(完整版)碱裂解法制备质粒的各种溶液的作用及可能出现的问题

1、碱裂解法制备质粒的各种溶液的作用及提取中可能出现的问题、质粒提取三种溶液的作用:1. 溶液I溶液 I: 50 mM 葡萄糖，25 mM Tris-HCI , 10 mM EDTA , pH 8.0任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH,因此用适当浓度的和适当pH 值的Tris-HCI溶液，是再自然不过的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？加 了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此,如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言几乎没有任何影响，所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配 在分子生物学试剂中的主要作用是

2、：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达10 mM的EDTA，就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属 离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要是在不太长的时 间里完成质粒抽提，就不用怕 DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的 TE缓 冲液中有EDTA。如果手上正好缺了溶液I，可不可以抽质粒呢？只要用等体积 的水或LB培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。1. 溶液II溶液 II，0.2 N NaOH，1% SDS轮到溶液II 了。这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2%的SDS等体积混合后 使用的。要新从浓NaOH稀释制备

3、0.4N的NaOH,无非是为了保证NaOH没有 吸收空气中的CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实 破细胞的主要是碱，而不 是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大 肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发 生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的 0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自 然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对 NaOH的作用误以为是为了让基 因组D

4、NA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是 NaOH溶解的细胞，那为什么要加 SDS呢?那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组 DNA片断会慢慢断 裂；第二，必须温柔混合，不然基因组 DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会 带来麻烦。1. 溶液III溶液III : 3 M醋酸钾，2 M醋酸溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白沉淀的本质。最容 易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。如果这样怀疑，往1%的SDS 溶液中加2M醋酸溶液看看就知

5、道不是这么回事了。 大量沉淀的出现显然与SDS 的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS，也会有少量沉淀，但量上要少得多， 显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在 1%的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCI，会发现 SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此 高浓度的盐导致了 SDS的沉淀。但如 果你加入的不是NaCI而是KCI，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷 基硫酸钠（SDS）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（PDS）,而PDS是水不溶的， 因此发生了沉淀。如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了 SDS 中的钠离子

6、形成了不溶性的 PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家知道 SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结 合。那么2 M的醋酸又是为什么而加的呢？是为了中和 NaOH，因为长时间 的碱性条件会打断 DNA，所以要中和之。基因组 DNA 旦发生断裂， 只要是50 100 kb大小的片断，就没有办法再被 PDS共沉淀了。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡

7、，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因 为是溶液III加入后基因组DNA无法快速复性就被沉淀了，这是天大的误 会，因为变性的也好复性的也好， DNA分子在中性溶液中都是溶解的组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。很多人误认NaOH本来是为了溶解细胞而用的， DNA分子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。溶液 III加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了 PDS沉淀更充分一点不要以为PDS沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白质不能被沉淀，因此要用酚 /氯仿/异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能 得到质量稳定的质粒 DNA，不然时间一长就会因为

8、混入的 DNase而发生降 解。这里用25/24/1的酚/氯仿/异戊醇是有很多道理的，这里做个全面的介 绍。酚（Phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大 程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚 /氯仿始终在下层，方便水相的 回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚 溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应(比如限制性酶切反应)，因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，

9、跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净 而不必担心酶切等反应不能正常进行。至于 异戊醇的添加，其作用主要是为了 让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。二、质粒提取常见问题解析1、涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死？涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。蘸了酒精后再烧一小 会，烧的是酒精而不是涂布棒。建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再 涂。同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。2、 原先测序鉴定没有问题的细菌，37C摇菌后发现质粒大小或序列出现异常？这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。解决办法：(1)

10、 降低培养温度，在2025 C下培养，或室温培养可明显减少发生 概率。(2) 使用一些特殊菌株，如 Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如 rec 类等，使得质粒复制更加稳定。(3) 质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液U中的NaOH浓度过 高造成的，请大家注意一下！3、未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？(1) 大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。(2) 质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量 低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。(3) 菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次 转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长

11、期保存不稳定， 因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。（4）碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可 减少菌体用量或增加溶液的用量。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并 加倍使用溶液，可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。（5）溶液使用不当：溶液 2 和 3 在温度较低时可能出现浑浊，应置于 37 C保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。（6）吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质 粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如 TB或2XYT ,菌液体积 必须减少；若质粒是非常高的拷贝数或宿主菌具有很高的生

