蛋白质组学的研究策略与应用

1、食品分子生物学进展食品分子生物学进展- 蛋白质组学的研究策略与应用蛋白质组学的研究策略与应用 分子生物学分子生物学 分子生物学分子生物学(molecular biology)(molecular biology)从从分子分子水平研究水平研究生物大分子生物大分子的结构与功能从而阐明的结构与功能从而阐明 生命现象生命现象本质的科学。本质的科学。 生物大分子生物大分子，特别是，特别是蛋白质蛋白质和和核酸核酸结构功能的研究，是分子生物学的基础。结构功能的研究，是分子生物学的基础。 食品分子生物学食品分子生物学 以以人和食物的关系人和食物的关系为中心，研究为中心，研究生物大分子生物大分子的结构与功能从而

2、明确的结构与功能从而明确营养素与基因的相互作用及对人类健康营养素与基因的相互作用及对人类健康 的影响的影响，实现，实现食品的分子加工食品的分子加工以及以及食品的安全检测食品的安全检测等目的。等目的。 蛋白质分子结构的组织形式： 一级结构：分子中氨基酸的排列顺序。一级结构：分子中氨基酸的排列顺序。 二级结构：肽链主链原子的局部空间排列。二级结构：肽链主链原子的局部空间排列。 三级结构：二级结构在空间的各种盘绕和卷曲。三级结构：二级结构在空间的各种盘绕和卷曲。 四级结构：有些蛋白质分子是由相同或不同的亚单位组装成，亚单位间的相互关系叫四级结构：有些蛋白质分子是由相同或不同的亚单位组装成，亚单位间的

3、相互关系叫 四级结构。四级结构。 发现和鉴定具有新功能的蛋白质发现和鉴定具有新功能的蛋白质，仍是蛋，仍是蛋 白质研究的内容。白质研究的内容。 例如与基因调控和高级神经活动有关的蛋例如与基因调控和高级神经活动有关的蛋 白质的研究很受重视。白质的研究很受重视。 蛋白质组（蛋白质组（proteomeproteome）：）： 一个基因组在一种细胞、组织或生物体表达的所一个基因组在一种细胞、组织或生物体表达的所 有蛋白质构成的整体。有蛋白质构成的整体。 蛋白质组学（蛋白质组学（proteomics)proteomics)： 研究细胞、组织或生物体中蛋白质组组成、定位、研究细胞、组织或生物体中蛋白质组组成

4、、定位、 变化及其相互作用规律的科学。变化及其相互作用规律的科学。 主要内容主要内容 蛋白质组产生的背景及意义蛋白质组产生的背景及意义 蛋白质组的研究内容蛋白质组的研究内容 蛋白质组研究的思路与策略蛋白质组研究的思路与策略 蛋白质组研究的技术体系蛋白质组研究的技术体系 蛋白质组策略的应用举例蛋白质组策略的应用举例 共享99基因 研究意义研究意义Why proteomics 30000-40000个基因 30000个基因 蚕和蚕蛾的基因组相同， 但表型却完全不同 蛋白质组的差异所致。 研究意义研究意义Why proteomics 对于人体：对于人体： 1 1个受精卵发育成个受精卵发育成10101

5、2 12细胞， 细胞，10103 3细胞类型。其细胞类型。其“蛋白质组蛋白质组”随随“时时” ” 、“空空” ” 处于变化之中，而处于变化之中，而“基因组基因组”则相对处于则相对处于不变不变之中。之中。 因此，我们可以得出：生命体的统一性源于基因组，因此，我们可以得出：生命体的统一性源于基因组，生命体生命体的复杂性源于蛋白的复杂性源于蛋白 质组。质组。 研究内容与解决问题研究内容与解决问题 研究思路与策略研究思路与策略 1 1、研究基础、研究基础 （1 1）越来越多生物基因组测序的完成）越来越多生物基因组测序的完成蛋白质组数据库；蛋白质组数据库； （2 2）生物质谱和分离科学的进步）生物质谱和

6、分离科学的进步分离和鉴定的技术平台和手段；分离和鉴定的技术平台和手段； （3 3）生物信息学的发展）生物信息学的发展海量数据的解析海量数据的解析 研究的思路与策略研究的思路与策略 研究的思路与策略研究的思路与策略 4. 技术体系技术体系-工具工具 4.1 样品制备技术样品制备技术 蛋白质组研究分析流程蛋白质组研究分析流程 样本制备原则样本制备原则 应使所有待分析的蛋白样品应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法（包括多数疏水性蛋白），且制备方法 应具有可重现性。应具有可重现性。 防止防止样品在聚焦时发生蛋白的样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀聚集

