发展的一个很重要的方向， 但由于活体内的环境比体外要复杂得多， 如 活体内存在的核酸酶能快速地将常规的分子信标分解， 造成假阳性信号。 对分子 信标进行修

12、饰 【34】就是为了有效地避免核酸酶等外在物质的影响而进行的。 而锁 定分子信标正是为了满足这一发展需求而设计的一类稳定性、 选择性和灵敏度都 非常高的核酸探针。 LNA 【35,36】是将核苷酸中的核糖的 2一 O 和 4一 C用一 个亚甲基连结起来， 形成一个核糖双环结构， 改变了它的几何和立体性质， 减小 了核糖结构的柔韧性， 从而显著地提高了它的稳定性。 但修饰后的核酸依然保持 了双螺旋结构， 对互补链的亲和度不受影响， 在水中的溶解度也能保持一样， 还 因其带有一定的负电荷， 用带正电荷的脂质体就能很容易地将其导入细胞内， 且 它的合成方法也与合成 DNA 的方法类似。因此，鉴于 L

13、NA 的上述性质，在实 验室用 LNA 操作起来就比 DNA 方便，能够简化实验过程。 图 5 LNA/2 -O-methyl RNA 探针 【37】 Irina【37】 等用 LNA/2 -O-methyl RNA 嵌合探针用于活细胞中 mRNA 中的动态 成像。实验结果表明该方法与普通的分子信标相比，与 mRNA 的杂化率更高。 2.4 无茎分子信标 在实际的检测中， 荧光基团和淬灭基团仅仅只是一个辅助基团， 真正起识别 作用的只是分子信标的环状部分。无茎 PNA 能快速地与目标链结合，减少检测 时间，并且在复杂的体系中也能保持相对的稳定性。如将其与 PNA 结合使用， 还可用于 DNA

14、和 RNA 的检测，背景信号低 【38】（图 6）。 图 6 stemless FIT PNA beacons in the detection of complementary nucleic acids 2.5 荧光波长转移型分子信标 图7 荧光波长转移型分子信标 在常规的分子信标基础上， Carolin【 39】等设计了另一种分子信标。 他们在分 子信标茎部加入两个发色团噻唑橙和噻唑红作为人工碱基， 两者间可发生能量转 移，用 490nm 的光照射，发射峰在 670nm，由绿光变为红光，然而当该分子信 标与目标链结合后， 荧光降为 530nm，该方法的优势在于不需要淬灭剂， 而且背 景信

15、号低。 3 固定化分子信标 分子信标对靶序列的检测尽管十分灵敏， 但早期发展起来的分子信标都是用 于液相中的检测，这样就限制了分子信标在活体生物医学研究和 DNA 生物传感 中的大规模应用。 但如果能将不同序列的多种分子信标固定在固体基片表面， 并 保持其原有性质不变，无疑将可用于 DNA 的大规模并行检测，大大提高分析效 率。而目前固定化的分子信标从检测方式上来分有基于荧光和基于电化学的两 种。 3.1 基于荧光检测的固定化分子信标 这一方向的固定化分子信标开展得相对较早， 而且在这几年的发展中也取得 了不小的进步。谭蔚泓等【14,41】于 1999年首次通过生物素一抗生物素蛋白将分子 信标

16、固定在硅片表面 （图 8）。他选取靠近淬灭基团的茎干区做固定点，将生物素 标记到 ssDNA 上，因为这样对分子信标的荧光、淬灭以及杂交影响最小，再将 标记好的分子信标连接到标记有亲和素的硅胶表面。 为了尽可能地减小固定化的 分子信标产生的光漂白现象， 他们采用罗丹明作为荧光基团。 这种固定化的分子 信标可以用于均相液态环境以及固液界面等较为复杂的环境中， 其杂交能力， 亲 和性等性质基本不变，能检测到的靶序列浓度达纳摩尔级。 图8 固定化分子信标 3.2 基于电化学检测的固定化分子信标 分子信标的荧光检测方法在过去的十来年中在实验室已经取得了很大的发 展, 然而，固定化分子信标用于电化学检测

17、也有报道。 2011年，湖南大学的 Liu C 【40】等人用固定化分子信标通过电化学方法检测铜绿单胞杆菌的rRNA ，如图 9 所示，起初，信标环成闭合状态， 当加入目标链和链霉素辣根过氧化物酶 （ HRP） 后，分子信标构型发生改变，目标链与信标环杂交，导致茎部打开，底部的生物 素结合到基底上，而 HRP 结合到另一端，同时产生电化学信号。该方法的检测 限可达到 0.012pg/mL，显示了极高的灵敏度。 图9 基于电化学方法的固定化分子信标 4 分子信标的应用 4.1 用于核酸检测分析 分子信标在液相反应体系中的一个最大的优势就是不需对多余的分子信标 进行分离就可以检测， 所以它最开始的