12、长率，则需减少LB 培养液体积。（7）质粒未全部溶解 （尤其质粒较大时 ） ：洗脱溶解质粒时，可适当加 温或延长溶解时间。（8）乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲 液。（9）洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液 会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。（10）洗脱液不合适： DNA 只在低盐溶液中才能被洗脱， 如洗脱缓冲 液EB（10mM Tris-HCI, 1mM EDTA ，pH8.5）或水。洗脱效率还取决于 pH 值，最大洗脱效率在 pH7.0-8.5 间。当用水洗脱时确保其 pH 值在此范围 内，如果 pH 过低可能导致洗脱量低。洗脱时

13、将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热 至60 C后使用，有利于提高洗脱效率。（11 ）洗脱体积太小：洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增 大回收率增高，但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。（12）洗脱时间过短：洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置 1min 可达到较好的效果。4、细菌离心加入溶液 I 蜗旋振荡后，发现菌体呈絮状不均匀或呈细砂状？（1 ） 很可能是细菌发生溶菌，可减少培养时间或者试试平板培养，质粒 提取前用 PBS 将菌落洗下，相较来说固体培养基上细菌生长的要好一些。（2）质粒抽提过程很大程度上是受细菌生长情况决定的，刚活化的菌比负80 C保存菌种所培养出

14、来的菌液状态好，保存久的菌株可能会造成质粒浓度低，质粒丢失等不明原因。（3）判断生长的菌液是否正常，可以用肉眼观察，在光线明亮处摇荡新鲜 培养液， 如果发现菌液呈漂絮状， 情况很好。 如果发现呈泥水状，即看不到 絮状，只是感觉很浑浊，则可能提不出好的质粒，或者没有质粒。4) 菌液不宜生长太浓，摇床速度不宜过高。达到 OD600 1.5 就可以了，(尤其是对于试剂盒提取要注意)另外如果只是简单的酶切验证根本无需 酚氯仿抽提(安全考虑，慎重) ，只要溶液 I/ II /III 比例恰当，转管过程仔细 吸取不会有太多杂志。5、为什么加了溶液H后，菌体没有逐渐由混浊变澄清？提出来的条带几乎没有，但是

15、RNA 很亮(没加 RNA 酶)？溶液U主要就是NaOH，如果菌液没有由混浊变澄清，参考见解：(1) 可能是因为溶液储存不当，或屡次操作没有及时盖好溶液瓶盖，导致 其吸收空气中的 CO2 失效。 RNA 在菌体中量较多，相对少量的菌体裂解， 可有较 DNA 明显的条带。(2) 可能是菌量大，加溶液U后，菌体并不能完全裂解，所以没有变清， 这也会导致质粒产率低下( 3)可能是质粒的拷贝数不高，质粒产率不高如果是使用自己配的试 剂，建议做中提或大提； 或者买试剂盒提 用自己配的试剂， 不加 RNA 酶，最后RNA是很亮的，要去除干净就要用比较好的RNA酶。( 4)如果不是试剂的原因， 可能是质粒表

16、达的过程中使膜蛋白变化 (数 量变多)，很难使用碱裂解法， 可以尝试用其他比较剧烈的方法 (比如高温或 者低温研磨等 ),然后使用一般的发放。( 5)可能质粒随乙醇一起倒掉了。6、加入溶液 II 后，菌液仍然呈浑浊状态，或者混浊度没有明显的改变？(1) 问题可能是发生在溶液 II 上。首先看看 10SDS 是否是澄清的？ NaOH 是否是有效的？如果使用的是试剂盒， 也要首先确认溶液 II 是否澄清 没有沉淀？(2) 可能是细菌浓度很高，适当调整增加溶液 I/II/III 的体积。(3) 可能是 “杂菌”污染，如果菌液生长异常快，就有可能被杂菌污染。 这种情况一般表现为和目的菌有相同的抗性，生

17、长速度异常，能够提出质粒， 跑胶的条带也异常的亮，但产物不是自己想要的质粒，要特别注意一下。7、抽提DNA去除蛋白质时，为什么要是酚 /氯仿混合使用？怎样使用酚与氯仿较好？酚与氯仿都是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合 时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变 性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的 DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更 大，保留在最下层。作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有 利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10 %15 %的水溶解在酚相中，

