完整word版)进出口燕窝及其制品中唾液酸含量的检测方法-检验检疫标准管理信息系统

1、进出口燕窝及其制品中唾液酸的测定方法编制说明1 任务来源 本检验方法标准的制定工作是按照国家认证认可监督管理委员会关于下达 2009 年度 出入境检验检疫行业标准制（修）订计划的通知下达的任务而进行的，广东局承担研究制 订检验检疫行业标准出口燕窝及其制品中唾液酸的测定方法任务，计划编号为 2009B488k。考虑到大部分燕窝及其制品来源于进口，本标准改为为进出口燕窝及其制品 中唾液酸的测定方法 。2 标准制定的意义 传统意义的燕窝是指金丝燕在人烟罕见的海岛悬崖峭壁上喂养育雏鸟而筑造的巢窝， 燕 窝是传统名贵滋补食品，主要产于东南亚国家和我国南海诸岛。据有关统计资料表明，我国目前是世界第一的燕窝

2、销售大国， 2008 年我国的燕窝销售 额达到 100多亿元。 因为物稀价贵， 特别是监督执法中缺乏有效的检验鉴别手段，导致市场上出现大量假冒伪劣产品， 极大的损害了消费者的利益， 扰乱了市场经济秩序。 为了从根本 上解决燕窝及其制品的真假鉴定难题， 确定燕窝及其制品中唾液酸的含量等一系列问题， 建 立燕窝的定性、定量检测方法是当前工作中的迫切需要。3 编制规则本标准遵循 GB/T 1.1-2000标准化工作导则 第 1 部分：标准 的结构和编写规则和 GB/T 20001.4-2001 标准编写规则 第 4 部分：化学分析方法的编写规则。4 标准编制依据和主要内容 本标准主要参考广东出入境检

3、验检疫局的非标燕窝及其制品中唾液酸含量的测定方法。本行标主要制定了燕窝及其制品的样品前处理方法，试样中唾液酸的测定方法，包括 二种测定方法：分光光度法与液相色谱-质谱 /质谱法，后者还可以对燕窝真假进行确证工作。5 燕窝基本信息5.1 燕窝的常见品种简介a. 以燕窝的形状区分为：燕盏，燕块（饼） ，燕条，燕丝，燕碎和燕球等；b. 以燕窝的颜色分为：白燕（又称官燕） ，黄燕，血燕三类；c. 以筑巢的习性分为：屋燕、 洞燕、毛燕、草燕四类。金丝燕筑巢在山洞里形成的燕窝， 俗称“洞燕” ，金丝燕筑巢在人工搭建的屋子里形成的燕窝，俗称“屋燕” 。5.2 燕窝制品的种类简介冰糖燕窝 （饮品 ） 、冰糖银

4、耳燕窝、冰糖雪蛤燕窝 、冰糖虫草燕窝、虫草燕窝 、冰糖人 参燕窝即食燕窝、胶原蛋白无糖燕窝饮品、浓缩燕窝（饮品 ） 、燕窝提取物和燕窝液等。5.3 唾液酸的简介 燕窝主要成分包括酸性蛋白等， 其特征物质是唾液酸糖蛋白。 唾液酸糖蛋白可以在一定 的酸性条件下水解出游离的 N- 乙酰神经氨酸单体，又名唾液酸。唾液酸 （sialic acid） 是一 类神经氨酸的衍生物， 广泛存在于多种生物组织中， 是构成细胞膜上糖蛋白和糖脂的重要成 分。在大部分哺乳动物组织中发现的唾液酸主要是N-乙酰神经氨酸。唾液酸又称燕窝酸，原因是其在燕窝中含量最高，是燕窝的主要活性成分 , 是智力发展催化剂。表 1 唾液酸的

5、信息CAS 编码131-48-6英文通用名称Sialic acid中文通用名称唾液酸英文化学名称5-Acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galactononulosonic acid中文化学名称5-乙酰氨基 -3, 5-二脱氧-D- 甘油-D-半乳壬酮糖理化性质分子式C11H19NO 9结构式分子量309.27性状描述纯唾液酸是无色的 ,易溶于水 , 在水溶液中不发生变旋作用。纯的聚唾液 酸是白色不定型高聚合物 , 在酸的作用下容易降解成单体的唾液酸。 聚唾 液酸水溶性优良 ,低黏度, 生物相容性好 ,具有生物可降解性。纯的 N-乙 酰神经氨酸和 N-羟乙酰神经

