分子克隆工具酶_图文(精)

1、第二章分子克隆工具酶DNA重组技术中对核酸的 精雕细刻”主要用酶作为工具。60年代末，70年代 初科学家们陆续发现了 DNA连接酶、T4DNA连接酶、U型限制性核酸内切酶 Hin fl和Eco RI、反转录酶等，才使他 们能对DNA分子进行剪切、连接等基因操作，故称这些酶为工具酶。到目前为 止，世界上发现的工具酶种类和数量繁多，现将重组DNA分子技术中常的工具酶简介如下。限制性核酸内切酶（restriction endonucleasg在重组DNA技术中有重 要地位，在此较详细介绍。第一节限制性核酸内切酶核酸酶可分为两类：核酸外切酶（exo nuclease是从核酸的一端开始，一个接 一个把核

2、苷酸水解下来；核酸内切酶（en do nuclease则从核酸链中间水解3 5磷酸 二酯键，将核酸链切断。很多细菌和细胞中都能识别外来的核酸并将其分解，1962年发现这是因为细菌中含有特异的核酸内切酶，能识别特定的核酸序列而将核酸切 断;同时又伴随有特定的核酸修饰酶，最常见的是甲基化酶，能使细胞自身核酸特 定的序列上碱基甲基化，从而避免受内切酶水解，外来核酸没有这种特异的甲基化 修饰，就会被细胞的核酸酶所水解这样细胞就构成了限制一修饰体系，其功能就 是保护自身的DNA，分解外来的DNA，以保护和维持自身遗传信息的稳定，这对 细菌的生存和繁衍具有重要意义。这就是限制性核酸内切酶名称中限制”二字概

3、念的由来。1.1 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease1.1.1限制性核酸内切酶的概念是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。到目前为止，已经分离出可识别230种不同DNA序列的U型限制性核酸内切酶达 2300种以 上。在限制性核酸内切酶作用下，侵入细菌的外源” DNA分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的 DNA碱基甲基化，在此修饰酶的保护下，则可免 受限制性核酸内切酶的降解。由于限制性核酸内切酶的发现与应用而导致体外重组 DNA技术的发展，使人们有可能对真核染色体

4、的结构、组织、表达及进化等问题 进行深入的研究。因此，有人赞叹限制性核酸内切酶是大自然赐给基因工程学家的一件了不起的礼物。1.1.2限制性核酸内切酶的命名原则1973年H.O.Smith和D.Nathams首次提出命名原则，1980年Roberts在此基础 上进行了系统分类。总规则是以限制性核酸内切酶来源的微生物学名进行命名，其 命名原则如下。 限制性核酸内切酶第一个字母（大写，斜体）代表该酶的微生物（宿主菌）属名（genus第二、三个字母（小写，斜体）代表微生物种名（species 第四个字母代表寄主菌的株或型（strai n。 如果从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的

5、先后 顺序用罗马字母表示。如大肠杆菌（Escherichia coli R株中分离到几种限制性核酸内 切酶，分别表示为 Eco Rl、Eco RH和 Eco RV等。Eco RI 读作 Eco R one, Eco RU读作Eco R two，以此类推。1.1.3限制性核酸内切酶的分类根据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可 分为I、U、川型三大类。I型限制性核酸内切酶属于复合功能酶，由3种不同亚基构成，兼具有修饰酶活性和依赖于ATP的限制性内切酶活性，它能识别和结合于特定的DNA序列位 点，去随机切断在识别位点以外的 DNA序列，通常在识别位点周围400-700b

6、p。 这类酶的作用需要Mg 2+、ATP和S-腺苷酰甲硫氨酸作为催化的辅助因子，在 DNA降解时伴随有 ATP的水解，即具有核酸内切酶、甲基化酶、ATP酶和DNA解旋酶四种活性；在DNA链上的识别和切割位点不一致，没有固定的切割位点，一般在识别位点外的 1kb至几个kb处随机切割，不产生特异片段。川型限制性核酸内切酶与I类酶相似，是多亚蛋白质，既有内切酶活性，又有 修饰酶活性，但在DNA链上有特异切割位点，切断位点在识别序列周围 25-30bp 范围内，酶促反应除Mg2+外，也需要ATP供给能量。I、川限制性核酸内切酶 对重组DNA技术无重要价值。U限制性核酸内切酶只由一条肽链构成，U限制性核