18、因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好， 但氯仿与水不相混溶， 不会带走DNA。所以在抽提过程中， 混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚 与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在 第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。&呈粉红色的酚可否使用？如何保存酚不被空气氧化？保存在冰箱中的酚，容易被空气氧化而变成粉红色的，这样的酚容易降解 DNA，一般不可以使用。为了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和 8-羟基喹琳至终浓度为0.1 %。8-羟基喹琳是带有淡黄色的固体粉末，不仅能抗氧化， 并在一定程度上能抑制 DNase的

19、活性，它是金属离子的弱螯合剂。用TrispH8.0水溶液饱和后的酚，最好分装在棕色小试剂瓶里，上面盖一层Tris水溶液或TE缓冲液，隔绝空气，以装满盖紧盖子为宜，如有可能，可充氮气防 止与空气接触而被氧化。平时保存在 4C或-20 C冰箱中，使用时，打开盖子 吸取后迅速加盖，这样可使酚不变质，可用数月。9、为什么用酚与氯仿抽提 DNA时，还要加少量的异戊醇?在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液 内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张 力，可以降低抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为24: 1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为2

20、5 : 24:1 （不必先配制，可在临用前把一份酚加一份 24: 1的氯仿与异戊醇即成）:同时异戊醇有助于分相，使 离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。10、加入酚 / 氯仿抽提，离心后在水相和有机相间没有出现变性蛋白 相层，在随后的乙醇沉淀步骤中却出现大量的半透明沉淀， 溶解后发 现蛋白浓度很高？乙醇沉淀时，较纯的质粒沉淀是白色的（PEG纯化的沉淀是透明的肉眼不易发现），如沉淀是半透明的凝胶状，则应是蛋白含量高。首先看看平衡酚是否已被氧化？ pH 是否是 8.0 ？其次检测溶液 III 反应 完成后的离心上清 pH 是否在 8.0 左右？有时由于溶液 III 配置的问

21、题，会出 现溶液 III 反应后离心的上清 pH 与 8.0 偏差较大的现象， 这会降低平衡酚抽 提蛋白抽的有效性， pH 偏差过大也会导致水相和平衡酚互溶。11、使用酚仿抽提方法，质粒的纯度很好，但酶切不能完全切开（ 1）确认酶的有效性。（2）平衡酚是否被氧化（正常是黄色，而氧化后是棕色的） 。（3）是否不小心吸入了痕量的酚。（4）乙醇沉淀后， 70%乙醇漂洗的是否充分（残留的盐类会影响酶 切）。（5）乙醇漂洗后是否完全干燥（残留的乙醇会影响酶切） 。12、碱裂解法提取的质粒 DNA 进行琼脂糖电泳进行鉴定时， 看到的三条带分别是什么？碱法抽提得到质粒样品中不含线性 DNA ， 得到的三条带

22、是以电泳速度 的快慢排序的，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质 粒连在了一起） 。如果你不小心在溶液 II 加入后过度振荡，会有第四条带， 这条带泳动得较慢，远离这三条带，是 20-100kb 的大肠杆菌基因组 DNA 的 片断。13、提取质粒中 RNA 没有去除 ？可能是 RNase 失效或效率不高。（ 1）更换 RNase A ，并保证其储存条件是正确的（2）手工提取质粒的，可单独增加一步去除 RNA 的步骤 ，溶液 III 反应后，在离心的上清中加 RNase，室温下去除 RNA 10min30min （需要保 证RNase A是经过失活DNase的），同时较高温度（

23、如 50 C）会更加快速 完全的去除RNA，经验所得经过高温处理的质粒质量不是很高。14、提取的质粒电泳后，为连续的一片火箭状？（ 1 ）质粒如果盐离子多，会有走胶变形的现象， 如果提到的质粒不够 纯，会有电泳条带不平齐的现象。（ 2）当电压太大时，容易出现火箭状，而降解应该是弥散状。（3）可能是宿主菌影响的，质粒抽提好后，用酚 -氯仿处理一下再酶切， 若有改善，则为宿主菌影响。转化到其它宿主菌再切 。（4）NaOH 的浓度过高，会出现火箭状的结果。15、用碱裂解法提取质粒，裂解 5 分钟，没有用酚 / 氯仿抽提，最 后用灭菌水溶解质粒 DNA15min 。双酶切后跑胶一条带都没有，原 因是什