6、氨酸在水溶液中很稳定 , 4 时贮藏数月不 发生变化。如果溶液中含有非常微量的有机酸 , 其稳定性就受到很大的影 响。二乙酰和三乙酰神经氨酸不稳定 , 在常温下易变成 N-乙酰神经氨酸。作用唾液酸是一族神经氨酸的衍生物 ,广泛存在于多种生物组织中 , 是构成细胞膜上糖蛋白和糖脂的 重要成分 , 同时也是一种天然的大脑营养素 , 它能增强婴儿的记忆力和促进智力的发育。 N-乙酰神经氨酸 （ 唾液酸的一种 ） 对病毒从感染的宿主细胞中释放新复制的病毒颗粒具有重要的 作用。通过抑制 N-乙酰神经氨酸可以干扰和阻止病毒的复制 , 达到治疗流感的目的。6 检测方法与技术论证6.1 唾液酸标准曲线的制作标

7、准曲线：称取唾液酸标准品 2mg，溶解定容到 10mL，浓度为 200g/mL ，再逐级稀释到 100g/mL、50g/mL、20g/mL、10g/mL、 5g/mL。分别取 2mL，加入茚三酮指示剂（往 2.5 g茚三酮中加入 60 mL冰醋酸和 40mL盐酸，搅拌溶解） 2mL与冰醋酸 2mL，摇匀，在 100水浴 中显色 10min，取出试管在流动水中迅速冷却， 然后倒入 1cm 比色皿中， 在 470nm波长处测定 吸光度 OD。得出如下表 2数据结果。表 2 唾液酸标准溶液对应的吸光度浓度吸光度（g/mL ）（470nm）00.00050.0407100.1264200.197950

8、0.40831000.87142001.5857根据上述数据制作标准曲线（见图1），得出唾液酸标准溶液浓度 x 与吸光度 y 的关系式： y = 0.0081*x+0.026 ，相关系数 r=0.9986 ，线性关系良好。唾液酸系列浓度的吸光值00 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 溶液浓度图 1 唾液酸标准溶液浓度对应的吸光度关系图6.2 燕窝的前处理过程根据样品的状态分为 2 种前处理，即固态燕窝和液态的燕窝制品。6.2.1 固态燕窝的前处理过程 取有代表性的燕窝样品（同批燕窝的外观应没有明显差异，色泽、形态、大小等特征基本一致；如果存在明显差异，需充

9、分搅碎混合均匀）先经烘干，去除水分，冷却到室温后采 用研钵进行研磨， 注意剔除样品含有的杂毛杂草等， 然后过 100 目筛，筛下物即为制备好的 燕窝试样，为避免受潮，需尽快称量进行后续操作。6.2.2 液态燕窝制品的前处理过程液态燕窝制品通常是用玻璃瓶独立包装， 应取整瓶制样打浆均匀， 一般会产生泡沫， 需 静置一段时间等待分层，除去泡沫。当样液清晰可见时，取适量装入透析膜中，扎紧两端， 在自流水中透析 24 小时。透析的作用是采用透析膜（透析膜规格：允许分子量小于 10000 的物质透过，透析膜宽度在 2.5 厘米左右。 ）和自流水来除去燕窝制品中的冰糖等物质，因 为冰糖等糖类物质会影响后期

10、的水解、 吸光测定步骤， 冰糖等小分子物质会穿过透析膜进入 到含糖浓度低的自流水。 其中燕窝的有效成分因为分子量大于10000，而被保留在透析膜内。透析结束后，剪开膜袋，内容物装入洁净容器，即可进行后续操作（必要时冷藏放置） 。6.3 燕窝酸水解过程的选择及优化燕窝样品经过酸水解释放出唾液酸，所以酸水解是影响结果的重要步骤，如何选取合 适的水解条件是决定唾液酸是否释放完全的关键。 本标准实验重点对水解时间、 水解酸种类 和水解酸浓度进行了单因素实验，以期得到优化的水解条件。6.3.1 水解试剂的选择6.3.1.1 水解试剂种类的单因素实验 考虑到试剂的安全与适用性，本试验选取了三种水解试剂：水

11、、盐酸、醋酸。 样品：采用同一白燕盏样品进行对比试验。盐酸浓度： 10%、20%、30%。醋酸浓度： 10%、20% 、30%。水：蒸馏水。酸水解条件：称样品 0.12 g，加酸 20mL ，加沸石，在电热板上加热回流，水解 10 分钟。 不加酸水解：称样品 0.12 g，加水 20mL ，加沸石，在电热板上加热回流，水解 10 分钟。 将水解液转移定容到 100ml 容量瓶中， 取部分倒入离心管 （装有 1.2g 硫酸铵）中，3000rpm 离心 10min。分别取上清液 2mL ，加入茚三酮指示剂 2mL 与冰醋酸 2mL ，摇匀，在 100 水浴中显色 10min ，取出试管在流动水中迅

