静脉移植骨髓间充质干细胞对心肌病心力衰竭心功能的影响

1、静脉移植骨髓间充质干细胞对心肌病心力衰竭心功能的影响侯永兰1，杨东伟2(1新乡市中心医院心血管内一科，河南省新乡市 ；2郑州市中心医院心血管内科，河南省郑州市 )引用本文：侯永兰，杨东伟. 静脉移植骨髓间充质干细胞对心肌病心力衰竭心功能的影响J.中国组织工程研究，2016，20(23): 3413-3418.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.23.010 ORCID: 0000-0002-3496-3388(侯永兰)文章快速阅读：静脉移植骨髓间充质干细胞改善心肌病心力衰竭的心功能侯永兰，女，1980年生，河南省辉县市人，汉族，2007年重庆医科大学毕业，硕士

2、，主治医师，主要从事高血压、冠心病、心力衰竭的药物治疗、心律失常的介入治疗等。中图分类号:R394.2文献标识码:B文章编号:2095-4344(2016)23-03413-06稿件接受：2016-05-04DAPI标记SD大鼠骨髓间充质干细胞股静脉移植移植后4周心肌病心力衰竭大鼠心功能明显改善，移植细胞可在宿主体内存活，并向心肌样细胞发生分化心肌病心力衰竭模型SD大鼠文题释义：心肌病：是一组由于心脏下部分腔室(即心室)的结构改变和心肌壁功能受损所导致心脏功能进行性障碍的病变。依据心脏的病理形态改变将其分为扩张型心肌病、肥厚型心肌病、限制型心肌病、致心律失常性右室心肌病和未定型心肌病。不同类型

3、的心肌病所表现的心力衰竭类型不同，如扩张型心肌病表现为典型的收缩性心力衰竭，肥厚型心肌病和限制型心肌病主要表现为舒张功能不全，致心律失常性右室心肌病则可表现为单纯右心衰，晚期可出现全心衰。心肌肌钙蛋白：是心肌肌肉收缩的调节蛋白。由3种不同基因的亚基组成：心肌肌钙蛋白T、肌钙蛋白I和肌钙蛋白C。目前，用于急性冠状动脉综合征实验室诊断的是心肌肌钙蛋白T和心肌肌钙蛋白I。大部分心肌肌钙蛋白T是以C-T-I的复合物形式存在于细丝上，6%-8%以游离的形式存在于心肌细胞浆中。心肌肌钙蛋白T分子稳定、亲水、特异性抗原决定簇的反应性好。目前所用的单克隆抗体为对心肌特异的捕捉抗体和标记抗体。摘要背景：骨髓间充

4、质干细胞移植可以有效改善心力衰竭所致心功能下降，但关于心肌病所致心力衰竭，相关移植效果及其对心功能的影响等问题，相关的研究较少。目的：探讨静脉移植骨髓间充质干细胞对心肌病心力衰竭心功能的影响。方法：取40只SD大鼠，其中10只进行骨髓间充质干细胞分离与培养，其余30只随机分为3组(n=10)，分别为正常组、模型组以及干细胞移植组。模型组以及干细胞移植组腹腔注射盐酸阿霉素建立心肌病心力衰竭模型，模型制备后7 d干细胞移植组静脉移植骨髓间充质干细胞，对照组予以等量DMEM培养基。移植后4周，对3组大鼠进行心功能检测，免疫荧光检测移植干细胞的存活与分化情况。结果与结论：移植后4周，与正常组和干细胞移

5、植组比较，模型组的左心室收缩压、左室内压最大上升速率、左室内压最大下降速率均出现显著下降，左心室舒张末压显著上升，差异有显著性意义(P 0.05)；经免疫荧光检测，骨髓间充质干细胞移植即刻，在宿主心肌内可观察到较高的荧光强度。移植后4周，荧光强度较移植后即刻出现一定的减弱，密度下降，但可观察到细胞迁移现象，部分细胞表达肌钙蛋白T；实验结果表明，骨髓间充质干细胞静脉移植可以显著改善心肌病心力衰竭大鼠心功能，移植细胞可在宿主体内存活，并向心肌样细胞发生分化。关键词：干细胞；移植；心肌病；心力衰竭；干细胞移植；骨髓间充质干细胞；静脉移植；心功能主题词：心肌疾病；心力衰竭；骨髓；间质干细胞移植；组织工

6、程基金资助：河南省科技发展计划项目(0)Effect of bone marrow mesenchymal stem cells via intravenous transplantation on cardiac function in heart failure induced by cardiomyopathiesHou Yong-lan1, Yang Dong-wei2 (1First Department of Cardiology, Central Hospital of Xinxiang, Xinxiang , Henan Province, China; 2Department