24、么？（1）溶解时间稍微短了点，但是根据各个实验室 RNase 不同，这个 条件是不同的。在溶解的过程要涡旋处理促进溶解。（2）确认一下酶切过程中是不是有 DNA 酶的污染，比如酶切体系的 Buffer 或者是水，特别是水中；其次是酶切体系的问题；建议再把提取的产物 用 70% 酒精重新洗涤一遍，也可以用酚 / 氯仿重新抽提一下。（ 3）也可能在用乙醇洗时把质粒倒掉了。（4）没有用 RNase 消化，不要用放久的 RNase 否则会有 DNA 酶的污 染；（5）在没有进行酶切时 ,把所提的质粒跑一下核酸电泳看看 ,如果是提核 酸的问题那这一步电泳结果应该没有大于三千的条带，这样可以先排除核酸提

25、取的问题 . 若是没有酶切时间过长等其他问题的话可以那可以检查一下所用的 溶解 DNA 的溶液是否有 DNAse 污染的问题，建议将超纯水换成 TE。（1）做一次阴性对照 ,拿空白菌涂布在含 amp 的平板上 ,如生长 ,说明 amp 过期,一般这种情况不多见。一般粉末状的 amp 不容易失效 ,如果 amp 有效的话 ,可以配制远高于标准的浓度 ,如果细菌耐药的话 ,也能生长良好 ,如 不耐药 ,则放置数天仍不见细菌生长。（2）拿阴性和阳性的细菌各取数个放于高浓度的 amp 液体培养基中 ,如 能生长 ,说明空白菌中带有耐药菌 ,建议换菌 .（ 3 ）提质粒的菌受污染了，重新划线挑单克隆。1

26、7、培养基、抗生素、质粒提取都没有问题，而细菌菌液提取不到质粒？如果是氨苄抗性的，有可能是质粒丢失造成的。主要是培养时间较长， 导 致培养基中的 beta- 内酰胺酶过多， 作用时间过长， 同时培养基 pH 值降 低，氨苄青霉素失活，从而使无质粒的菌株大量增殖。解决的办法：可以添加葡萄糖，缩短培养时间，改用羧苄青霉素。 用无水乙醇沉淀 DNA ，这是实验中最常用的沉淀 DNA 的方法。乙醇的 优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对 DNA 很 安全，因此是理想的沉淀剂。DNA 溶液是 DNA 以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去 DNA 周围的水分子，使 DNA

27、失水而易于聚合。一般实验中，是加 2 倍体积 的无水乙醇与 DNA 相混合，其乙醇的最终含量占 67左右。因而也可改用 95 乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比 95乙醇昂贵）。但 是加 95的乙醇使总体积增大， 而 DNA 在溶液中有一定程度的溶解，因而 DNA 损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀 DNA 时可用 95乙醇代替无水乙酵，最后的沉 淀步骤要使用无水乙醇。也可以用 0.6 倍体积的异丙醇选择性沉淀 DNA 。一 般在室温下放置 15 30 分钟即可。19、在用乙醇沉淀 DNA 时，为什么一定要加 NaAc 或 NaCl 至最终浓度达

28、0.1 0.25mol/L ?在 pH 为 8 左右的溶液中， DNA 分子是带负电荷的， 加一定浓度的 NaAc 或 NaCl ，使 Na+ 中和 DNA 分子上的负电荷，减少 DNA 分子之间的 同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成 DNA 钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度 太低时，只有部分 DNA 形成 DNA 钠盐而聚合，这样就造成 DNA 沉淀不完 全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的 DNA 中，由于过 多的盐杂质存在，影响 DNA 的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。20、加核糖核酸酶降解核糖核酸后， 为什么再要用 SDS 与 KAc 来处理？加进去的 RNase 本

