MFG-E8调控系统性红斑狼疮内中性粒细胞免疫反应及组织损伤的作用机制研究

1、MFG-E8调控系统性红斑狼疮内中性粒细胞免疫反应及组织损伤的作用机制研究目的：系统性红斑狼疮(systemic erythematosus lupus, SLE) 是 一种以血清中出现多种自身抗体为特点，病变累及多系统、多器官，严重 影响人类身体健康和心理健康的自身免疫性疾病。SLE天然免疫内中性粒细胞的异常特征引起的免疫反应如异常招募、凋亡或形成细胞 外诱捕网，最终导致自身抗体形成及免疫复合物沉积于组织器官，越来越 受到研究者的重视。乳脂球生长因子忸(milk fat globule EGF-factor 忸,MFG-E8)是一种存在于多种物种体内的亲脂性糖蛋白其最初被发现是它 作为一个桥

2、梁分子，介导凋亡细胞的清除。由于清除凋亡细胞能力受损， 凋亡细胞继发性坏死释放炎性或免疫原性自身 抗原如高迁移组box-1蛋白 (high mobility group box-1, HMGB-1)和 dsDNA 等,MFG-E8 敲除小鼠能自发 形成类似于SLE的自身免疫性疾 病。然而,MFG-E8是否能通过改善SLE内 中性粒细胞的异常免疫反应，进而缓解系统性组织损伤，目前尚无研究。 因此，本研究旨在探索MFG-E8调控SLE天然免疫中中性粒细胞异常免疫反 应的作用机制。方法：(1)检测SLE病人与降植烷(Pristane)诱导的小鼠SLE模型中MFG-E水 平：选取临床上药物处理或未进行

3、药物干预的女性SLE患者样本51例及 35例健康对照样本(年龄20-45岁，武汉市第一医院),ELISA检测血清中 MFG-E8浓度。腹腔注射0.5 mL Pristane诱 导SLE模型小鼠(24周),ELISA 检测其血清中MFG-E含量。同时，利用ELISA检测早期炎症反应期(2周)， 小鼠肺泡灌洗液 (bronchoalveolar lavage fluid, BALF) 腹腔灌洗液中 MFG-E8 水平，并利 用western blot检测肺组织中MFG-E啲表达量。检测MFG-E8对 Pristane诱导的SLE小鼠肺脏及腹腔早期炎症反应的影响：同窝、雌性、 周龄匹配的野生型(wi

4、ld-type, WT)与构建的MFG-E8基因敲除(Mfge8-/-)小 鼠分别注射Pristane构建SLE模型，分别在诱导16小 时、5天、10天、14 天后利用流式细胞术检测腹腔及BALF中总细胞、CDllb鈿胞、中性粒细胞 及巨噬细胞数量。同时,ELISA检测Pristane诱导Mfge8-/-及WT小鼠腹腔 灌洗液及 BALF 中细胞因子如 IL-6、IL-12/IL-23p40、TNFa、IL-1 B、IL- 10、TGF-p 1及趋化因子MIP-2的含量。另外，分别利用流式细胞术及 ELISA检测Pristane诱导2周后WT及Mfge8-/-小鼠腹腔灌洗液中单核细胞 比例及I

5、FN- a含量。Pristane注射2周后引起肺泡弥漫性出血，H&E染色分析WT及Mfge8-/-小 鼠肺泡出血比例及出血指数，并检测肺组织中中性粒细胞 的浸润及渗漏的 总蛋白含量。同时，H&E或PAS染色检测脾、肝及肾-脏组织病理学及炎症 细胞浸润变化。(3)探索MFG-E调节Pristane诱导小鼠早期炎症中中性粒细 胞招募的分子机制：早期炎症反应中,MFG-E8缺失导致中性粒细胞在肺 组织及腹腔中的招募显著升高，为进一步验证MFG-E8对其迁移的影响，本课题设计体内外实验检测WT及 Mfge8-/-中性粒细胞的趋化效率。分别将WT及Mfge8-/-小鼠骨髓中 percol 1分离的中性粒

6、细胞(4 x 106)标记不同的荧光标记(PKH26 PKH67后 等量地尾静脉注射于WT小鼠(提前1小时注射Pristane)体内，16小时后流 式细胞术检测BALF及腹腔灌洗液中不同 荧光标记的中性粒细胞比例。同时，利用Transwell小室体外检测WT及 Mfge8-/-小鼠骨髓来源的中性粒细胞迁移效率。腹腔注射rmMFG-E8 (recombinant murine MFG-E& 20 卩 g/kg)干预 Pristane 诱导的 SLE 小 鼠，16小时后检测腹腔灌洗液及BALF中中性粒细胞数量；同时，体外给予 500 ng/mLrmMFG-E预处理后，检测其对骨髓来源中性粒细胞迁移