7、酸内切酶限制修饰系统（R-M系统）分别由核酸内切酶和甲基化酶两种不同的酶组成，仅需 Mg 2+作为 催化反应的辅助因子，它能识别和切割双链 DNA的特异顺序，产生特异的DNA 片段，切割DNA特异性最强，且就在识别位点范围内切断 DNA，是分子生物学 中应用最广的限制性内切酶。通常在重组 DNA技术提到的限制性核酸内切酶主要 指U类酶而言。1.1.4 U限制性核酸内切酶的功能第1个U限制性核酸内切酶 Hin dll由H.O.Smith和K.W.Wilcox于1970发现 的。U限制性核酸内切酶有严格的识别、切割顺序，它以核酸内切方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的 DNA片段5端为P，3端为

8、OH,识别序列一般为4 6个碱基对，通常是反转录重复顺序，具有 180的旋转对称性即迴文结构。大部分 限制性核酸内切酶识别DNA序列具有回文结构特征，切断的双链 DNA都产生5 磷酸基和3羟基末端。不同限制性核酸内切酶识别和切割的特异性不同，结果有 三种不同的情况：II限制性核酸内切酶切割双链 DNA产生3种不同的切口: 在识别顺序的对称轴上，对双链 DNA同时切割，产生平末端（blunt end,例 如Eco R V识别的顺序是：5-GATATC-33-CTATAG-5它的切点在T和A之间，在对称轴上将DNA从T与A之间切开:5-GAT ATC-3 Eco R V 5-GAT + pATC-

9、3Pvull产生的平头末端I5(GCTG AG 3i f r i i g i i i i i i3CGACTC5tPvull 37 *C 5* G-C,_Tr - - - - - AG * 3i i i i i ii r i i i i3* C-G A- -C TC 5 在识别顺序的双侧末端切割 DNA双链，于对称轴的5末端切割，产生5端突出的粘性末端（cohesive end or sticky end例如Bam HI识别的顺序是：5-GGATCC-33-CCTAGG-5它的切点在G和G之间，其切口情况是:5-G GATCC-3 Bam HI 5-G + pGATCC-3Pstl等产生的3粘

10、性末端I5(Q-C-T-C-T-C ” -G AG 3I I I I I I I ( I I I I3(C-G-A GC-T-CytPstl 37 t5G C T- -I- - - - -G-A-G . 31IlliIlli3C GA -D- 7-SCTC 引退火4-7 ry GCTCT-( O G -G-A-G 3i i i i i i i i i i i i3CGA -C-T*C 5*i i 在识别顺序的双侧末端切割 DNA双链，于对称轴的3末端切割，产生3端 突出的粘性末端。例如Sac I识别的顺序是：5-GAGCTC-33-CTCGAG-5它的切点在T和C之间，其切口情况是:5-GAG

11、CT C-3 Sac I 5-GAGCT + pC-33-C TCGAG-5 3-Cp TCGAG-5P射I等产生的3粘性末端I5GCT-J G A G 3i i i i i i i i i i i i3* * C-G_A- - - -C-T_C ”5*t .Pst) 37 r5*G-Q-T- * * = - -G-A-G . 3IlliIlli3C G A( - YCT-C F退火4寸r5G-C-T* * -G-A-G 3ii i i i i i i i i i i i3* C GA2 二 CT-C 5I i不同有限制性核酸内切酶识别的 DNA序列可以不相同。有的识别四核苷酸序 列，有的识别