29、身是一种蛋白质，为了纯化 DNA ，又必须去除之，加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀， 再加KAc使这些复合物转变 为溶解度更小的钾盐形式的 SDS-蛋白质复合物， 使沉淀更加完全。也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀，去除 RNase。在溶液中，有人以 KAc代替 NaAc，也可以收到较好效果。21、为什么在保存或抽提 DNA过程中，一般采用TE缓冲液？在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa二7.2）和硼酸系统（pKa=9.24 ）等虽然也都符合细胞内环境的生理范围（pH），可作 DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子

30、的种类及数量将与Ca2+产生Ca3（PO4）2沉淀；在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要 求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCI （pKa=8.0 ）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris ，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定 DNA的活性。采用PEG （6000）沉淀DNA，大小不同的 DNA分子所用的PEG的 浓度也不同，PEG的浓度低，选择性沉淀 DNA分子量大，大分子所需 PEG 的浓度只需1 %左右，小分子所需 PEG浓度高达20 %。本实验选择性沉淀 4.

31、3kb的pBR322 质粒DNA，每毫升加入 0.4毫升的30 % PEG，其最终 PEG浓度为12%。PEG选择性沉淀DNA的分辨率大约100bp。三、拓展（二）细菌的收获和裂解。细菌的收获可通过 离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意 一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、 有机溶剂或碱进行处理及用加 热处理等。选择哪一种方法取决于3个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解 后用于纯化质粒DNA的技术。尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精 确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。1、大质粒（大于15kb）容易受损，故应采用漫和裂解法从

32、细胞中释放出来。将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS 一类去污剂溶解球形体。这种方法最大限度地减小了从具有 正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。2、可用更剧烈的方法来分离小质粒。在加入EDTA后，有时还在加入溶菌酶后 让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对， 故可使宿主的线状染色体 DNA 变性，但闭环质粒 DNA 链由于处于拓扑缠绕状 态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒 DNA 链迅速得到准确配置，重新 形成完全天然的超螺旋分子。3、一些 大肠杆菌菌株 （如 HB101 的一些变种衍生株 ）

33、用去污剂或加热裂解时可 释放相对大量的糖类，当随后用氯化铯 -溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时 它们会惹出麻烦。糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒 DNA 所占位置形成一致密的、 模糊的区带。因此很难避免质粒 DNA 内污染有糖类，而糖类可抑制多种限制酶 的活性。 故从诸 如 HB101 和 TG1 等大肠杆菌蓖株中大量制备质粒时，不宜使 用煮沸法。4、当从表达内切核酸酶 A 的大肠杆菌菌株 （endA 株，如 HB101） 中小量制备质 粒时，建议不使用煮沸法。 因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶 A ，以后在温育 （如 用限制酶消化 ）时，质粒 DNA 会被降解。但如果通过一个附加步骤 （用酚：氯

34、仿 进行抽提 ）可以避免此问题。5、目前这一代质粒的拷贝数都非常高，以致于不需要用氯霉素进行选择性扩增 就可获得高产。然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加质粒 DNA 的产量， 而是要降低细菌细胞在用于大量制备的溶液中所占体积。 大量高度粘稠的浓缩细 菌裂解物， 处理起来煞为费事， 而在对数中期在增减物中加入氯霉素可以避免这 种现象。有氯霉素存在时从较少量细胞获得的质粒 DNA 的量以与不加氯霉素时 从较大量细胞所得到的质粒 DNA 的量大致相等。（三）质粒DNA的纯化常用的纯化方法都利用了质粒 DNA 相对较小及共价闭合环状这样两个性 质。如，用氯化铯 -溴化乙锭梯度平衡离心分离质粒和染色

35、体 DNA 就取决于溴 化乙锭与线状以及与闭环 DNA 分子的结合量有所不同。 溴化乙锭通过嵌入碱 基之间而与 DNA 结合，进而使双螺旋解旋。由此导致线状 DNA 的长度有所增 加，作为补偿，将在闭环质粒 DNA 中引入超螺旋单位。最后，超螺旋度大为增 加， 从而阻止了溴化乙锭分了的继续嵌入。但线状分子不受此限，可继续结合 更多的染料，直至达到饱和 （每 2 个碱基对大约结合 1 个溴化乙锭分子 ）。由于染 料的结合量有所差别，线状和闭环 DNA 分了在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯度 中的浮力密度也有所不同。多年来，氯化铯 -溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备 大量质粒 DNA 的首选方法。 然而