7、的影响。 ELISA检测Pristane诱导Mfge8-/-及WT小鼠BALF及腹腔灌洗液中中性粒 细胞趋化因子MIP-2浓度水平，并且利用流式细胞术检测野生型及Mfge8-/-小鼠骨髓中分离的中性粒细胞表面趋 化因子受体CXCR2 (CD 182的表达量。选取临床上给予药物治疗或未经药物 处理的年轻女性SLE患者52例及对应年龄的健康对照组36例，流式细胞 术检测外周血中性粒细胞比例及其细胞表面受体CXCR2勺表达量;其中各选 取12例SLE患者及健康对照组外周血，分 离中性粒细胞并加入500 ng/mL rhMFG-E8 (recombinant humanMFG-E8)体外培养后流式细胞

8、术检测细胞表面 受体CXCR表达量的变化。在Pristane诱导的小鼠模型中，分别分离WT小鼠、Pristane诱导16小 时后 WT小鼠及提前给予rmMFG-E治疗的Pristane诱导小鼠骨髓中性粒细胞，分 别用流式细胞术检测表面受体CXCR的表达量。(4)MFG-E8对SLE模型小鼠细胞凋亡的影响：Pristane注射WT及Mfge8-/-小 鼠5天后，经Ann exin V及PI染色后流式细胞术检测BALF及腹腔灌洗液 中凋亡细胞的比例。同时,利用末端标记法(terminal deoxynucleotidyl t ransf erase-media ted dUTP nick end

9、labeling, TUNEL)检测 Pris tane 刺 激3不同小鼠14天后肺组织中细胞凋亡情况；并且利用western blot 检测肺组织中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bcl-xL及Bax的表达量。另外，免疫荧 光检测WT及Mfge8-/-小鼠腹腔中活化巨噬细胞吞噬凋亡中性粒细胞及荧 光微球的效率。(5)MFG-E8对SLE模型小鼠中性粒细胞释放中性粒细胞外诱 捕网(neutrophil extracellular traps, NETs) 的影响:NETosis 作为中性 粒细胞一种特殊的死亡形式，释放大量与SLE自身抗体相关的自身抗 原。 免疫荧光检测WT及Mfge8-/-小鼠骨髓中

10、分离的中性粒细胞自发 及PMA LPS 和MIP-2刺激释放NETS的含量。Pristane诱导WT及Mfge8-/-小鼠24周 后，收集血清，检测两种血清诱导WT小鼠中性粒细 胞释放NETS的比例， 并检测血清中诱导NETs释放的刺激成分，如抗NET抗体、循环免疫复合物 (circulatingimmunecomplexes,CICs)、TNFa及MIP-2o同时，利用免疫荧光检测SLE模型小鼠肺、肾组织 中NETS 的形成。(6)检测自身抗体的产生及免疫复合物沉积:Pristane刺激24周后，解剖学检测WT及Mfge8-/-小鼠脾脏大小 及H&E 染色分析脾组织病理学改变；同时，利用H&

11、E或PAS染色检测肝、肺及肾 脏组织病理学改变。免疫荧光检测Pristane诱导WT及Mfge8-/-小鼠24周 后血清中ANA抗dsDNA抗体及ANCA勺滴度;利U用直接免疫荧光检测肺、肾 组织中免疫复合物(IgG和C3)的沉积情况;ELISA检测尿液中白蛋白、肾损伤因子-1 (Kim-1)的含量，并利用 肌氨酸 氧化酶法(Sarcosine oxidase enzymatic assay, SOE assay)检测尿液中肌 肝的含量。结果:(DMFG-E8是SLE患者及SLE模型小鼠发病机制中重要的 调控因子:SLE患者及注射Pristane 24周后WT小鼠血清中MFG-E眛度显著高于正

12、常对照组。在早期炎症时期，即 Pristane诱导14天后,WT小鼠BALF及腹腔灌洗液中MFG-E眛度显 著升高； 同时，小鼠肺组织中MFG-E8勺表达量也显著高于未给予Pristane朿嗷的WT 小鼠。结果表明，在SLE患者及SLE模型小鼠中,MFG-E8在发病机制中发挥 着重要的作用。（2） MFG-E8缺失加重SLE模型小鼠肺脏及腹腔中炎症反 应：在SLE患者及SLE模型小鼠体内MFG-E水平显著上调，然而当MFG-E敲 除后,Pristane诱导小鼠的早期炎症反应加重。注射Pristane 16小时、5 天、10天及14天 后,Mfge8-/-小鼠BALF中总细胞、中性粒细胞及巨噬细

13、 胞浸润明显高 于WT小鼠；同时,Mfge8-/-、鼠腹腔灌洗液中总细胞、 CDIIb+细胞、中性粒细胞招募明显增多，但巨噬细胞减少。随着 Pristane刺激的Mfge8-小鼠肺脏及腹腔中大量炎症细胞浸润,BALF及腹腔 灌洗液中促炎细胞因子如IL-6、IL-12/IL-23p40、TNF-a显著高于WT小 鼠，并且腹腔中抗炎细胞因子IL-10及TGF-B 1明显降低。注射Pristane 14天后,Mfge8-/-小鼠腹腔灌洗液中单核细胞的比例明显高于WT小鼠，且分泌的IFN- a浓度明显上调。由于Pristane刺激C57BL/6小 鼠2 周后，肺泡呈现弥散性红细胞浸润（diffuse