12、六或八核苷酸序列。如果 DNA中的核苷酸序列是随机排列的，则一 个识别四核苷酸序列的内切酶平均每隔256bp出现一次该酶的识别切割位点，同样的对识别六或八核 苷酸序列的内切酶则大致上分别是每隔 4kb或65kb出现一次识别切割位点。按此 可大致估计一个未知的DNA分子限制性内切酶可能具有切点频率，以便选用合适 的内切酶。种最常用的限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶名称识别序列和切割点BamH ICla IEooR IHind 川Hi nd nKpn INot IPst ISal ISau3A ISfi ISma IXba IXho IG J GATCC AT J CGAT G J AATTC

13、A J AGCTT GTPy J PuAC GGTACJ C GC J GGCCGC CTGCA G G J TCGACJ GATC GGCCNNNJNGGCC CCJ GGG T J CTAGA C J TCGAG1.1.5同裂酶与同尾酶同裂酶（isoschizomers有一些来源不同的限制性核酸内切酶识别的是同样的核 苷酸靶序列，这类酶称为同裂酶。 Sma I和Xma I(CCCGGG同尾酶(isocaudamer有一些来源不同的限制性核酸内切酶识别的靶序列也各不 相同，但都产生相同的粘性末端，这类酶称为同尾酶。 Bam HI(GGATCC和Bgl n (AGATCT。1.1.6 n限制性

14、核酸内切酶的主要用途 DNA重组克隆及亚克隆 DNA杂交与序列分析 改建质粒 构建基因组DNA物理图谱和文库1.1.7影响n型限制性核酸内切酶活性的因素(1DNA的纯度限制性核酸内切酶消化DNA底物的反应效率在很大程度上是取决于所使用的DNA本身的6纯度。DNA制剂中的其他杂质，如蛋白质、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸 (EDTA、十二烷基硫酸钠(SDS以及高浓度的盐离子等，都有可能抑制限制性核酸 内切酶的活性。应用微量碱抽提法制备的 DNA制剂，常常都含有这类杂质。为了 提高限制性核酸内切酶对低纯度 DNA制剂的反应效率，一般采用以下 3种方法:增加限制性核酸内切酶的用量，平均每微克底物DNA

15、可高达10单位甚至更多些。扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑制因素被相应地稀释。延长酶催化反应的保温时间在有些DNA制剂中，尤其是用碱抽提法制备的 DNA制剂，会含有少量的DNase的污染。由于DNase的活性需要Mg 2+的存在，而在DNA的储存缓冲液中含有二价金属离子整合剂 EDTA，因此在这种制剂 中的DNA仍是稳定的。然而在加入了限制性核酸内切酶缓冲液之后， DNA则会 被DNase迅速地降解。要避免发生这种状况，唯一的办法就是使用高纯度的DNA。在反应混合物中加入适量的聚阳离子亚精胺 (polycation spemidi ne一般终浓度 为12.5mmol/L，有利于限制性核酸内切

16、酶对 DNA的消化作用。但鉴于在 4C下 亚精胺会促使DNA沉淀，所以务必在反应混合物于适当的温度下保温数分钟之后 方可加入。(2DNA的甲基化程度限制性核酸内切酶是原核生物限制-修饰体系的组成部分，因此识别序列中特 定核苷酸的甲基化作用便会强烈地影响酶的活性。通常从大肠杆菌寄主细胞中分离 出来的质粒DNA，都混有两种作用于特定核苷酸序列的甲基化酶，一种是dam甲基化酶，催化GATC序列中的腺嘌呤残基甲基化；另一种是 dcm甲基化酶，催忧 CCA/TGG序列中内部的胞嘧啶残基甲基化。因此，从正常的大肠杆菌菌株中分离 出来的质粒DNA，只能被限制性核酸内切酶局部消化，甚至完全不被消化，是属 于对

17、甲基化作用敏感的一类。为了避免产生这样的问题，在基因工程操作中通常使 用丧失了甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒 DNA o哺乳动物的DNA有时也会带有5-甲基胞嘧啶残基，而且通常是在鸟嘌呤核苷 残基的5侧。因此不同位点之间的甲基化程度是互不相同的，且与DNA来源的细胞类型有密切的关系。可以根据各种同裂酶所具有的不同的甲基化的敏感性对真核 基因组DNA的甲基化作用模式进行研究。例如，当 CCGG序列中内部胞嘧啶残基被甲基化之后，Mspl仍会将它切割，而Hpall(正常情况下能切割CCGG序列对此 类的甲基化作用则十分敏感。限制性核酸内切酶不能够切割甲基化的核苷酸序列，这种特性在有些情况下具 有特殊