36、该过程既昂贵又费时， 为此发展了许多替代方 法。其中主要包括利用离子交换层析、 凝胶过滤层析、 分级沉淀等分离质粒 DNA 和宿主 DNA 的方法。（四）质粒DNA的小量制备1细菌的收获和裂解。1、收获。1）将 2ml 含相应抗生素的 LB 加入到容量为 15ml 并通气良好 （不盖紧 ）的试管 中，然后接入一单菌落，于30 C剧烈振摇下培养过夜。2）将1.5ml培养物倒入离心管中，4C、12000g离心30秒，将剩余的培养物贮 存于 4C。3）吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。2、碱法裂解。1）将细菌沉淀，所得重悬于100卩用冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。溶液I可成 批配制，高压下蒸气灭菌15

37、分钟，贮存于4C。须确使细菌沉淀在溶液I中完全 分散。2）加200卩新配制的溶液U。盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。 应确保离心管的整个内表面均与溶液U接触。不要振荡，将离心管放置于冰上。3）加150卩用冰预冷的溶液川。盖紧管口，将管倒置后温和地振荡10秒钟溶液川在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3-5分钟。4）用离心机于4C、12000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。5）可做可不做：加等量酚：氯念，振荡混匀，用微量离心机于4 C以12000g离 心 2 分钟，将上清转移到另一良心管中。 有些工作者认为不必用酚： 氯仿进行抽 提，然而由于一些未知的原因， 省略这

38、一步， 往往会得到可耐受限制酶切反应的 DNA。6）用2倍体积的乙醇于室温沉淀双锭 DNA。振荡混合， 于室温放置2分钟。7）用微量离心机于4C以12 000g离心5分钟。8）小心吸去上清液， 将离心管倒置于一张纸巾上， 以使所有液体流出。 再将附于 管壁的液滴除尽。9）用1ml70%乙醇于4C洗涤双链DNA沉淀，去掉上清，在空气中使核酸沉淀 干燥 10 分钟。i. 此法制备的高拷贝数质粒（如Xf3或pUC），其产量一般约为：每毫升原细菌培 养物3-5啊ii. 如果要通过限制酶切割反应来分析 DNA，可取1卩l DNA溶液加到另一含8卩1 水的微量离心管内，加1卩l 10限制酶缓冲液和1单位所

39、需限制酶， 在适宜温育 1-2小时。将剩余的DNA贮存于-20Coiii. 此方法按适当比例放大可适用于 100ml细菌培养物：。3、煮沸裂解。1）将细菌沉淀，所得重悬于 350 卩 lSTETK STET： 0.1mol/L NaCL，10mmol/L Tris.Cl（pH8.0）， 1mmol/L EDTA（pH8.0） ， 5% Triton X-100。2）加25卩新配制的溶菌酶溶液10mg/ml，用10mmol/L Tris.CI（pH8.0）配制，振 荡 3 秒钟以混匀之。如果溶淮中 pH 低于 8.0，溶菌酶就不能有效发挥作用。3）将离心管放入煮沸的水浴中，时间恰为 40秒。4）

40、用微量离心机于室温以12000g离心10分种。5）用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片。6）在上清中加入40卩l 5mol/L乙酸钠（pH5.2）和420卩异丙醇，振荡混匀，于室温 放置 5 分钟。7）用微量离心机于4C以12 000g离心5分种，回收核酸沉淀。8）小心吸去上清液， 将离心管倒置于一张纸巾上， 以使所有液体流出。 再将附于 管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连， 轻缓抽吸， 并用吸头接触液面。 当液体从管中吸出时， 尽可能使吸头远离核酸沉 淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管的液滴。9）力卩1ml 70%乙醇，于4C以12 000g离心2分钟。

41、10）按步骤 8）所述再次轻轻地吸去上清，这一步操作要格外小心，因为有时沉淀 块贴壁不紧， 去除管壁上形成的所有乙醇液滴， 打开管口， 放于室温直至乙醇挥 发殆尽，管内无可见的液体（2-5）分钟。11）用501含无DNA酶的胰RNA酶 （20卩g/n）的TE（pH8.0）溶解核酸稍加振荡，贮存于-20C。注：当从表达内切核 酸酶 A 的大肠杆菌株 （endA 株，如 HB101 ）中小量制粒尤其 DNA 时，建议舍弃 煮沸法。因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶 A，以后在Mg 2存在下温育（V 中用限制酶时 ）质粒 DNA 可被降解。 在上述方案的步骤 9）之间增加一步，即用 酚：氯仿进行抽提

