生物素亲和素系统相关提升技术

1、-亲和素放大技术亲和素放大技术 E-mail： 生物素亲和素系统相关提升技术 主要内容主要内容 生物素生物素-亲和素系统简单介绍亲和素系统简单介绍 BAS基本类型和反应原理基本类型和反应原理 生物素和亲和素放大系统的应用生物素和亲和素放大系统的应用 对不起，哥是重点！对不起，哥是重点！ 了解了解 了解了解 生物素亲和素系统相关提升技术 一、生物素一、生物素-亲和素系统（亲和素系统（BAS） 一一) 生物素及活化生物素生物素及活化生物素 二二) 亲和素及链霉亲和素亲和素及链霉亲和素 三三) 生物素生物素-亲和素系统的特点亲和素系统的特点 生物素亲和素系统相关提升技术 一）生物素及活化生物素一）生

2、物素及活化生物素 (一一)生物素生物素 1 概念：概念： 生物素生物素(biotin)是动、植物体内广泛分是动、植物体内广泛分 布的一种小分子生长因子，又名辅酶布的一种小分子生长因子，又名辅酶R 或维生素或维生素H。 2.分子式：分子式： C10H16O3N2S 分子量：分子量： 244.31 生物素亲和素系统相关提升技术 3.结构：结构： （CH2）4COOH 结合亲和素结合亲和素 结合蛋白质结合蛋白质 咪唑酮环咪唑酮环 噻吩环噻吩环 生物素亲和素系统相关提升技术 why why why 为什么为什么 要对生物素要对生物素 进行活化？进行活化？ 为什么为什么 要对生物素要对生物素 进行活化？

3、进行活化？ 生物素亲和素系统相关提升技术 我我 是是 生生 物物 素素 我我 可可 以以 是是 抗抗 体，体， 也也 可可 以以 是是 酶酶 生物素亲和素系统相关提升技术 我是亲和素，我来了我是亲和素，我来了 生物素亲和素系统相关提升技术 Broken Heart 生物素亲和素系统相关提升技术 我是亲和素，我来了我是亲和素，我来了 生物素亲和素系统相关提升技术 1）生物素分子较小，与蛋白质结合后，由）生物素分子较小，与蛋白质结合后，由 于大分子蛋白质的空间位阻效应，可影响生物于大分子蛋白质的空间位阻效应，可影响生物 素与亲和素间的结合；素与亲和素间的结合； 2）生物素只能依靠肽键与蛋白质上的氨

4、基）生物素只能依靠肽键与蛋白质上的氨基 结合。结合。 因此，活化生物素可克服以上缺点，既减少因此，活化生物素可克服以上缺点，既减少 空间位阻效应，又可扩大其结合的对象。空间位阻效应，又可扩大其结合的对象。 (二二)活化生物素活化生物素 生物素亲和素系统相关提升技术 生物素与蛋白质的结合 生物素亲和素系统相关提升技术 1.标记蛋白质氨基氨基：N-羟基丁二酰亚胺酯 （BNHS）、长臂活化生物素（BCNHS）。 2.标记蛋白质醛基醛基：酰肼（BHZ）和肼化生 物胞素（BCHZ）。 3.标记蛋白质巯基巯基：3-（N-马来酰亚胺-丙 酰）-生物胞素（MPB）。 4.标记核酸核酸：光生物素、生物素脱氧核苷

5、三 磷酸、BNHS和BHZ。 生物素亲和素系统相关提升技术 1.标记蛋白质氨基氨基：N-羟基丁二酰亚胺酯 （BNHS）、长臂活化生物素（BCNHS）。 抗体中性和偏碱性 蛋白的标记 生物素亲和素系统相关提升技术 2.标记蛋白质醛基醛基：生物素酰肼（BHZ）、 肼化生物胞素（BCHZ） 用于偏酸性糖蛋 白的生物素标记 生物素亲和素系统相关提升技术 标记对象： 大分子活性物质：如抗原、抗体。标记后 不影响免疫活性。 酶：如HRP、葡萄糖氧化酶和ALP等。 会降低ALP的活性。 (三)生物素标记蛋白质 生物素亲和素系统相关提升技术 活化生物素可与不同的大分子物质结合，应 根据可标记基团的种类及特性，

6、选择相应的 活化生物素； 抗体：BNHS 偏酸性抗原：BHZ 核酸：光生物素 生物素亲和素系统相关提升技术 一个蛋白质分子可联结多个生物素分子，即 生物素化大分子具有多价性多价性，它是BAS多级放 大作用的物质基础。 但每个蛋白质上标记的生物素分子数量应控 制在一定范围。 每个抗原标记1-3个生物素分子为宜； 每个抗体标记3-5个生物素分子为宜； 生物素：IgG(mg/mg)=2:1，效果较好。 生物素亲和素系统相关提升技术 一、生物素一、生物素-亲和素系统（亲和素系统（BAS） 一一) 生物素及活化生物素生物素及活化生物素 二二) 亲和素及链霉亲和素亲和素及链霉亲和素 三三) 生物素生物素-

7、亲和素系统的特点亲和素系统的特点 生物素亲和素系统相关提升技术 二）亲和素和链霉亲和素二）亲和素和链霉亲和素 (一) 亲和素(avidin，A) 1.概念：是动物微生物中提取的一种含10%碳 水化物的碱性糖蛋白碱性糖蛋白。 2.分子量：68 000 3.结构：4个相同亚基组成的四聚体糖蛋白， 富含色氨酸色氨酸，它是与生物素结合的基团。 生物素亲和素系统相关提升技术 A 4.特性：每个亚基都可结合1个生物素分子， 即1个亲和素分子可结合4个生物素分子。 5.亲和常数：1015/mol 6.缺点：由于是碱性蛋白（PI=10），且含含 糖基糖基，与聚苯乙烯的非特异性吸附非特异性吸附较高， 会导致本底