12、速冷却，然后倒入 1cm 比色皿中，在 470nm 波 长处测定吸光度 OD。所得实验数据见下表 3。表 3 不同水解试剂的对比结果水解试剂种类 及浓度称样量 g吸光度 OD470nm唾液酸含量%水解现象观察30%醋酸0.12021.32912.71水解液呈半透明白色30%盐酸0.12020.3012.89水解液呈酱黑色，并有黑色渣体20%醋酸0.12021.31712.59水解液呈半透明白色20%盐酸0.12020.2842.72水解液呈酱黑色，并有少量黑色渣体10%醋酸0.12031.24611.91水解液呈半透明白色10%盐酸0.12020.3523.37水解液呈酱黑色，并有少量黑色渣体

13、水0.12020.3483.33水解液呈半透明白色结论：盐酸比同浓度的醋酸水解所得唾液酸含量都低，并且颜色呈黑色，不利于观察与比色。水的水解结果也低于 20% 醋酸及 30%醋酸。说明盐酸和水的水解效果比醋酸差。在本 实验中，醋酸是理想的水解试剂。6.3.1.2 水解试剂浓度的单因素实验 在确定了水解试剂是醋酸后，应对其适宜的水解浓度进行单因素实验。醋酸浓度：5%、25%、50%、75% 、95%。水解条件：同上 6.3.1.1。对比结果见下表 4。 表 4 不同水解酸浓度的对比结果醋酸浓度%称样量 g吸光度 OD470nm唾液酸含量%现象观察50.12181.0589.98水解过程泡沫多25

14、0.12191.56814.79水解过程泡沫较多500.12161.50014.18无特殊现象750.12191.28712.14无特殊现象950.12181.0189. 61水解液粘稠）%（量含酸液图 2 不同醋酸浓度的对比结果结论： 25%和 50%的醋酸溶液水解得到的唾液酸含量最高，结果均大于10%，相差不多；5%和 95%的醋酸溶液水解得到的唾液酸含量最小。从水解现象观察来看，5%醋酸水解燕窝时三角瓶中产生丰富泡沫，多时会上冲到冷凝回流管中，会造成水解液流失。25%醋酸水解时也产生泡沫。 95%醋酸水解后产生的燕窝液体呈胶态粘稠，不易全部溶解于实验用水，定容 时产生损失。综合考虑， 5

15、0%醋酸水解是适宜的。6.3.2 水解时间的优化已确定 50%醋酸是适宜的水解试剂，再试验研究其适宜的水解时长。水解时间：5、）%（量含酸液图 3 不同水解时间对应的唾液酸含量 结论：随着水解时间的延长，唾液酸含量的变化不明显，唾液酸含量在 10 分钟时出现 了较高值。但是，时间长后得到的水解液颜色逐步变深，不利于比色。所以，适宜的水解时 长应是 10 分钟。6.4 公式结果的推导与表述 试样中唾液酸含量 x 的计算公式：ckm 10002）式中：X 试样中唾液酸含量，单位为克每百克（g/100g）；c 为标准曲线查得的样品唾液酸含量， g/mL ； k 稀释倍数； m 为试样质量，单位为克，

16、 g。当结果小于 1%时计算结果保留二位有效数字。当结果大于1%时，计算结果保留三位有效数字。经过测定，真品燕窝的唾液酸含量在10左右。不同试样燕窝的唾液酸含量范围如下：10、 15、20、25、30、35 min。水解条件：同上 6.3.1.1。对比结果见下表 5。表5不同水解时间的对比结果水解时间min称样量吸光度 OD唾液酸含量现象观察g470nm%50.12131.30312.35水解液呈白色透明100.12161.42813.5水解液呈白色透明150.12121.27212.06水解液呈白色透明200.12141.21611.51水解液呈微黄色250.12151.10710.47水解

