人类基因组DNA的提取

1、人类基因组DNA的 提取 主讲人： 协 助者： 人类基因组DNA 人类基因组DNA提取的原理 哺乳动物的一切有核细胞都可以 用来制备DNA，除特殊要求外，白细 胞、肝或脾组织是最常用的材料。原 始材料较少或较难获得时（如羊水细 胞），还必须经过细胞培养来获得足 够量的细胞；有时为了简便易行起见， 还可以无创伤地采集材料，如用口腔 上皮脱落细胞、发根细胞。产前诊断 所用的材料则为胎儿的羊水细胞或者 绒毛膜细胞。 人类基因组DNA提取的原理 根据材料来源不同，采取不同的材料 处理方法，而后的DNA提取方法大体类似， 但都应考虑以下原则： （1）防止和抑制DNase对DNA的降解； （2）尽量减少对

2、溶液中DNA的机械剪切 破坏，保持DNA分子的完整； （3）将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干 净。 人类基因组DNA提取的原理 制备基因组DNA是进行基因结构和功能研 究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不 小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避 免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA 的完整性，为后续的实验打下基础。一般真核 细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、 培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是 采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K 消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法 获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析， 还可用于PC

3、R的模板、文库构建等实验。 人类基因组DNA提取的原理 SDS是一种去污剂，破坏细胞膜的脂质膜。 蛋白酶K是一种很强的蛋白水解酶，能消化 各种蛋白质（包括糖蛋白和肽类）及脂类和胺 类物质，但糖蛋白的降解物常与DNA一同沉淀 下来，干扰酶的活性，消化后需要用酚、氯仿 抽提纯化。 酚能变性蛋白质而且还能将变性的蛋白质 溶解在其中。（加入1/3体积的饱和NaCl溶液， 也可较好地祛除细胞降解物而纯化DNA，可以 避免酚的污染。） 人类基因组DNA提取的方法 从全血中提取 从口腔上皮脱落细胞，发根细 胞中提取 从胎儿的羊水细胞或者绒毛膜 细胞中提取（常用于产前诊断） 根据来源：根据来源： 人类基因组D

4、NA提取的方法 从全血中提取 细胞裂解液：裂解细胞膜，收集细胞核 SDS：破裂核膜 蛋白酶K：使核蛋白降解成小片段并从DNA上解 离下来 苯酚氯仿：抽提去除蛋白质 无水乙醇：沉淀DNA 75%乙醇：洗涤DNA沉淀 真空干燥后，溶解于TE(Tris(三羟甲基氨基甲 烷)+EDTA)中即得到高分量的DNA 人类基因组DNA提取的方法 从全血中提取 裂解 与与RNase/RNase/蛋白酶蛋白酶K K 消化消化 1.取100 l抗凝全血置于1.5ml Eppendorf离心 管中，再加入100 l裂解液和20 l RNaseA/蛋 白酶K液，用移液器来回吹打混匀，室于55温浴 35分钟，其间来回颠倒

5、离心管几次，直至溶液呈 水溶状。 2.加入10l 3M的NaAc(pH 4.8)，随后加入1250 l结合缓冲液，充分振荡混匀，12，000 rpm离 心30秒。 人类基因组DNA提取的方法 从全血中提取 裂解 DNADNA与吸附柱结合与吸附柱结合 3用移液器Tip转移上清并加入到离心吸附柱 （套好收集管）中，放置1分钟，12，000 rpm离 心30秒，倒掉收集管中的废液。 ! !注意注意! ! 待转移上清约1300l，离心吸附柱容量约650 l，故需每次转移上清650 l到离心吸附柱 中，离心，倒掉收集管中的废液，重复实验操 作步骤3。 人类基因组DNA提取的方法 从全血中提取 裂解 DN

6、ADNA的纯化的纯化 4. 再加入600 l洗涤缓冲液（washing buffer）到离心吸附柱（套好收集管）中，12， 000 rpm 离心30秒。 5重复步骤4一次，12，000 rpm 离心3分钟以 充分除去洗涤缓冲液。 6小心取出离心吸附柱，弃收集管，将离心吸 附柱套入一个干净的1.5ml Eppendorf 离心管， 并加入50 l洗脱缓冲液(elution buffer) 到 离心吸附柱中(洗脱缓冲液一定要加在离心吸附 柱的正中)，放置1分钟，于12，000 rpm 离心 30秒。 7取出Eppendorf 离心管，其中便是所提取基 因组NA。 人类基因组DNA提取的方法 从口腔

