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文档简介
1、PCR 技术原理PCR产物的电泳检测时间一般为 48h 以内,有些最好于当日 电泳检测,大于 48h 后带型不规则甚致消失。一. 假阴性,不出现扩增条带PCR 反应的关键环节有模板核酸的制备, 引物的质量与 特异性,酶的质量及活性 PCR 循环条件。寻找原因亦应针 对上述环节进行分析研究。模板:模板中含有杂蛋白质, 模板中含有 Taq 酶抑制剂, 模板中蛋白质没有消化除净, 特别是染色体中的组蛋白, 在 提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。模板核酸变性不彻底。 在酶和引物质量好时, 不出现扩增带, 极有可能是标本的消化处 理,模板核酸提取过程出了毛病, 因而要配制有效而稳定的消化 处理液,其程序
2、亦应固定不宜随意更改。酶失活:需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否 因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加 Taq 酶或溴乙锭。引物:引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称, 是 PCR 失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批 号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低, 造成低效率的不对称扩增, 对策为: 选定一个好的引物合成单 位。引物的浓度不仅要看 OD 值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳, 一定要有引物条带出现, 而且两引物带的亮度应大体 一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做 PCR 有可 能失败,应和引物合成单位协商解决。
3、如一条引物亮度高,一条 亮度低, 在稀释引物时要平衡其浓度。 引物应高浓度小量分装 保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分, 导致引物变质降解 失效。引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚 体等。Mg2+浓度: Mg2+ 离子浓度对 PCR 扩增效率影响很大,浓 度过高可降低 PCR扩增的特异性,浓度过低则影响 PCR 扩增产 量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变:通常进行 PCR 扩增采用的体积为 20ul、 30ul、 50ul。或 100ul,应用多大体积进行 PCR 扩增,是根据科 研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如 20ul 后,再做大 体积时,一
4、定要模索条件,否则容易失败。物理原因:变性对 PCR 扩增来说相当重要,如变性温度低, 变性时间短,极有可能出现假阴性 ; 退火温度过低,可致非特异 性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的 结合而降低 PCR 扩增效率。有时还有必要用标准的温度计,检 测一下扩增仪或水溶锅内的变性、 退火和延伸温度, 这也是 PCR 失败的原因之一。靶序列变异: 如靶序列发生突变或缺失, 影响引物与模板特 异性结合, 或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列, 其PCR 扩增是不会成功的二. 假阳性,出现非特异性扩增带1. 假阳性出现的 PCR 扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带 更整齐
5、,亮度更高。引物设计不合适: 选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源 性,因而在进行 PCR 扩增时,扩增出的 PCR 产物为非目的性的 序列。靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性。需重新设计引 物。靶序列或扩增产物的交叉污染: 这种污染有两种原因: 一是 整个基因组或大片段的交叉污染, 导致假阳性。 这种假阳性可用 以下方法解决: 操作时应小心轻柔, 防止将靶序列吸入加样枪 内或溅出离心管外。 除酶及不能耐高温的物质外, 所有试剂或 器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。 必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存 在的核酸。 二是空气中的小片段核酸污染, 这些小
6、片段比靶序列 短,但有一定的同源性。可互相拼接,与引物互补后,可扩增出 PCR 产物,而导致假阳性的产生,可用巢式 PCR 方法来减轻或 消除。2. 出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致, 或大或小, 或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。 非特异性条带的出 现,其原因:一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二 聚体。二是 Mg2+离子浓度过高、 退火温度过低, 及 PCR 循环次 数过多有关。 其次是酶的质和量, 往往一些来源的酶易出现非特 异条带而另一来源的酶则不出现, 酶量过多有时也会出现非特异 性扩增。其对策有:必要时重新设计引物。减低酶量或调换 另一来源