42、，可以避免这一问题。2质粒 DNA 小量制备的问题与对策碱裂解和煮沸都极其可靠， 重复性也很好，而且一般没有什么麻烦。 多年来， 在我们实验室中日常使用这两种方法的过程中，只碰到过两个问题：1 、有些工作者首次进行小量制备时，有时会发现质粒 DNA 不能被限制酶所切 割，这几乎总是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够。 大多数情况下， 用酚：氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质。 如果总 是依然存在，可用离心柱层析注纯化 DNA。2、在十分偶然的情况下， 个别小时制备物会出现无质粒 DNA 的现象。 这几乎肯 定是由于核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃去。（五）质粒DNA的大

43、量制备1.在丰富培养基中扩增质粒许多年来，一直认为在氯霉素存在下扩增质粒只对生长在基本培养基上的细 菌有效，然而在带有 pMBl 或 ColEl 复制子的高拷贝数质粒的大肠杆菌菌株中， 采用以下步骤可提高产量至每 500ml培养物2-5mg质粒DNA，而且重复性也很 好。1）将 30ml 含有目的质粒的细菌培养物培养到对数晚期 （DNA 600约 0.6）。培养 基中应含有相应抗生素， 用单菌落或从单菌落中生长起来的小量液体闭关物进行 接种。2) 将含相应抗生素的500ml LB或Terrific肉汤培养基(预加温至37C)施放入 25ml对数晚期的培养物，于37T剧烈振摇培养25小时(摇床转

44、速300转/分)，所 得培养物的 OD 600值约为 0.4。3) 可做可不做：加2.5ml氯霉素溶液(34mg/ml溶于乙醇)，使终浓度为170卩g/ml 像 pBR322 一类在宿主菌内只以中等拷贝娄竿行复的质粒， 有必要通过扩增。 这 些质粒只要从生长达到饷新一代的质粒(如pUC质粒河复制达到很高的拷贝数， 因此无需扩增。 这些质粒只要从生长达到饱和的细菌培养物即可大量提纯。 但用 氯霉素进行处理，具有抑制细菌复制的优点， 可减少细菌裂解物的体积和粘稠度， 极大地简化质粒纯化的过程。 所以一般说来， 尽管要在生长中的细菌培养物里加 入氯霉素略显不便，但用氯霉素处理还是利大于弊。4) 于3

45、7E剧烈振摇(300转/分)，继续培养12-16小时。2. 细菌的收获和裂解1 、收获。1) 4C以4000转/分离心15分钟，弃上清，敞开离心管口并倒置离心管使上清全 部流尽。2) 将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。STE: 0.1mol/L NaCl, 10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)， 1mmol/L EDTA(pH8.0) 。3) 按步骤 1)所述方法离心，以收集细菌细胞。2、碱裂解法。1) 将冼过的 500ml 培养物的细菌沉淀物 来自收获细菌的步骤3 重悬于10ml(18ml)溶液 I 中。2) 力卩 1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液10mg/ml，溶

46、于 10mmol/L Tris-HCI(pH8.0)。 当溶液的 pH 值低于 8.0时，溶菌酶不能有效工作。3) 加20ml(40ml)新配制的溶液U。盖紧瓶盖，缓缓颠倒离心瓶数次，以充分混 匀内容物。于室温放置 5-10 分钟。4) 加15n l(20ml)用冰预冷的溶液川。封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物， 此时应不再出现分明的两个液相。置冰上放 10分钟，应形成一白色絮状沉淀。 于0C放置后所形成的沉淀应包括染体 DNA、高分子量RNA和钾-SDS-蛋白质 -膜复合物。5) 用合适转头于4C以4000转/分离心15分钟，不开刹车而使转头自然停转。 如果细菌碎片贴壁不紧，可以 500