7、上皮脱落细胞中提取 裂解 与裂解液消化与裂解液消化 1、用舌头舔颊粘膜上颚、用牙刮颊部，嘬咀， 用分泌出的唾液反复漱口；将唾液吐到杯中。 用生理盐水洗涤，2000rpm离心10分钟，倒掉 上清液；重复1次。 2、沉淀中加1ml 1细胞核裂解液(STE)，打 散细胞团、混匀，再加酶解混合液（含350l STE、150l 10% SDS和10l 20mg/ml蛋白酶 K），摇匀，至出现粘稠透明状。37温箱过 夜或5034小时。 人类基因组DNA提取的方法 从口腔上皮脱落细胞中提取 裂解 离心除杂质离心除杂质 3、加等体积饱和酚（或1/3体积的饱和NaCl）， 轻摇混匀10分钟，室温2000rpm离

8、心10分钟， 去除蛋白和SDS的沉淀。 4、小心移上清至另一离心管（尽量避免吸取中 间层），加等体积氯仿混匀5分钟，室温 2000rpm离心5分钟。 5、重复步骤4一次。 人类基因组DNA提取的方法 从口腔上皮脱落细胞中提取 裂解 DNADNA的纯化的纯化 6、将上清移入另一离心管中，沿离心管壁向 DNA溶液中加入2.5倍体积的无水乙醇，轻轻摇 动离心管混和至体系完全均一，见白色絮状 DNA。用移液器吸头挑出DNA沉淀，在新配制 的70%乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将 DNA溶于20-100l TE中。 7、TE溶解的DNA，在4下可保存一年，如要 求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70

9、 保存。 人类基因组DNA提取的方法 酚、氯仿萃取法 酶学法 饱和盐析法 根据原理：根据原理： 人类基因组DNA提取的方法 酚、氯仿萃取法 苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提， 使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋 白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋 白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水， 不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进 行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺 利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在 时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后 有机溶剂在试

10、管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋 白质则沉淀于两相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的 蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA 溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在 NaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中 的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。 人类基因组DNA提取的方法 饱和盐析法 蛋白质在低盐浓度下的溶解度随盐液浓度升高而增加。球蛋 白当盐浓度不断上升时，蛋白质的溶解度又以不同程度下降 并先后析出（盐析）。这是由于蛋白质分子内和分子间的电 荷的极性基团有静电引力。当水中加入少量盐时，盐离子与 水分子对蛋白质分子一

11、的极性基团的影响，使蛋白质在水中 溶解度增大。但盐浓度增加一定程度时，水的活度降低，蛋 白质表面的电荷大量被中和，水化膜被破坏，于是蛋白质相 互聚集而沉淀析出。盐析法是根据不同蛋白质在一定浓度盐 溶液中溶解度降低程度不同达到彼此分离的方法。 人类基因组DNA提取的结果分析 聚合酶链式反应(PCR) 紫外分光光度法 琼脂糖凝胶电泳法 限制性内切酶酶切法 人类基因组DNA提取的结果分析 聚合酶链式反应(PCR) v PCR是利用DNA在体外摄氏95高温时变性会 变成单链，低温（经常是60C左右）时引物与单 链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚 合酶最适反应温度（72C左右），DNA聚合酶

12、沿 着磷酸到五碳糖(5-3)的方向合成互补链。基于聚合 酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性 温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。 人类基因组DNA提取的结果分析 聚合酶链式反应(PCR) 人类基因组DNA提取的结果分析 紫外分光光度法 v 提取得到的DNA的浓度和纯度都是未知的，在后续的DNA酶切、连 接及转化等实验中需要一定的浓度和纯度要求，因此要测定DNA的浓度 和纯度。 v 组成DNA的碱基均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收值在波长 为250270nm之间，腺嘌呤的最大紫外线吸收值在260.5nm，胞嘧啶 ：267nm，鸟嘌呤：276nm，胸腺嘧啶：264.5nm，