18、的用途。例如，当甲基化酶的识别序列同某些限制酶的识别序列相邻时，就 会抑制限制酶在这些位点发生切割作用，这样便改变了限制酶识别序列的特异性。 另一方面，若要使用合成7的衔接物修饰DNA片段的末端，一个重要的处理是必须在被酶切之前，通 过甲基化作用将内部的限制酶识别位点保护起来。(3酶切反应的温度DNA消化反应的温度是影响限制性核酸内切酶活性的另一重要因素。不同的 限制性核酸内切酶具有不同的最适反应温度，而且彼此之间有相当大的变动范围。 大多数限制性核酸内切酶的标准反应温度是 37C，但也有许多例外的情况，它们 要求37E以外的其他反应温度。还有些限制性核酸内切酶的标准反应温度低于标 准的37T

19、，例如Smal是25C, Apal是30C。消化反应的温度低于或高于最适温 度都会影响限制性核酸内切酶的活性，甚至导致酶的完全失活。(4DNA的分子结构DNA分子的不同构型对限制性核酸内切酶的活性也有很大的影响。某些限制 性核酸内切酶切割超螺旋的质粒 DNA所需要的酶量要比消化线性的 DNA高出许 多倍，最高的可达20倍。此外，还有一些限制性核酸内切酶切割位于DNA不同部位的限制位点，其效率亦有明显的差异。据推测，这很可能是由于侧翼序列的核 苷酸成分的差别造成的。大体说来，一种限制性核酸内切酶对其不同识别位点的切 割速率的差异最多不会相差10倍。尽管这样的范围在通常的标准下是无关紧要 的，然而

20、当涉及到局部酶切消化时，则是必须考虑的重要参数。DNA分子中某些特定的限制位点，只有当其他的限制位点也同时被广泛切割的条件下，才能被有关 的限制性核酸内切酶所消化。少数的一些限制性核酸内切酶，如Narl，Nael，Sacll以及Xmalll等，对不同部位的限制位点的切割活性会有很大的差异，其中有 些位点是很难被切割的。（5限制性核酸内切酶的缓冲液限制性核酸内切酶的标准缓冲液的组分包括氯化镁、氯化钠或氯化钾、Tris-HCI、&巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT以及牛血清白蛋白（BSA等。酶活性的正常发 挥，是绝对地需要2价阳离子，通常是Mg 2+。不正确的NaCI或Mg 2+浓度，不仅会降低限制酶的

21、活性，而且还可能导致识别序列特异性的改变。缓 冲液Tris-HCI的作用在于，使反应混合物的pH值恒定在酶活性所要求的最佳数值 的范围之内。对绝大多数限制酶来说，在pH=7.4的条件下，其功能最佳。巯基试剂对于保护某些限制性核酸内切酶的稳定性是有用的，而且还可保护其免于失活。 但它同样也可能有利于潜在污染杂质的稳定性。有一部分限制性核酸内切酶对于钠 离子或钾离子浓度变化反应十分敏感，而另一部分限制性核酸内切酶则可适应较大 的离子强度的变化幅度。8在非最适的”反应条件下（包括高浓度的限制性核酸内切酶、高浓度的甘油、低离子强度、用Mn 2+取代Mg 2+以及高pH值等等，有些限制性核酸内切酶识别序