7、和沉淀。 防止防止在样品制备过程中发生样品的抽提后在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰化学修饰（如酶性或化学性降解等）。（如酶性或化学性降解等）。 完全完全去除去除样品中的核酸和某些样品中的核酸和某些干扰蛋白干扰蛋白。 尽量尽量去除去除起干扰作用的起干扰作用的高丰度或无关蛋白高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。，从而保证待研究蛋白的可检测性。 样品裂解的方法样品裂解的方法 超声破碎超声破碎- -细胞混悬液细胞混悬液 高速珠磨高速珠磨- -细胞混悬液细胞混悬液 研磨研磨- -细菌、植物细胞细菌、植物细胞 匀浆匀浆- -动植物组织、细菌、酵母、植物细胞动植物组织、细菌、酵母、植物细

8、胞 冻融裂解冻融裂解- -培养细胞培养细胞 低渗裂解低渗裂解- -红细胞、细菌红细胞、细菌 去垢剂裂解去垢剂裂解- -组织培养细胞组织培养细胞 样品抽提液的主要成份样品抽提液的主要成份 变性剂（打开氢键变性剂（打开氢键 、增溶）、增溶）、 去垢剂（消除疏水基团之间的相互作用，增强蛋白质在其去垢剂（消除疏水基团之间的相互作用，增强蛋白质在其pIpI值处的溶解性值处的溶解性 ）、）、 两性电解质（在样品中往往能替代盐离子两性电解质（在样品中往往能替代盐离子 ，盐离子才能维持其中蛋白质的溶解，盐离子才能维持其中蛋白质的溶解 ）、）、 还原剂（打开二硫键）还原剂（打开二硫键） 蛋白酶抑制剂（防止蛋白质

9、降解等）蛋白酶抑制剂（防止蛋白质降解等） 盐盐 离子去污剂离子去污剂(SDS)(SDS) 核酸核酸, ,脂类及多聚糖脂类及多聚糖 酚类复合物酚类复合物 需要需要进行样品的纯化处理进行样品的纯化处理 去除影响样品制备的干扰物质去除影响样品制备的干扰物质 p 盐盐( (NaClNaCl): ): - - 增加导电性增加导电性, , 使得等电聚焦所需时间延长使得等电聚焦所需时间延长 - - 出现电内渗现象出现电内渗现象(EEO), (EEO), 导致胶内不均匀的水分布导致胶内不均匀的水分布( (失水区和水过饱和区失水区和水过饱和区) ) - - 可容忍的盐浓度可容忍的盐浓度: : 10 10 mMm

10、M 胶内水化上样胶内水化上样 40 40 mMmM 杯上样杯上样 去除去除方法方法: : 胶胶过滤过滤, TCA/, TCA/丙酮沉淀丙酮沉淀, , 超滤超滤 100 ug E. coli lysate. IEF, pH 5-8; 250 V, 升压, 20 min; 8000 V 线性 升压, 2.5 hrs; 8000 V, 25,000 Vhrs. SDS PAGE 4-20% 线性梯度, 200V, 1 hr. Bio-Safe Coomassie 染色. 50 mM Tris 100 mM Tris 合适的离子强度 核酸核酸: : - - 通过静电作用与蛋白结合通过静电作用与蛋白结合

11、, ,妨碍聚焦过程妨碍聚焦过程 - - 可阻碍丙烯酰胺基质孔道可阻碍丙烯酰胺基质孔道 - - 去除方法去除方法: : 用核酸酶处理用核酸酶处理; ;在两性电解质存在的情况下进行超速离心在两性电解质存在的情况下进行超速离心 多聚糖多聚糖: : - - 会阻碍丙烯酰胺基质孔道会阻碍丙烯酰胺基质孔道 - - 去除方法去除方法: TCA : TCA 沉淀法沉淀法 脂脂类类: : - - 通过疏水作用与蛋白结合通过疏水作用与蛋白结合, , 影响等电点及分子量影响等电点及分子量 - - 蛋白脂类复合物在水溶性溶液中不溶解蛋白脂类复合物在水溶性溶液中不溶解 - - 处理处理/ /去除去除方法：方法： 在在高

12、浓度的去污剂存在下脂类会被聚集而除去高浓度的去污剂存在下脂类会被聚集而除去, , 而蛋白会溶于而蛋白会溶于溶液中富含溶液中富含脂类样品脂类样品( (脑脑): ): 采用有机溶剂进行化学采用有机溶剂进行化学去除。去除。 p 离子去污剂离子去污剂(SDS):(SDS): - - 与蛋白形成带强负电荷的复合物与蛋白形成带强负电荷的复合物 - - 干扰聚焦过程干扰聚焦过程 - - 处理方法处理方法: : 将含将含SDSSDS的样品用高浓度的非离子或两性去污剂进行稀释的样品用高浓度的非离子或两性去污剂进行稀释( (比例为比例为8:1;SDS8:1;SDS终浓度为终浓度为0.25%).0.25%). p