13、尿嘧啶：259nm。 这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后其最大吸收峰不会改变，但核酸的 最大吸收波长是260nm，吸收低谷在230nm。这个物理特性为测定核酸 溶液浓度提供了基础。在波长260nm紫外线下，10OD值的光密度相当 于双链DNA浓度为50g/ml，单链DNA或RNA为40g/ml；单链寡聚核苷 酸为20g/ml 人类基因组DNA提取的结果分析 紫外分光光度法 v分光光度法不但能够确定核酸的浓度，还可以通过测定在260nm和 280nm的紫外线吸收值的比值（A260/A280）估计核酸的纯度。DNA的 比值为1.8，RNA的比值为2.0。若DNA比值高于1.8，说明制剂中RNA尚 未

14、除尽。RNA、DNA溶液中含有酚和蛋白质将导致比值降低。270nm存 在高吸收表明有酚的干扰。当然也会出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶 液比值为1.8的情况，所以有必要结合凝胶电泳等方法鉴定有无RNA，或 用测定蛋白质的方法检测是否存在蛋白质。紫外分光光度法只用于测定 浓度大于0.25g/ml的核酸溶液。 人类基因组DNA提取的结果分析 限制性内切酶酶切法 限制性内切酶(RE)是由细菌自己产生的能识别双链DNA分子中 的特定碱基顺序，并以内切方式水解核酸中的磷酸二酯键的核 酸水解酶。它可分为三种类型：、和型，型酶就是通 常所指的RE，能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进 行切割。 同

15、一DNA用不同的限制酶进行切割，从而获得各种限制酶的切 割位点，由此建立的位点图谱有助于对DNA的结构进行分析。 限制性核酸内切酶分析技术是病原变异、毒株鉴别、分型及了 解基因结构和进行流行病学研究的有效方法，对动物检疫有很 重要的实用意义，尤其对区别进出境动物及动物产品携带病毒 是疫苗毒还是野毒，以及推论其是本地毒还是外来毒有很重要 的意义。 人类基因组DNA提取的结果分析 琼脂糖凝胶电泳法 琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。 琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一 种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下（pH8.0的缓冲液）带负电 荷，在电场中通

16、过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分 子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同。溴化乙锭（EB）可嵌 入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不 同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。 人类基因组DNA提取的应用 v1、人类基因组测序 v2、疾病基因的定位克隆 v3、多基因病的研究 人类基因组DNA提取的应用 v1、人类基因组测序 v1990年1998年，人类基因组序列已完成和 正在测序的共计约330Mb，占人基因组的 11%左右；已识别出人类疾病相关的基因200 个左右。此外，细菌、古细菌、支原体和酵 母等17种生物的全基因组的测序已经完成。 v1998

17、年9月14日美国国家人类基因组计划研 究所（NHGRI）和美国能源部基因组研究计 划的负责人在一次咨询会议上宣布，美国政 府资助的人类基因组计划将于2001年完成大 部分蛋白质编码区的测序，约占基因组的三 分之一，测序的差错率不超过万分之一。同 时还要完成一幅“工作草图”，至少覆盖基 因组的90%，差错率为百分之一。2003年完 成基因组测序，差错率为万分之一。这一时 间表显示，计划将比开始的目标提前两年完 成。 人类基因组DNA提取的应用 v2、疾病基因的定位克隆 v人类基因组计划的直接动因是要解决包括肿 瘤在内的人类疾病的分子遗传学问题。6000 多个单基因遗传病和多种大面积危害人类健 康的多基因遗传病的致病基因及相关基因， 代表了对人类基因中结构和功能完整性至关 重要的组成部分。所以，疾病基因的克隆在 HGP中占据着核心位置，也是计划实施以来 成果最显著的部分。 v在遗传和物理作图工作的带动下，疾病基因 的定位、克隆和鉴定研究已形成了，从表位 蛋白质基因的传统途径转向“反求遗传学” 或“定位克隆法”的全新思路。随着人类基因图 的完成，3000多个人类基因已被精确地定位 于染色体的各个区域。今后，一旦某个疾病 位点被定位，就可以从局部的基因图中遴选 出相关基因进行分析。这种被称为“定位候选 克隆”的策略，将大大提高发现疾病基因的效 率。 人类基因组DNA提取的应用 v3、多