22、列的特异性会发生改变，导 致从识别序列以外的其他位点切割 DNA分子。有的限制性核酸内切酶在缓冲液成 分的影响下会产生所谓的星号活性。由于前面有关内容对此已有涉及，这里不再赘 述。1.1.8 U限制性核酸内切酶对 DNA的消化作用（1限制性核酸内切酶与靶 DNA识别序列的结合模式J.A.McClarin等人应用X射线晶体学技术对限制酶-DNA复合物的分子结构的 研究表明，II型酶是以同型二聚体形式与靶 DNA序列发生作用的。在这种研究的 基础上，目前已弄清了许多限制性核酸内切酶同其识别序列之间相互作用的精巧的 分子细节。以EcoRI为例，它是以同型二聚体上的 6个氨基酸（其中每个亚基各占1个G

23、lu残基和2个Arg残基同识别序列上的嘌呤残基之间形成12个氢键的形式结合到靶DNA识别序列上，并从此发生链的切割反应。（2限制性核酸内切酶对DNA分子的局部消化从理论上讲，如果一条DNA分子上的4种核苷酸的含量是相等的，而且其排 列顺序也完全是随机的，那么识别序列为 6个核苷酸碱基的限制性核酸内切酶（如 BamHI将平均每隔46=4096bp切割一次DNA分子；而识别序列为4个核苷酸的限制性核酸内切酶（如Sau3AI将平均每隔44二 256bp切割一次DNA分子。如果一种限制性核酸内切酶对 DNA分子的切割反应 达到了这样的片段化水平，称之为完全的酶切消化作用 （complete diges

24、tion然而，由于DNA上的4种核背苷酸碱基的组成并不是等量的，而且其顺序排 列也不是随机的，因此实际上限制性核酸内切酶对DNA分子的消化作用的频率要低于完全消化的频率。例如，入噬菌体DNA的相对分子质量约为49kb，按理对识 别序列为6个核苷酸碱基的限制性核酸内切酶应具有 12个切割位点，可事实上 BglII且只有6个切割位点，BamHI有5个切割位点，SalI有2个切割位点，其GC 含量也小于50%。根据上述分析和实际经验，即便是限制性核酸内切酶对DNA的消化不十分完全，也可获得平均相对分子质量大小有所增加的限制片段产物。此类不完全的限制 酶消化反应，通常叫作局部酶切消化（partial

25、digestio n。在进行局部消化的反应条件 下，任何DNA分子中都只有有限数量的一部分限制位点被限制酶所切割。在实验 中，通过缩短酶切消化反应的保温时间，或降低反应的温度（如从37C改为4C以约束酶的活性，都可以达到局部消化的目的。（3限制性核酸内切酶对真核基因组DNA的消化作用一旦一种靶DNA分子被某种限制性核酸内切酶消化之后，如其相对分子质量 比较小，研9究者就可能通过琼脂糖凝胶电泳或是高效液相色谱 (high performa nee liquid chromatography, HPLC将目的基因片段分离出来，作进一步的克隆扩增和其他研 究。但真核生物的基因组，特别是哺乳动物或高等

26、植物的基因组，一般大小都可达 10 9bp左右，经限制性核酸内切酶消化之后，常要产生出数量高达105106种不同大小的DNA限制片段。因此，要应用琼脂糖凝胶电泳或 HPLC分离其中某一特定DNA片段，实际上 往往是行不通的，它需要通过建立相应的基因文库的办法才能达到分离的目的。1.1.9 U限制性核酸内切酶反应的终止消化DNA样品后，常常需要在进一步处理 DNA前钝化酶的活性。钝化大多 数限制性核酸内切酶可以采用在 65C条件下温浴5min的办法。某些酶如BamHI 和Haelll受热不易钝化，必须采用其他手段。通常可在电泳前往样品中加终止反 应物，其中含有一种钝化酶的变性剂，如 SDS或尿素

27、。虽然这类物质钝化限制性 酶极为有效，但如果要将这类物质从 DNA中去除，却极为困难。为了应用这类物 质而又不至于影响下面的反应程序，可以用下述的方法重新提纯DNA:用等体积的酚-氯仿去除蛋白质，提取DNA。在DNA中残留的酚将会抑制进一步的酶促反 应，必须去除。可将样品用乙醚处理，并经冷乙醇沉淀或在0.2mol/L NaCl存在的情况下，用异丙醇进行沉淀即可达到去除残余酚的目的。离心以后，DNA沉淀可用70%酒精洗一次，以去除残留的盐分，再将DNA干燥后重新悬浮在缓冲液中，这时样品中无蛋白质成分，容易接受下一步的酶处理。1.1.10 U限制性核酸内切酶操作的注意事项 商品化的限制性核酸内切酶

