PCR技术原理模板

1、PCR 技术原理PCR产物的电泳检测时间一般为 48h 以内，有些最好于当日 电泳检测，大于 48h 后带型不规则甚致消失。一. 假阴性，不出现扩增条带PCR 反应的关键环节有模板核酸的制备， 引物的质量与 特异性，酶的质量及活性 PCR 循环条件。寻找原因亦应针 对上述环节进行分析研究。模板：模板中含有杂蛋白质， 模板中含有 Taq 酶抑制剂， 模板中蛋白质没有消化除净， 特别是染色体中的组蛋白， 在 提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模板核酸变性不彻底。 在酶和引物质量好时， 不出现扩增带， 极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病， 因而要配制有效而稳定的消化 处理液，其程序

2、亦应固定不宜随意更改。酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否 因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加 Taq 酶或溴乙锭。引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称， 是 PCR 失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批 号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低， 造成低效率的不对称扩增， 对策为： 选定一个好的引物合成单 位。引物的浓度不仅要看 OD 值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳， 一定要有引物条带出现， 而且两引物带的亮度应大体 一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做 PCR 有可 能失败，应和引物合成单位协商解决。

3、如一条引物亮度高，一条 亮度低， 在稀释引物时要平衡其浓度。 引物应高浓度小量分装 保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分， 导致引物变质降解 失效。引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚 体等。Mg2+浓度： Mg2+ 离子浓度对 PCR 扩增效率影响很大，浓 度过高可降低 PCR扩增的特异性，浓度过低则影响 PCR 扩增产 量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变：通常进行 PCR 扩增采用的体积为 20ul、 30ul、 50ul。或 100ul，应用多大体积进行 PCR 扩增，是根据科 研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如 20ul 后，再做大 体积时，一

4、定要模索条件，否则容易失败。物理原因：变性对 PCR 扩增来说相当重要，如变性温度低， 变性时间短，极有可能出现假阴性 ; 退火温度过低，可致非特异 性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的 结合而降低 PCR 扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检 测一下扩增仪或水溶锅内的变性、 退火和延伸温度， 这也是 PCR 失败的原因之一。靶序列变异： 如靶序列发生突变或缺失， 影响引物与模板特 异性结合， 或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列， 其PCR 扩增是不会成功的二. 假阳性，出现非特异性扩增带1. 假阳性出现的 PCR 扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带 更整齐

5、，亮度更高。引物设计不合适： 选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源 性，因而在进行 PCR 扩增时，扩增出的 PCR 产物为非目的性的 序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引 物。靶序列或扩增产物的交叉污染： 这种污染有两种原因： 一是 整个基因组或大片段的交叉污染， 导致假阳性。 这种假阳性可用 以下方法解决： 操作时应小心轻柔， 防止将靶序列吸入加样枪 内或溅出离心管外。 除酶及不能耐高温的物质外， 所有试剂或 器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。 必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存 在的核酸。 二是空气中的小片段核酸污染， 这些小

6、片段比靶序列 短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出 PCR 产物，而导致假阳性的产生，可用巢式 PCR 方法来减轻或 消除。2. 出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致， 或大或小， 或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。 非特异性条带的出 现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二 聚体。二是 Mg2+离子浓度过高、 退火温度过低， 及 PCR 循环次 数过多有关。 其次是酶的质和量， 往往一些来源的酶易出现非特 异条带而另一来源的酶则不出现， 酶量过多有时也会出现非特异 性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换 另一来源

7、的酶。 降低引物量， 适当增加模板量， 减少循环次数。 适当提高退火温度或采用二温度点法 （93变性， 65左右退 火与延伸 ）。3. 出现片状拖带或涂抹带PCR 扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。 其原因往往 由于酶量过多或酶的质量差， dNTP 浓度过高， Mg2+ 浓度过高， 退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或 调换另一来源的酶。减少 dNTP 的浓度。适当降低 Mg2+ 浓 度。增加模板量，减少循环次数。三. PCR 污染与对策PCR 反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但 令人头痛的问题是易污染， 极其微量的污染即可造成假阳性的产 生。污染原因（

8、一） 标本间交叉污染 :标本污染主要有收集标本的容器被污染， 或标本放置时， 由于密封不严溢于容器外， 或容器外粘有标本而 造成相互间交叉污染 ; 标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪 污染导致标本间污染 ;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或 形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。（二）PCR 试剂的污染 :主要是由于在 PCR 试剂配制过程中，由 于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被 PCR 核酸模板污染 .（三）PCR 扩增产物污染 : 这是 PCR 反应中最主要最常见的污染 问题，因为 PCR产物拷贝量 大（一般为 1013 拷贝/ml） ，远远高于 PCR 检测数个拷贝的极限，所以极微量

9、的 PCR 产物 污染，就可 造成假阳就可形成假阳性。还有一种容易忽视，最可能造成 PCR 产物污染的形式是气溶 胶污染 ; 在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较 剧烈地摇动反应管， 开盖时、 吸样时及污染进样枪的反复吸样都 可形成气溶胶而污染 .据计算一个气溶胶颗粒可含 48000 拷贝， 因而由 其造成的污染是一个值得特别重视的问题 .（四 ）实验室中克隆质粒的污染 :在分子生物学实验室及某些用 克隆质粒做阳性对照的检验室， 这个问题也比较常见。 因为克隆 质粒在单位容积内含量相当高， 另外在纯化过程中需用较多的用 具及试剂， 而且在活细胞内的质粒， 由于活细胞的生长繁殖的简

10、便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。污染的监测一个好的实验室， 要时刻注意污染的监测， 考虑有无污染是什 么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。四. 对照试验1. 阳性对照 :在建立 PCR 反应实验室及一般的检验单位都应设 有 PCR 阳性对照，它是 PCR 反应是否成功、产物条带位置及大 小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。 阳性对照要选择扩 增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质 粒为阳性对照，其含量宜低不宜高 （100 个拷贝以下 ），但阳性对 照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本， 其对检测或扩增样品污染 的可能性很大。因而当某一 PCR 试剂经自

11、己使用稳定，检验人 员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。2. 阴性对照 : 每次 PCR 实验务必做阴性对照。它包括标本对 照 :被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照 ;被检的标本 是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。试剂对照:在 PCR 试剂中不加模板 DNA 或 RNA ，进行 PCR 扩增，以监测试剂是否 污染。3. 重复性试验4. 选择不同区域的引物进行 PCR 扩增五. 防止污染的方法（一）合理分隔实验室 :将样品的处理、配制 PCR反应液、 PCR循 环扩增及 PCR 产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样 本处理及 PCR 产物的鉴定应与其它步骤严格分开。最好能

12、划分标本处理区 ;PCR 反应液制备区 ; PCR循环扩增 区; PCR 产物鉴定区。其实验用品及吸样枪应专用，实验前应 将实验室用紫外线消毒以破坏残留的 DNA 或 RNA 。（二）吸样枪 :吸样枪污染是一个值得注意的问题。由于操作时不 慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源， 因而加样或吸取模板核酸时要十分小心， 吸样要慢， 吸样时尽量 一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。（三）预混和分装 PCR 试剂:所有的 PCR试剂都应小量分装， 如有 可能， PCR 反应液应预先配制好，然后小量分装， -20保存。 以减少重复加样次数，避免污染机会。另外， PCR 试剂， PCR 反应液应与样品及 PCR 产物分开保存，不应放于同一冰盒或同 一冰箱。（四 ）防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一 次性使用。（五 ）设立适当的阳性对照和阴性对照， 阳性对照以能出现