7、的酶。 降低引物量, 适当增加模板量, 减少循环次数。 适当提高退火温度或采用二温度点法 (93变性, 65左右退 火与延伸 )。3. 出现片状拖带或涂抹带PCR 扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。 其原因往往 由于酶量过多或酶的质量差, dNTP 浓度过高, Mg2+ 浓度过高, 退火温度过低,循环次数过多引起。其对策有:减少酶量,或 调换另一来源的酶。减少 dNTP 的浓度。适当降低 Mg2+ 浓 度。增加模板量,减少循环次数。三. PCR 污染与对策PCR 反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性,但 令人头痛的问题是易污染, 极其微量的污染即可造成假阳性的产 生。污染原因(
8、一) 标本间交叉污染 :标本污染主要有收集标本的容器被污染, 或标本放置时, 由于密封不严溢于容器外, 或容器外粘有标本而 造成相互间交叉污染 ; 标本核酸模板在提取过程中,由于吸样枪 污染导致标本间污染 ;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或 形成气溶胶而扩散,导致彼此间的污染。(二)PCR 试剂的污染 :主要是由于在 PCR 试剂配制过程中,由 于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被 PCR 核酸模板污染 .(三)PCR 扩增产物污染 : 这是 PCR 反应中最主要最常见的污染 问题,因为 PCR产物拷贝量 大(一般为 1013 拷贝/ml) ,远远高于 PCR 检测数个拷贝的极限,所以极微量
9、的 PCR 产物 污染,就可 造成假阳就可形成假阳性。还有一种容易忽视,最可能造成 PCR 产物污染的形式是气溶 胶污染 ; 在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶,在操作时比较 剧烈地摇动反应管, 开盖时、 吸样时及污染进样枪的反复吸样都 可形成气溶胶而污染 .据计算一个气溶胶颗粒可含 48000 拷贝, 因而由 其造成的污染是一个值得特别重视的问题 .(四 )实验室中克隆质粒的污染 :在分子生物学实验室及某些用 克隆质粒做阳性对照的检验室, 这个问题也比较常见。 因为克隆 质粒在单位容积内含量相当高, 另外在纯化过程中需用较多的用 具及试剂, 而且在活细胞内的质粒, 由于活细胞的生长繁殖的简
10、便性及具有很强的生命力,其污染可能性也很大。污染的监测一个好的实验室, 要时刻注意污染的监测, 考虑有无污染是什 么原因造成的污染,以便采取措施,防止和消除污染。四. 对照试验1. 阳性对照 :在建立 PCR 反应实验室及一般的检验单位都应设 有 PCR 阳性对照,它是 PCR 反应是否成功、产物条带位置及大 小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。 阳性对照要选择扩 增度中等、重复性好,经各种鉴定是该产物的标本,如以重组质 粒为阳性对照,其含量宜低不宜高 (100 个拷贝以下 ),但阳性对 照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本, 其对检测或扩增样品污染 的可能性很大。因而当某一 PCR 试剂经自
11、己使用稳定,检验人 员心中有数时,在以后的实验中可免设阳性对照。2. 阴性对照 : 每次 PCR 实验务必做阴性对照。它包括标本对 照 :被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照 ;被检的标本 是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。试剂对照:在 PCR 试剂中不加模板 DNA 或 RNA ,进行 PCR 扩增,以监测试剂是否 污染。3. 重复性试验4. 选择不同区域的引物进行 PCR 扩增五. 防止污染的方法(一)合理分隔实验室 :将样品的处理、配制 PCR反应液、 PCR循 环扩增及 PCR 产物的鉴定等步骤分区或分室进行,特别注意样 本处理及 PCR 产物的鉴定应与其它步骤严格分开。最好能
12、划分标本处理区 ;PCR 反应液制备区 ; PCR循环扩增 区; PCR 产物鉴定区。其实验用品及吸样枪应专用,实验前应 将实验室用紫外线消毒以破坏残留的 DNA 或 RNA 。(二)吸样枪 :吸样枪污染是一个值得注意的问题。由于操作时不 慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源, 因而加样或吸取模板核酸时要十分小心, 吸样要慢, 吸样时尽量 一次性完成,忌多次抽吸,以免交叉污染或产生气溶胶污染。(三)预混和分装 PCR 试剂:所有的 PCR试剂都应小量分装, 如有 可能, PCR 反应液应预先配制好,然后小量分装, -20保存。 以减少重复加样次数,避免污染机会。另外, PCR 试剂, PCR 反应液应与样品及 PCR 产物分开保存,不应放于同一冰盒或同 一冰箱。(四 )防止操作人员污染,使用一次性手套、吸头、小离心管应一 次性使用。(五 )设立适当的阳性对照和阴性对照, 阳性对照以能出现
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