28、均为浓缩液，每次操作时应使用新的吸头去取酶，加入酶的体积应不超过总体积的 10%，否则酶液中的甘油浓度超过 5%时将会 抑制酶的活性。 整个操作应在0C进行，即在冰浴中进行，而且是在加入其它试剂之后，最 后加入酶。当切割大量DNA时，通常采用延长反应时间，减少酶的用量。 当DNA需2种或以上酶切时，应用通用缓冲液，若没有通用缓冲液时，只 有用1种酶切完后，纯化酶切产物，再进行下一个酶切反应。1.1.11 U限制性核酸内切酶的星活性限制性核酸内切酶在非标准反应条件下，能切割一些与其特异识别顺序类似的 序列，降低酶切反应的特异性，这种现象称为酶的星活性。星活性产生的原因如下： 反应体系中甘油的浓度

29、大于5%。 酶用量过大，大于100U/微克DNA。10低离子强度，小于 25mmol/L。 咼pH，大于8.0。 含有机剂，如乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺等。 Mn 2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非 Mg 2+的二价离子的存在。常发生星活性的内切酶有： Eco Rl、Hin d川、Kpn I、Pst I、Sal I、Hin fl等。 第二节其他工具酶1 DNA连接酶DNA连接酶能催化双链DNA切口处的5磷酸根和3-羟基生成磷酸二酯键。这种反应需要供给能量，大肠杆菌和其他细菌的DNA连接酶以NAD作为能量来源，动物细胞和噬菌体的连接酶则以 ATP作为能量来源。1.1 T4 DNA连接酶的

30、作用机制:ATP+DNA ligase(E E-AMP+PPi。E-AMP上的AMP转移到DNA的5磷酸根上，使其活化,释放出酶。活化的5磷酸根与相邻的3羟基形成3，5磷酸二酯键,并释放出AMP。DNA ligM*NH；+ R-O -Q Ribose - Adeni (FAMP from ATP (R-PP.Jor NAD* fK - NMM)ONHjP-*0 fiibcae Adonlne +1O-EniyiM-AMPPPj (from ATIorNMN (fiw NAL-RlbOM IT 3寸Nick in DNATTT1rTTT* RiboM AdenineDMA lewSealed D

31、NAQZ 0 Ribow AdenirwJolpioAMPFigure 24-LS Tbe medumim of the DNAAdenineRiboe -5C . G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 3l I l I I I I I I I I I3$ C-G-A G A C-G-G-C-C-T C 5I IRJkK?1 nickT4-DNA连接酶3 . C GAGACGGCCTC . 551 . G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 3i i i I i i I I I i I i31 . C G A G A-CG-G C-C T-C . 5 i anickT4-DN

32、A连接酶5. G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 39i i i i i i i i i i i i3. C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C . 5!1.2 DNA连接酶的反应条件Tris-HCI 50-100mmol/L pH7.5MgCI2 10mmoI/LATP 0.5-1mMDTT 5mMVolume 10-20uLT T 4-15 T 4-16hr1UDNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下 15T反应1小时，完全连接 1ug入DNA（ Hind III片段）所需的酶量。1.3平头双链DNA片段的连接操作从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连

33、接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢的多。提高平头末端连接效率的方法包括：加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会。加入10%PEG8000,促进大分子之间的有效作用加入单价阳离子（NaCl）,最终浓度150-200 mmol/L2 DNA聚合酶DNA聚合酶是指以脱氧核苷三磷酸作为底物催化合成DNA的一类酶。从不同生物包括细菌、植物、动物中都发现有这种酶，所有DNA聚合酶的作用方式基本相似。它们催化脱氧核苷三磷酸加到复制中的DNA链的3羟基末端，合成方向从5-3由模板决定加上何种脱氧核苷酸。DNA聚合酶催化所