13、酚类复合物酚类复合物( (植物植物): ): - - 还原状态还原状态: : 通过氢键与蛋白结合通过氢键与蛋白结合 - - 氧化状态氧化状态( (醌醌): ): 发生共价结合发生共价结合 - - 处理方法处理方法: : - - 添加添加polyvinylpolypyrrolidonepolyvinylpolypyrrolidone (PVPP): (PVPP):形成多酚物形成多酚物 - - 添加还原剂添加还原剂(DTT, (DTT, 抗坏血酸抗坏血酸, , 亚硫酸盐亚硫酸盐) ) p 不溶物质不溶物质: : - - 阻塞凝胶孔道导致聚焦不好阻塞凝胶孔道导致聚焦不好( (出现严重的拖尾出现严重的

14、拖尾) ) - - 去除方法去除方法: : 高速离心高速离心(e.g. 40000g, 30 min, 20(e.g. 40000g, 30 min, 20C)C) 去除影响样品制备的干扰物质去除影响样品制备的干扰物质 样品制备中的纯化处理效果 E.coli cell lysates spiked with 1% SDS 采用TCA/丙酮沉淀法处理 未处理 血浆蛋白质组的动态范围血浆蛋白质组的动态范围 整体蛋白质组预分离分析技术路 线 4.2 分离技术分离技术 特定或目标蛋白质组分离分析技术 4.2 分离技术分离技术 整体蛋白质或肽段混合物分离方法选择：整体蛋白质或肽段混合物分离方法选择： 依

15、据依据形状和大小形状和大小，如超滤、体积排阻、，如超滤、体积排阻、PAGEPAGE等；等； 依据依据溶解性或密度性质溶解性或密度性质，如丙酮沉淀、蔗糖梯度，如丙酮沉淀、蔗糖梯度 密度离心技术；密度离心技术； 依据依据等电点等电点不同，如离子交换、等电聚焦；不同，如离子交换、等电聚焦； 依据依据疏水性疏水性不同，如反相色谱、疏水色谱；不同，如反相色谱、疏水色谱； 依据依据亲和性亲和性不同，如亲和色谱；不同，如亲和色谱； 依据与金属离子依据与金属离子螯合性质螯合性质不同，如不同，如IMACIMAC法提取磷法提取磷 酸化肽段；酸化肽段； 依据依据特殊化学反应特殊化学反应基团，如巯基填料选择性富集基团

16、，如巯基填料选择性富集 含巯基的肽段。含巯基的肽段。 常用的两种高效分离技术 2DE（MALDI-TOF/TOF MS） 非胶多维分离-质谱分析（液相色谱和毛 细管电泳等） 4.3 鉴定技术鉴定技术 生物质谱生物质谱 基质辅助激光解吸电离基质辅助激光解吸电离 飞行时间质谱飞行时间质谱 电喷雾电离质谱电喷雾电离质谱 串联质谱串联质谱 生物质谱的应用 p蛋白质蛋白质鉴定鉴定 分子量测定：蛋白酶分子量测定：蛋白酶切切 + + 一级质谱一级质谱 蛋白质蛋白质的氨基酸序列测定的氨基酸序列测定 蛋白酶切蛋白酶切 + + 二级（串联）质谱二级（串联）质谱 p翻译后修饰翻译后修饰 糖基化、磷酸化糖基化、磷酸化

17、. p生物大分子非共价相互作用生物大分子非共价相互作用 p微生物分析微生物分析 p蛋白质组蛋白质组 质谱仪与质谱分析 质谱仪：按离子质量数质谱仪：按离子质量数m m与电荷数与电荷数z z的比值（称质荷比的比值（称质荷比m/zm/z）大）大 小顺序排列，应用电磁学原理，分离和测定离子化了的分子或小顺序排列，应用电磁学原理，分离和测定离子化了的分子或 原子质量，它是一种物理方法，即物质粒子的质量谱。原子质量，它是一种物理方法，即物质粒子的质量谱。 质谱分析：测定样品离子的质荷比质谱分析：测定样品离子的质荷比(m/z), (m/z), 进行成分和结构分析进行成分和结构分析 的分析方法的分析方法 M+

18、nHM+nH n+ n+ 质荷比 质荷比: m/z=(: m/z=(M+nM+n)/n)/n m/zm/z为质荷比，为质荷比，n n为质子化数，即电荷数，为质子化数，即电荷数， MM为分子质量为分子质量 离子源的作用离子源的作用： 将将样品中的原子、分子电离成为离子，并使这些样品中的原子、分子电离成为离子，并使这些 离子在离子源系统中形成具有一定离子在离子源系统中形成具有一定几何形状几何形状和一定和一定 能量能量的离子束，然后进入质量分析器被分离。的离子束，然后进入质量分析器被分离。 生物质谱的分类 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 MALDI-TOF-MSMA