8、增大，降低检测灵敏度。 生物素亲和素系统相关提升技术 二）亲和素和链霉亲和素二）亲和素和链霉亲和素 (二)链霉亲和素(streptavidin，SA) ： 1.概念：是从链球菌属的菌培养液中提取的一 种蛋白质。 2.分子量：65 000 3.结构：由4个相同的肽链组成，甘氨酸和丙 氨酸含量较大 。 生物素亲和素系统相关提升技术 4.特性：1个亲和素分子可结合4个生物素分 子。 5.亲和常数：1018/mol 6.优点：为弱酸性蛋白（PI=6.0），不含糖基不含糖基， 因此与聚苯乙稀的非特异性吸附非特异性吸附远低于亲 和素，因此应用广泛。 SA 生物素亲和素系统相关提升技术 标记对象： 大分子物

9、质：如酶、抗原和抗体。 小分子物质：胶体金、FITC和化学发光物等。 二）亲和素和链霉亲和素 (三 ) 亲和素的标记 生物素亲和素系统相关提升技术 一、生物素一、生物素-亲和素系统（亲和素系统（BAS） 一一) 生物素及活化生物素生物素及活化生物素 二二) 亲和素及链霉亲和素亲和素及链霉亲和素 三三) 生物素生物素-亲和素系统的特点亲和素系统的特点 生物素亲和素系统相关提升技术 三）生物素三）生物素-亲和素系统的特点亲和素系统的特点 1.特异性强： 亲和素和生物素间的高亲和力。 2.灵敏度高： 每个亲和素分子可与四个生物素结合； 生物素化大分子具多价性。 3.快速、稳定： 4.应用广泛： 可与

10、酶、荧光素、胶体金等多类标记技术结合； 生物素亲和素系统相关提升技术 可有Ag与Ab反应的各种免疫方法：夹心法、 间接法、竞争法等，在此基础上引入A-B系 统。 BAB法： BA法： ABC法： 二、二、 BAS的基本类型及原理的基本类型及原理 生物素亲和素系统相关提升技术 BAB法： AbB A AbB-A B AbB-A-B 特点：以游离A分别连接B-Ab和B-E； AbB和A-B的两次放大效应，可提高灵 敏度。 生物素亲和素系统相关提升技术 +A+A+ BAB法在夹心法在夹心ELISA中的应用中的应用 生物素亲和素系统相关提升技术 BA法： AbB A AbB-A 特点：省略加标记生物素

11、步骤，操作较 BAB法简便；AbB的放大效应，该法有 相当高的灵敏度。 生物素亲和素系统相关提升技术 +A-E BA法在间接法在间接ELISA中的应用中的应用 生物素亲和素系统相关提升技术 ABC法： A+B A- B -ABC Ag+AbB Ag-AbB ABC Ag-AbB-ABC 特点：是在BAB法基础上的改良，将BAB法中 的A先与B-E结合，制备成复合物ABC；操 作比BAB法简便，但仍然保持较高的灵敏 度。 生物素亲和素系统相关提升技术 + +ABC B-E + A ABC ABC法在夹心法在夹心ELISA中的应用中的应用 生物素亲和素系统相关提升技术 1、BAS在酶免疫技术中的应

12、用 2、BAS在荧光免疫技术中的应用 3、BAS在放射免疫技术中的应用 4、 BAS在分子生物学中的应用 三、三、 生物素生物素-亲和素系统的应用亲和素系统的应用 生物素亲和素系统相关提升技术 免疫免疫-PCR 免疫PCR是在ELISA的基础上建立起来的新方法， 用PCR扩增扩增代替ELISA的酶催化底物显色。 PCR具有很强的放大能力，其可以定量地检测 DNA和RNA，具有非常高的敏感性和特异性，因 此，将与抗原结合的特异抗体通过连接分子与DNA 结合，再经PCR扩增，由此定量检测抗原使敏感性 高于ELISA和RIA。 生物素亲和素系统相关提升技术 免疫免疫-PCR 一、主要程序一、主要程序

13、 1. 抗原+生物素化抗体抗原-生物素化抗体 复合物； 2. 加亲合素抗原-生物素化抗体-亲合素复 合物； 3. 加生物素化DNA抗原-生物素化抗体-亲 合素-生物素化DNA； 4. PCR扩增生物素化DNA部分。 生物素亲和素系统相关提升技术 生物素亲和素系统相关提升技术 生物素亲和素系统相关提升技术 二、免疫二、免疫PCR的发展的发展 免疫PCR技术目前尚处于研究阶段，应用的 还不多； 实验表明免疫PCR的敏感性比ELISA高105倍， 且PCR产生的背景信号很弱，可以检测到几 百个分子的抗原，在理论上免疫PCR可以检 测到一个分子抗原一个分子抗原，因此，免疫PCR特别适 用于检测一些含量特别少的抗原分子。 生物素亲和素系统相关提升技术 A Monoclonal-AntibodyEnzymeImmunoassayfor Detection of HepatitisB Surface Antigen with Use of a Biotin-Avidin System CLINICAL CHEMISTRY, 1985,31(2):202-205 Definition of Three Se