34、需要的条件是： 四种脱氧核苷酸、镁离子、模板 DNA和RNA引物。1957年，Arthur kornberg首次在大肠杆菌中发现 DNA聚合酶I, （DNA polymerase I,简写DNA pol I后来又相继发现了 DNA聚合酶U和DNA聚合酶 川。（DNA polymerase n,E，简写 DNA pol n, DNA pol川实验证明大肠杆菌中 DNA复制的主要过程靠 DNA pol川起作用，而 DNA pol I和DNA pol n在DNA错 配的校正和修复中起作用。这种酶的共同性质是：需要DNA模板，因此这类酶又称为依赖 DNA 的 DNA 聚合酶（DNA dependent

35、 DNA polymerase, DDDP。需 要RNA或DNA做为引物（primer,即DNA聚合酶不能从头催化DNA的起始。 催化dNTP加到引物的3桹H末端，因而DNA合成的方向是5一3三种DNA 聚合酶都属于多功能酶，它们在 DNA复制和修复过程的不同阶段发挥作用。由于 DNA聚合酶I是研究得最清楚而且代表了其他DNA聚合酶的基本特点，所以我们着重介绍DNA pol I的作用并指出另外二种 DNA pol的特殊性：1. DNA聚合酶I:DNA pol I是由一条多肽链组成，分子量为 109KD。酶分子中含有一个Zn+,是聚合活性必须的。大肠杆菌每个细胞中约有400个酶分子，每个酶分子每

36、分钟在37C下能催化667个核苷酸参入到DNA链中，用枯草杆菌蛋白酶可将此 酶水介成两个片段，大片段分子量为 76KD，通常称为klenow片段，小片段为 34KD。大小片段具有不同的酶活性。（1DNA聚合酶的5聚合活性：这是DNA聚合酶最主要的活性，按模板 DNA上的核苷酸顺序，将互补的 dNTP逐个加到引物RNA3桹H末端，并促进3桹H与dNTP的5柳04形成磷酸 二酯键，酶的专一性表现为新进入的dNTP必须与模板DNA碱基配对时才有催化作用，5一聚合活性存在于klenow片段上- 7-0i- k OMjiwcltrwdit tlbijCqplK J1 iJAI 心TMIP JTTF. b

37、ut m tlwJATF!l81birUNAt(2DNA聚合酶的3一外切核酸酶活性：这种酶活性的主要功能是从3一方向识别并切除DNA生长链末端与模板DNA不配对而游离的核苷酸，这种功能称为校对功能，这是保证其聚合作用的正 确性不可缺少的，因此对于DNA复制中极高的保真性是至关重要的。(3DNA聚合酶的5一外切核酸酶活性：这种酶活性是从DNA链的5端向3末端水解已配对的核苷酸，本质是切断磷 酸二酯键，每次能切除10个核苷酸。因此，这种酶活性在 DNA损伤的修复中可 能起重要作用，对完成的DNA片段去除5端的RNA引物也是必须的。DNA pol I的5一聚合活性和5一外切酶活性协同作用，可以使 D

38、NA 条 链上的切口从5f方向移动，这种反应叫做缺刻平移（nick translation，利用此反 应可在体外对DNA片段进行放射性磷（a32PdNTP的标记制成探针（probe，进行核 酸的分子杂交实验，是现代分子生物学的一项重要技术。图缺刻平移标记DNA探针 许多实验证实DNA pol I并不是DNA复制过程中 的主要酶，它的作用主要与 DNA损伤后的修复有关。大肠杆菌DNA聚合酶I为分子量103KD的单链多肽，每个大肠杆菌细胞中含 400个分子，用蛋白酶水解可得到 68KD和35KD的两个片段，大片段称为Kle now大片段。2. DNA 聚合酶U （DNA pol II此酶分子量为1