47、0转/分再度离心 20分钟， 然后尽可能将上清 全部转到另一瓶中， 弃去残留在离心管内的粘稠状液体。 未能形成致密沉淀块的 原因通常是由于溶液川与细菌裂解物混合不充分 步骤4)。6) 上清过滤至一 250ml 离心瓶中， 加 0.6体积的异丙醇， 充分混匀， 于室温放置10 分钟。7) 用合适转头于室温以500转/分离心15分钟，回收核酸。如于4C离心，盐也 会了生沉淀。8) 小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽，于室温用70%乙醇 洗涤沉积管壁。倒出乙醇，用与真空装置相联的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴， 于室温将瓶倒置放在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥殆尽。9) 用 3ml TE

48、(pH8.0) 溶解核酸沉淀。(六) 质粒DNA的纯化1聚乙二醇沉淀法提取质粒 DNA1、将核酸溶液所得 转入 15mlCorex 管中， 再加 3ml 用冰预冷的 5mol/L LiCl 溶液，充分混匀，用合适转头于 4C下以10000转/分离心10分钟。LiCI可沉淀 高分子 RNA 。2、将上清转移到另一 30mICorex 管内，加等量的异丙醇， 充分混匀， 用SorvallSS34转头(或与其相当的转尖)于室温以10 000转/分离心10分钏，回收 沉淀的核酸。3、小心去掉上清， 敞开管口，将管倒置以使最后残留的液滴流尽。 于室温用 70% 乙醇洗涤沉淀及管壁， 流尽乙醇， 用与真空

49、装置相连的巴其德吸管吸去附于管壁 的所有液滴， 敞开管口并将管侄置， 在纸巾上放置几分钟， 以使最后残余的痕量 乙醇蒸发殆尽。4、用500卩含无DNA酶的胰RNA酶(20卩g/m)的TE(pH8.0)溶解沉淀，将溶液 转到一微量离心管中，于室温放置 30 分钟。5、力卩500卩含13%(w/v)聚乙二醇(PEG 8000)的1.6mol/L NaCl，充分混合，用微 量离心机于4C以12000g离心5分钟，以回收质粒 DNA。&吸出上清，用400卩TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿 各抽 1 次。7、将水相转到另一微量离心管中，力卩100卩l 10mol/L乙醇铵，充分

50、混匀，加2倍 体积(约1ml)乙醇，于室温放置10分钟，于4C以12 000g离心5分钟，以回收 沉淀的质粒 DNA。8、吸去上清，加200卩处于4C以12 000g离心2分钟。9、吸去上清，敞开管口，将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽。10) 用500卩TE(pH8.0)溶解沉淀1: 100稀释用TE(pH8.0)后测量OD 260,计 算质粒DNA的浓度(1OD260=5Q g质粒DNA/ml)， 然后将DNA贮于-20C。10、纯化。2一些试剂的生化作用原理1、溶液I溶霉菌：水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的的,4糖苷键，因而具有溶菌作用。葡萄糖：增加溶液的粘度，防止 D

51、NA 受机械剪切力作用而降解。EDTA :金属离子螯合剂，螯合 Mg2+，Ca2+等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶 (DNase)对DNA的降解作用(DNase作用时需要一定的金属离子强度作辅基)，同 时 EDTA 的存在，有利于溶霉菌的作用。因为溶霉菌的反应要求有较低的离子 强度环境。2、溶液 H -NaOH-SDS液NaOH :核酸在pH值为59的溶液中是最稳定的，但 pH大于12或小于3时, 就会引起双键之间氢键的解离而变性。在溶液H中的 NaOH浓度为0.2N,加入 提取液时， 该系统的 pH 就会高达 12.6，因而促使染色体 DNA 与质粒 DNA 的变 性。SDS:为阴离子表面活性剂，主要功能有：溶解细胞膜上的脂肪与蛋白，从而破 坏细胞膜；解聚细胞中的核蛋白 SDS 蛋白质结合为复合物，使蛋白变性沉淀下 来，但 SDS 能抑制核糖核酸没的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去 除干净，以防用RNase去除RNA时受到干扰。3、溶液皿-3M KAc(pH4.8)溶液：KAc 的水溶液呈碱性，为了调节 pH 至 4.8，必须加入大量的冰醋酸，所