19、LDI-TOF-MS 离子源：基质辅助激光解吸电离离子源：基质辅助激光解吸电离(MALDI)(MALDI) 基本原理：将分析物分散在基质基本原理：将分析物分散在基质(Matrix)(Matrix)分子中并形成共结晶分子中并形成共结晶, , 当用激光当用激光(337nm(337nm的氮激光的氮激光) )照射晶体时照射晶体时, , 基质基质 分子吸收激光能量与样品解吸附，基质样品之间发生电荷转移使样品分子电离。分子吸收激光能量与样品解吸附，基质样品之间发生电荷转移使样品分子电离。 常用基质(激发波长337nm、355nm) n 基质的作用基质的作用 吸收了激光的大部分能量并气化，同时将样品分子带入

20、气相吸收了激光的大部分能量并气化，同时将样品分子带入气相, ,样品分子只吸收少量激光能量，避免了分子样品分子只吸收少量激光能量，避免了分子 化学键的断裂。化学键的断裂。 - - 基质在样品离子形成过程中充当了质子化或去质子化试剂，使样品分子带上正电荷或负电荷。基质在样品离子形成过程中充当了质子化或去质子化试剂，使样品分子带上正电荷或负电荷。 电喷雾电离质谱(ESI-MS) 基本原理：利用高电场使质谱进样端的毛细管柱流出的液滴带电，在基本原理：利用高电场使质谱进样端的毛细管柱流出的液滴带电，在N2N2气流的作用下，气流的作用下， 液滴溶剂蒸发，表面积缩小，表面电荷密度不断增加，直至液滴爆裂为带电

21、的子液滴，这液滴溶剂蒸发，表面积缩小，表面电荷密度不断增加，直至液滴爆裂为带电的子液滴，这 一过程不断重复使最终的液滴非常细小呈喷雾状，这时液滴表面的电场非常强大，使分析一过程不断重复使最终的液滴非常细小呈喷雾状，这时液滴表面的电场非常强大，使分析 物离子化并以带单电荷或多电荷的离子的形式进入质量分析器。物离子化并以带单电荷或多电荷的离子的形式进入质量分析器。 Nebulizer Gas Heat Heat Solution Make up Gas High V oltage Power Supply Ions Sampling Orifice3) 4) 3) Field Evaporatio

22、n 4) Coulomb Explosion 1) Desolvation 2) Charge Accumulation 120 Barrier Gas Flow (Differential Pumping) ESIESI源示意图 串联质谱 质量分析器的作用：使离子按照质荷比的大小进行质量分析器的作用：使离子按照质荷比的大小进行 分离，并得到按质荷比大小顺序排列成的谱图质分离，并得到按质荷比大小顺序排列成的谱图质 谱图。谱图。 有机质谱和生物质谱常用的质量分析器有有机质谱和生物质谱常用的质量分析器有： a a 磁场磁场( (或电场或电场) )质量分析器；质量分析器； b b 四极杆质量分析器；

23、四极杆质量分析器； c c 飞行时间质量分析器；飞行时间质量分析器； d d 离子阱质量分析器；离子阱质量分析器； e e 离子回旋共振质量分析器；离子回旋共振质量分析器； f f 轨道离子阱（轨道离子阱（ORBITRAPORBITRAP）。）。 4.4 数据处理（结构预测） 蛋白质结构预测主要有两大类方法： 1、理论分析方法或从头算方法（Abinitio）： 2、统计方法：该类方法对已知结构的蛋白质进行统计分析， 建立序列到结构的映射 模型，进而对未知结构 的蛋白质根据映射模型 直接从氨基酸序列预测 结构。 经验性方法 结构规律提取方法 同源模型化方法 25-30%同源序列， 相似的空间结构

24、 蛋白质数据库的构成图 蛋白质功能确定的思路与方法 通过相似序列的数据库比对确定功能 确定序列特性：疏水性、跨膜螺旋等 通过序列模体数据库等的比对确定功能 相互作用 规模化发现蛋白质相互作用技术 酵母双杂交 基于质谱的蛋白质复合体研究 蛋白质芯片 蛋白质相互作用验证技术 免疫共沉淀 GST-pull down 荧光共定位 荧光共振能量转移（FRET) 体外表达 定量蛋白质组中的实验设计 应用举例 应用举例 对于人体：对于人体： 1 1个受精卵发育成个受精卵发育成101012 12细胞， 细胞，10103 3细胞类型。其细胞类型。其“蛋白质组蛋白质组”随随“时时” ” 、“空空” ” 处于变化之中，而处于变化之中，而“基因组基因组”则相对处于则相对处于不变不变之中。之中。 因此，我们可以得出：生命体的统一性源于基因组，因此，我们可以得出：生命体的统一性源于基因组，生命体生命体的复杂性源于蛋白的复杂性源于蛋白 质组。质组