39、20KD，每个细胞约有100个酶分子，但活性只有 DNA pol I 的5%,它具有5一聚合活性和3一外切活性，起校正作用，而没有 5一外切 活性，它的作用可能与DNA损伤修复有关。目前认为 DNA聚合酶I的生理功能 主要起修复DNA的作用。3. DNA聚合酶川（DNA pol川大肠杆菌DNA聚合酶川由a &、2B、t 2y 6 B9个亚基组成，其中 a& B构成核心酶，是DNA复制的主要聚合酶。Replicatiw forkNew OkRNA prmienCam 耐esd Okaki frogmen ISite of DNA aynthcsE听图DNA聚合酶川催化先导链和随从的合成这是在DN

40、A复制过程中起主要作用的聚合酶，它是由一个多亚基组成的蛋白 质分子，其分子量600kDa整个酶分子形成一个不对称的二聚体，每个大肠杆菌 细胞中只有10?0个酶分子，但催化dNTP参入DNA链的速率却是最快的，约为 9000核苷酸/每分钟/每个酶分子。这也证明 DNA pol川是DNA复制过程中主要发 挥作用的酶。在大肠杆菌染色体 DNA进行复制时，DNA聚合酶川全酶并不是单 独起作用的，而是与引发体，介链酶等构成一个复制体(replisome。由于复制体的存在，先导链和随从链可以同时复制。DNA pol川是由多亚基组成的不对称二聚体，它可能同时负责先导链和随从链的复制，在X 17的复制中观察到

41、引发体总是伴随着DNA噜噗(loop的存在。图16?2可以看到，由于随从链的模板 DNA在 DNA聚合酶川全酶上绕转了 180而形成一个噜噗，因此岗崎片段的合成方向能够 与先导链的合成方向以及复制体移动方向保持一致。随着DNA pol川向前移动，先导链的合成逐渐延长的同时，岗崎片段也在不断 延长，这一噜噗也在不断扩大。当岗崎片段合成到前一个片段的5端时，这一大噜噗就释放出来，由于复制叉向前移动又可将另一部分随从链的模板置换出来，由引 发体合成新的引物，然后再形成一个小的噜噗，进行新的岗崎片段的合成。由此模 型不难看出：随从链的合成需要周期性的引发，因此其合成进度总是与前导链相差 一个岗崎片段的

42、长度。岗崎片段完成后，其 5端的RNA引物由DNA pol I的 5一外切酶活性切除，由此造成的空隙再由 DNA polI的5聚合活性催化dNTP得到填补。所以DNA的复制是在DNA pol川 和DNA pol I互相配合下完成的。下面列表说明三种大肠杆菌 DNA聚合酶的特性表1大肠杆菌DNA聚合酶特征DNA聚合酶IDNA聚合酶U DNA聚合酶川 分子量109KD 120KD 600KD每个细胞中的分子数 400 17-100 1020 5 聚合活性+37 C转化率核苷酸数/酶分子分钟6003030, 0005外切活性+ - - 5外切活性+ + +切刻平移活性+ -对dNTP亲和力低低高修复

43、不详复制去除引物功能填补空缺缺口前移标记为Nick translatior3* C-G-A-G-T C G A C C T C 5(制备事牛标记的;DNase I I5G-C T-C A G C T-G-G-A G T. . 3 l i l l I l l i i 1 l l l3* C G A G T-C G-A-C C T C-A5DNA pol IMg2* 5* dNTP5* GCT-C AGCTGG A-G-T. 3*I I 4 I I I I I I 1 I I I3-C GAG TCG ACCTCA5451PPdA (2PdA缺口前移;Nick tram制备32P桁51 GCTCA GCT-G-G A G T3 I I I I I I I I I r I I I3* . C-G-A-G-T-C-G A-C-C-T-C-A.,. 5(DNase I5t G C T C AGCTGGAGT31 i i i i i i i i 1 i i i i3(C G-A G-T-C-G-A C C-T-C-A.,. 5(DNA pol IMg2+ 5PNTP 5* pp dA (a-335(G-C-T-C A-G-C-T G-G AGT3i i i I i i 1 t 1 r i i i3*C G AG TOG