14、pulmonary hemorrhage, DPH）,本研究中，注射 Pristane 2 周后 Mfge8-/- 小鼠中 肺完全出血的比例明显高于WT小鼠，表现为出血比例及出血指数明 显升 高，伴随着中性粒细胞浸润明显加重及BALF中蛋白水平急剧升高。另 外,Mfge8-/-及WT小鼠肝脏、肾脏及脾脏组织中也有不同程度 的病理学改 变。（3） MFG-E8通过调节趋化因子受体CXCR表达来调控SLE小鼠中性粒细胞招募：本课题研究结果表明，与WVJ、鼠相比，尾静脉注射Mfge8-/- 小鼠骨髓中性粒细胞招募至Pristane刺激的肺组织及腹腔中的数量显著 增高，且体外培养的Mfge8-/-小鼠

15、骨髓中性粒细胞趋化效率显著增高。 外源性给予rmMFG-E干预后,Pristane诱导 的WT及Mfge8-/-小鼠肺组织 及腹腔内中性粒细胞招募比未给予rmMFG-E治疗的减少。体外给予rmMFG-E 预处理后,WT及Mfge8-/-骨髓来源中性粒细胞对MIP-2的趋化能力明显低 于未给予rmMFG-E8干预的细胞。进一步检测发现,Pristane朿嗷的Mfg8-/- 及WT小鼠BALF及腹腔灌洗液中MIP-2的水平并没有显著性差异，而作为趋 化因 子MIP-2的受体,CXCR2在M/ge8-/-中性粒细胞表面的表达量明显高 于WT、鼠中性粒细胞。同时，检测收集的SLE患者外周血内中性粒细

16、胞 表面CXCR2表达，结果发现SLE患者外周血中性粒细胞细胞比例明显高于健 康对照组，并且细胞表面CXCR2的表达量也显著高于对照组；而当外源给予 rhMFG-E8治疗时,SLE患者外周血中性粒细胞表面CXCR2勺表达显著下调。 同时,Pristane诱导SLE小鼠骨髓中分离的中性粒细胞表面CXCR的表达也 显著高于未经处理的WT、鼠;且给予rmMFG-E干预后，细胞表面CXCR2勺 表达量明显降低。（4） MFG-E8缺 失导致SLE模型小鼠体内凋亡细胞积 聚:Pristane朿嗷5天 后,Mfge8-/-小鼠BALF及腹腔灌洗液中早期凋亡细胞 及晚期凋亡细胞比例明显高于WT小鼠。Pris

17、tane刺激14天后,H&E染色及TUNEL检测发 现大量死亡细胞沉积在Mfge8-/-小鼠肺泡间质，且Mfge8-/-肺组织中 Bcl-2、Bcl_xL蛋白表达明显下调，而Bax蛋白表达显著升高,Bcl-2/Bax比例显著性低于WT小鼠。同时，本研究证实Mfge8-/- 小鼠腹腔内富集的活化巨噬细胞吞噬凋亡中性粒细胞及荧光微球的能力显 著低于WT小鼠。因此，结果表明，较多的凋亡细胞沉积于Mfge8-/-小鼠 炎性组织，一方面是由于过多的炎症细胞如中性粒细胞 招募，在炎症环境 下发生凋亡；另一方面是由于Mfge8-/-巨噬细胞吞噬凋亡细胞的能力受 损。（5） MFG-E8缺失导致中性粒细胞释放

18、更多的NETS：本研究结果发现， 无论是自发诱导，还是LPS MIP-2刺激后，与WT小鼠相比,Mfge8-/-小鼠骨 髓中性粒细胞释放NETs明显增多。Pristane诱导24周后收集的Mfge8-/-小鼠血清刺激WT中性粒细胞 释放 NETS的能力显著高于WT小鼠血清;进-步检测发现Mfge8-/-小鼠的血清中 CICs、TNFa水平明显高于WT小鼠,MIP-2水平呈升高趋 势，且抗NET抗体（结合NETS抑制NETs被降解）水平显著高于WT小鼠。同时，免疫荧光检 测发现注射Pristane 2周后,Mfge8-/-小鼠肺 泡间质就开始产生NETs直至 24周后，肺泡间质中大量的NETs沉积；同时,Pristane刺激24周 后,Mfge8-/-小鼠肾小球周围发现NETs形 成。（6） MFG-E8缺失加速SLE小 鼠自身抗体产生及免疫复合物沉 积:Pristane刺激或未刺激Mfge8-/-小鼠 24周后，小鼠脾脏明显肿大 且伴有明