7、 of Cardiology, Central Hospital of Zhengzhou, Zhengzhou , Henan Province, China)AbstractBACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation can effectively improve decreased cardiac function caused by heart failure, but there is a lack of research about the effect in bone marrow mesenchym

8、al stem cell transplantation on cardiac function in heart failure induced by cardiomyopathies.OBJECTIVE: To explore the effect of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on cardiac function in patients with cardiomyopathies accompanied by heart failure. METHODS: Totally 40 Sprague-Dawley r

9、ats were enrolled, and bone marrow mesenchymal stem cells were isolated from 10 rats, and the remaining rats were equivalently randomized into normal, model and stem cell transplantation groups. Then rats in the model and stem cell transplantation groups were given intraperitoneal injection of hydro

10、chloric acid doxorubicin to prepare cardiomyopathy-induced heart failure models. At 7 days after modeling, the stem cell transplantation group was treated with bone marrow mesenchymal stem cells through intravenous transplantation, and the model group was treated with equal amount of DMEM medium. Fo

11、ur weeks later, cardiac function of each rat was detected, and the cell survival and differentiation were observed by immunofluorescence method.RESULTS AND CONCLUSION: At 4 weeks after transplantation, compared with normal and stem cell transplantation groups, the left ventricular systolic pressure

12、and maximum rise/fall rate of left ventricular pressure were significantly decreased, but the left ventricular end diastolic pressure significantly increased in the model group (P 0.05). High and dense fluorescence intensity was observed in the host myocardium immediately after transplantation. Subs

13、equently, the fluorescence intensity and density decreased at 4 weeks, but the cell migration could be found, and some cells expressed cardiac troponin T. These results show that intravenous transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells can improve cardiac function in rats with heart failure

14、 due to cardiomyopathies. Besides, the transplanted cells can survive in the host, and differentiate into cardiomyocyte-like cells.Subject headings: Cardiomyopathies; Heart Failure; Bone Marrow; Mesenchymal Stem Cell Transplantation; Tissue EngineeringFunding: the Science and Technology Development

15、Planning Program of Henan Province, No. 0Cite this article: Hou YL, Yang DW. Effect of bone marrow mesenchymal stem cells via intravenous transplantation on cardiac function in heart failure induced by cardiomyopathies. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(23):3413-3418.Hou Yong-lan, Master, Att

16、ending physician, First Department of Cardiology, Central Hospital of Xinxiang, Xinxiang , Henan Province, China0 引言 Introduction导致心肌损伤的原因有很多，例如冠心病、心肌炎都会导致心肌损伤，一般与心肌供血不足、心肌本身的炎症损害有关1-3。随着干细胞理论与相关技术的不断发展，骨髓间充质干细胞移植成为心力衰竭的重要治疗手段4。以往众多研究结果表明，骨髓间充质干细胞移植治疗可以有效改善心力衰竭所致心功能下降5-9。但是，关于心肌病所致心力衰竭，相关移植效果及其对心功能的

17、影响等，尚缺乏较为详细的动物实验和相关实验依据。实验制备心肌病心力衰竭模型，并通过静脉移植骨髓间充质干细胞治疗，观察大鼠心功能和心肌基本结构变化以及移植干细胞的存活与分化情况，为心肌病心力衰竭的治疗提供一定的实验依据。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 随机对照动物实验。1.2 时间及地点 实验于2015年10至12月在新乡市中心医院完成。1.3 材料 健康雄性SD大鼠40只，体质量250 g左右，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：沪2014-0010，其中10只用于骨髓间充质干细胞培养，其余30只用于动物体内实验研究。研究相关方案均提交医学

18、伦理部门审核，符合相关伦理学要求。静脉移植骨髓间充质干细胞改善心肌病心力衰竭心功能实验所用主要试剂与仪器：试剂及仪器来源盐酸阿霉素大连美仑生物技术有限公司DAPI上海纪宁生物科研有限公司胰蛋白酶北京博奥森生物技术有限公司青霉素北京康思润业生物技术有限公司 氯化钾北京康思润业生物技术有限公司心肌肌钙蛋白T检测试剂盒广州万孚生物技术有限公司苏木精-伊红染色试剂盒北京格源天润生物技术有限公司小动物呼吸机上海朗顿生物科技有限公司丙酮上海纪宁生物科研有限公司多聚甲醛普洛麦格(北京)生物技术有限公司石蜡切片机上海国源生物技术有限公司低温冷冻切片机杭州俊丰生物工程有限公司荧光显微镜北京索莱宝科技有限公司多导