18、应用便是用于 PCR 的检测体系中 【42】。由 于它的背景信号很低， 在每一轮的反应中当在反应体系中加入与扩增序列互补的 分子信标时， 根据荧光强度的变化即可对扩增过程进行实时监测， 还可对体系中 的扩增靶标量进行定量。 Michael【43】等用锁定分子信标作为荧光探针用于细胞内 核酸检测在 DNA 的体外检测中。 Wu【44】等用分子肽信标比率计传感检测核酸， 通过结合核酸前后荧光截然不同的变化， 该信标还可用于细胞内核酸成像。 Fu【45】 等用 DNA 酶分子信标探针用于靶诱导信号放大比色法检测核酸，该方法通过巧 妙的设计，使得待检测 DNA 循环检测，信号放大，达到了 10nm 的

19、检测限，比 已报道方法低 20 倍。 4.2 用于蛋白质检测分析 尽管最初设计分子信标的目的是用来特异性地检测核酸， 但当这些探针与蛋 白质结合时， 发现其荧光强度也会增加， 这说明分子信标对蛋白质也有一定的识 别能力，而核酸识体对蛋白质的亲和力和特异性可与蛋白质的抗体相媲美， 解离 常数通常在纳摩尔到皮摩尔之间， 且与抗体相比具有许多优越性。 如核酸识体是 体外人工化学合成，合成简单，稳定性、重现性好，容易修饰，可以按需要对序 列中的核苷酸定点标记各种官能团和报告基团 （如荧光基团 ），便于核酸识体的固 定化和信号的检测， 检测目标广泛等。 所以将分子信标和核酸识体有机地结合起 来，这样得到

20、的组装体叫做分子信标识体，它一般是一种单链 DNA 或 RNA 分 子，通常含有 25 60 个核苷。 目前将分子信标识体用于蛋白质的研究中，研究得比较多的是凝血酶的检 测。 Zhang【46】等设计了一个基于 G 四聚体结构分子信标的双功能比色寡核苷酸 探针，可以用于凝血酶的检测。 它是将识体的两端分别连接上荧光基团和淬灭基 团，在凝血酶的存在下， 分子信标主要是以四螺旋 (Quadruplex form)的形式存在， 迫使荧光基团靠近淬灭基团， 使荧光淬灭， 但当不存在凝血酶时， 它可以采用任 意的构型，结合前后构型的变化就是分子信标识体信号转变的基础。 4.3 DNA 芯片与 DNA 传

21、感器 传统的 DNA 芯片是采用线型 DNA 探针作为捕获探针，这种方法最大的缺 点是需要对目标链进行标记，这样既耗时耗力，又容易增加在分析过程中误差。 而基于分子信标的 DNA 芯片，展现出更好的稳定性、选择性和更高的特异性， 而且与其它类型探针的 DNA 芯片相比，分子信标芯片具有背景荧光低、无需除 去多余的探针、 可多次使用等优点。 鉴于分子信标在核酸、 蛋白质检测分析中的 这些优点， 分子信标作为生物芯片、 生物传感器中的探针分子， 具有很大的意义 【47】 5 小结与展望 分子信标作为一种核酸探针， 由于其巧妙的设计和独特的性质， 引起了研究 者们极大的兴趣。尽管其最初的设计目的是利

22、用它在检测前后荧光强度的变化来 对核酸进行定量检测，特别是用作实时荧光 PCR 反应的探针。在这十来年的研 究中，针对分子信标在实际应用中遇到的种种问题， 出现了一系列新型的分子信 标，从 DNA PNALNA ，其应用领域也从对一般 PCR 产物进行实时定量、定 性分析、基因的点突变、 SNP(单碱基多态性 )、等位基因分析发展到用于活体的 核酸代谢分析、 DNA 与蛋白质相互作用分析、 DNA 传感器、DNA 芯片等 【48,49,50】 随着分子信标在分子生物学应用领域中的进一步拓宽， 分子信标在以下几个方面 有望得到进一步的突破： (1)在保持其精简构型的前提下，拓宽分子信标适应的 条

23、件范围，增强其稳定性， 提高选择性，使其能应用于大量疾病诊断和复杂条件 下基因表达检测中。 (2)进一步降低背景信号，提高分子信标的信噪比，使其灵 敏度和特异性有进一步的突破， 如选择合适的荧光基团淬灭基团对， 或对分子信 标进行修饰。以满足基因结构、疾病诊断、疾病机制、药物筛选等方面的应用 【51,52】 (3)优化分子信标的碱基序列和设计，使其能更好地应用于功能基因组、蛋白质 组学的研究中。 参考文献 1.Dave N, Liu J W. Fast Molecular Beacon Hybridization in Organic Solvents with Improved Target

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