19、生理记录仪上海樊克生物科技有限公司压力转换器上海玉研科学仪器有限公司1.4 实验方法1.4.1 骨髓间充质干细胞分离培养10 取10只SD大鼠进行骨髓间充质干细胞分离与培养，大鼠麻醉后处死，无菌条件下分离股骨和胫骨，用含有DMEM培养液的注射器反复冲洗骨髓腔，收集冲洗液于离心管中，加入淋巴分离液，常规离心，收集中间有核细胞层，加入DMEM培养液进行洗涤，然后将细胞接种在添加DMEM培养液(含胎牛血清)的培养瓶中，置于37 、体积分数为5% CO2孵育箱中培养，每3 d换液1次，观察细胞生长情况，待细胞融合率达到80%以上时进行传代培养。1.4.2 流式细胞仪检测细胞表面标记 收集第3代骨髓间充

20、质干细胞，消化离心，用PBS制成细胞悬液，分装至EP管中，分别加入荧光标记的小鼠抗大鼠单抗CD90-PE，CD44-PE及其同型对照，37 下避光反应15 min，PBS洗涤2次，再加入1 mL PBS重新混悬细胞，流式细胞仪检测细胞表面标记表达率。1.4.3 骨髓间充质干细胞标记 收集第3代骨髓间充质干细胞，PBS洗涤，加入培养液、DAPI孵育30 min，倒去含DAPI培养液，收集细胞，以1106接种于培养皿中，培养72 h后除去旧培养液，加入重组病毒上清液(MOI=100)，利用polybrene调整病毒质量浓度达到 8 mg/L后置于 37 、体积分数为5%CO2孵箱中孵育12 h，换

21、为新鲜培养液继续培养 72 h。收集第6代细胞，PBS洗涤后添加胰蛋白酶进行消化，细胞重悬，调整细胞数为5106(200 L)，置于冰上保存。1.4.4 心肌病心力衰竭模型建立及细胞移植 30只大鼠随机分为3组(n=10)，分别为正常组、模型组以及干细胞移植组。模型组以及干细胞移植组参照文献方法腹腔注射盐酸阿霉素(15 mg/kg，分6次注射，连续注射6周)建立心肌病心力衰竭模型11-13。心功能检测如果出现心脏收缩活动普遍减弱，左室射血分数与左室缩短分数显著下降则视为建模成功。注射完盐酸阿霉素后1周，干细胞移植组大鼠经股静脉注射标记好的骨髓间充质干细胞5106 (200 L) 14-15，模

22、型组给予等体积无血清DMEM培养液，术后腹腔注射青霉素预防感染，正常组不做任何处理。1.4.5 大鼠心功能检测16 移植后4周，对大鼠进行麻醉，右颈总动脉插管，连接多导生理记录仪检测左心室收缩压、左室内压最大上升速率、左室内压最大下降速率、左心室舒张末压。1.4.6 免疫组化检测17 心功能检测完毕后，模型组与干细胞移植组大鼠进行股静脉氯化钾注射，心室停搏于舒张期后开胸，PBS心腔灌流后获得心脏组织，取部分心肌组织制备冰冻切片，置于荧光显微镜下观察标记细胞的生存和迁移情况。将切片置于室温下，丙酮固定 30 min后进行心肌肌钙蛋白T免疫荧光染色，观察细胞分化情况。1.5 主要观察指标 心功能指

23、标；移植干细胞的存活与分化情况。1.6 统计学分析 使用SPSS 18.0软件进行统计学分析，组间比较进行单因素方差分析，P 0.05为差异有显著性意义。2 结果 Results 2.1 实验动物数量分析 30只大鼠均进入最终的结果分析，中途无脱落。2.2 骨髓间充质干细胞培养与鉴定 经原代培养1 d，细胞开始贴壁，呈圆形(图1A)。连续培养7 d，细胞胞体逐渐增大，变为多角形或星形，呈集落样生长(图1B)。经流式细胞仪检测，CD44阳性细胞达到89.3%(图1C)，CD90阳性细胞达到92.6%(图1D)。ABDC图1 骨髓间充质干细胞原代培养形态及鉴定结果Figure 1 Morpholo

24、gy and identification of primary cultured bone marrow mesenchymal stem cells图注：图中A为原代培养1 d细胞开始贴壁，呈圆形(200)；B为连续培养7 d，细胞变为多角形或星形，呈集落样生长(200)；C为CD44阳性表达率为89.3%；D为CD90阳性表达率为92.6%。CBA图2 骨髓间充质干细胞移植后的存活与分化情况(400)Figure 2 Survival and differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells after transplantati

25、on (400)图注：图中A为骨髓间充质干细胞移植后即刻，宿主心肌内可观察到较高的荧光强度；B为移植后4周，荧光强度较移植后即刻出现一定的减弱，密度下降，但可观察到细胞迁移现象；C为移植后4周，部分细胞表达肌钙蛋白T。2.3 移植后4周各组大鼠心功能检测结果 移植后4周，与正常组和干细胞移植组比较，模型组的左心室收缩压、左室内压最大上升速率、左室内压最大下降速率均出现显著下降，左心室舒张末压显著上升，差异有显著性意义(P 0.05)，见表1。表1 移植后4周各组大鼠心功能检测结果 (s)Table 1 Cardiac function of rats in each group at 4 we

26、eks after cell transplantation检测指标正常组模型组干细胞移植组左心室收缩压(mm Hg)左心室舒张压(mm Hg)左室内压最大上升速率(mm Hg/s)左室内压最大下降速率(mm Hg/s)12481115 9953186 210459755a202a3 645378a3 550350a1198 121 5 845301 5 975335 表注：与正常组和干细胞移植组比较，aP 0.05。1 mm Hg=0.133 kPa。2.4 骨髓间充质干细胞移植后的存活与分化情况 骨髓间充质干细胞移植即刻，在宿主心肌内可观察到较高的荧光强度(图2A)。移植后4周，荧光强度较

27、移植后即刻出现一定的减弱，密度下降，但可观察到细胞迁移现象，表明移植干细胞依然存活(图2B)。同时，部分细胞表达肌钙蛋白T，提示移植细胞向心肌样细胞发生了分化(图2C)。3 讨论 Discussion间充质干细胞可以分化成心肌细胞，这给广大心脏病患者带来了福音18。心肌病心力衰竭后可以采用骨髓间充质干细胞移植治疗19-20。静脉注射移植创伤小，操作简单，安全性高21。实验选择对心肌病心力衰竭大鼠进行静脉注射移植治疗。阿霉素是一种常用的抗肿瘤化疗药物，会对正常组织器官产生较大的损伤，且与心肌组织之间具有较高的亲和力，可引发伴有心力衰竭的心肌病22-26。实验选择利用阿霉素对模型组以及干细胞移植组

28、大鼠进行诱导，获得伴有心力衰竭的心肌病模型。实验结果显示，移植后4周，与正常组和干细胞移植组比较，模型组的左心室收缩压、左室内压最大上升速率、左室内压最大下降速率均出现显著下降，左心室舒张末压显著上升，差异有显著性意义(P 0.05)。上述实验结果表明，对心肌病心力衰竭大鼠实施骨髓间充质干细胞静脉移植治疗可以获得理想的效果，显著改善其心功能。分析骨髓间充质干细胞静脉移植治疗心肌病心力衰竭的作用机制，可能涉及到以下一些方面：第一，骨髓间充质干细胞在进入宿主体内之后，可以发生分化，分化为心肌细胞和血管平滑肌细胞以及血管内皮细胞，并形成新的血管27-30，从而改善原本缺血心肌的血液供应，保护受病变影

29、响濒临凋亡的心肌细胞31-33。第二，骨髓间充质干细胞可以发挥出旁分泌效应，分泌的细胞因子参与组织修复，对血管生长产生积极的促进作用34-35。第三，骨髓间充质干细胞可以表达多种细胞活性因子，减少心肌细胞的丢失。骨髓间充质干细胞改善心功能的前提是细胞可以在宿主心肌内存活，向心肌细胞分化36-39。实验经免疫荧光检测还发现，骨髓间充质干细胞移植后即刻，在宿主心肌内可观察到较高的荧光强度。移植后4周观察，荧光强度较移植后即刻出现一定的减弱，密度下降，但可观察到细胞迁移现象，部分细胞表达心肌特异性肌钙蛋白T40。上述结果提示，移植细胞可以在宿主体内存活，并向心肌样细胞发生分化。实验初步证实，骨髓间充

30、质干细胞静脉移植治疗心肌病心力衰竭大鼠可以获得理想的效果，显著改善其心功能。移植细胞可在宿主体内存活，并向心肌样细胞发生分化。作者贡献：实验设计、实施、评估为全部作者。利益冲突：所有作者共同认可文章内容不涉及相关利益冲突。伦理问题：实验过程中对动物的处置符合2009 年Ethicalissues in animal experimentation相关动物伦理学标准的条例。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算

31、机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4 参考文献 References1 姜艳杰,毛成刚,宁险峰,等.肌肉注射脐带间充质干细胞对扩张型心肌病大鼠相关细胞因子的影响J.中国组织工程研究,2015,19(14):2179-2185.2 姚巍,王凤芝.静脉移植骨髓间充质干细胞联合重组人生长激素对充血性心肌病大鼠心肌和血管组织的修复J.中国组织工程研究与临床康复,2010,14(6):1064-1067.3 李杨,陈沅,田杰,等.心肌病大鼠骨髓间充质干细胞移植后差异表达基因cDNA文库的构建J.中国组织工程研究与

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