17、液呈黄粉色300.12171.18611.20水解液呈黄粉色固体燕窝的含量普遍较高，在 0 10左右，液态燕窝的含量普遍较低，在00.5左右，但有些液态燕窝制品（包括即食燕窝、浓缩燕窝等）的浓稠度大，其唾液酸含量也较高。6.5 方法的线性范围和测定低限6.5.1 分光光度法的测定低限 唾液酸含量的检测低限应达到 1mg/kg 。 分光光度法的吸光度检测低限按 0.003，固体燕窝称样量为 0.1克，液态燕窝制品称样量为 510克，依据测定公式，固体燕窝的唾液酸含量的最低检测限为0.03%，液态燕窝的唾液酸含量的最低检测限为 3mg/kg （以液态燕窝制品称样量为 10克计）。6.5.2 分光光

18、度法的回收率 检测方法的回收率应达到 80-110% 。 本底样品：经过透析处理的冰糖燕窝，其唾液酸含量 6 mg/100g。 添加物： 因唾液酸标准品价格昂贵， 且添加回收试验所需唾液酸的量较大， 因此选用可 靠的燕窝对照品作为添加物，其唾液酸含量 12238 mg/100g 。4 组平行试验，回收率为 96%、 101%、104%、107%。具体数据见表 6。表 6 燕窝中唾液酸含量测定的回收试验试样编号试样名称称样量g加标量g吸光值OD唾液酸绝对含量 mg回收率%0冰糖燕窝本底7.701700.0380.461燕窝对照品0.12651.25415.482冰糖燕窝加标9.0201+0.05

19、090.5867.221073冰糖燕窝加标9.0208+0.05050.5707.041044冰糖燕窝加标9.0202+0.05070.5576.861015冰糖燕窝加标9.0204+0.05050.5306.49966.5.1 分光光度法的精密度6 组平行试验，测定方法完全一致，所得标准偏差0.34 。具体数据见表 7。表 7 燕窝中唾液酸含量测定的 6次平行试验编号称样量（ g）吸光度（ 470nm ）唾液酸含量（ %）10.12281.43414.4220.12271.43214.4130.12271.41114.240.12241.42014.3250.12281.36513.7260

20、.12271.35813.666.6 液相色谱质谱 / 质谱法测定的编制说明 针对燕窝进行真假鉴定时，可在分光光度法的分析基础上，再采用液相色谱质谱 /质 谱法来确证。6.6.1 样品前处理 将待确证燕窝按分光光度法进行试样前处理。所得离心上清液取出50L ，加入甲醇900L，混匀， 12000 rpm 离心 10min 。再取其上清液 50L，加入流动相 900L，混匀，过 滤，上机。6.6.2 液相色谱条件色谱柱： Therm o Hypersil Gold C18, 150 2.1mm, 3；或m其它同等性能的色谱柱。 柱 温： 40oC流动相：甲醇 + 5mMol/L 甲酸铵盐 = 4

21、+6 （v/v ）进样量： 5 L流 速： 200 L/min6.6.3 质谱条件a）离子源：电喷雾（ ESI）b）扫描方式： 负离子扫描c）检测方式：多反应监测模式（ MRM）d）雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气或其它合适气体；使用前应调 节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求，喷雾电压等电压值应优化至最佳灵敏度。e）监测离子对： m/z 308/87 ， 170 ， 262 ， 定量离子对： m/z 308/87 。6.6.4 液相色谱质谱 / 质谱法测定：定性测定 被测组分选择 1个母离子， 2个子离子， 在相同实验条件下， 样品中待测物质的保留时间 与标准溶液中对应的保留

22、时间偏差在 2.5%之内；且样品谱图中被测组分监测离子的相对丰 度与浓度接近的标准溶液谱图中对应的监测离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表2规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表 8 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度50% 20%至50%10%至20%10%允许的最大偏差20%25%30%50%6.6.5 液相色谱质谱 / 质谱法测定：定量测定 根据试样中被测物的含量情况， 选取响应值相近的标准工作液一起进行色谱分析。 标准 工作液和待测液的响应值应在仪器线性响应范围内。 对标准工作液和样液等体积参插进行测 定。在上述色谱条件下唾液酸标准溶液的质谱图见附录A中的图 A

23、1。6.6.6 液相色谱质谱 / 质谱法测定：空白试验 除不加试样外，均按上述步骤进行6.6.6 液相色谱质谱 / 质谱法的测定结果 试样中唾液酸含量 Xi 的计算公式，计算结果需扣除空白值 : cVXi k （ 3 ） m 10式中：Xi 试样中唾液酸含量，单位为克每百克（ g/100g）；C从标准工作曲线得到的唾液酸溶液浓度，单位为纳克每毫升，ng/mL；V样品溶液最终定容体积，单位为毫升，mL；k 稀释倍数； m样品溶液所代表最终试样的质量，单位为克，g。6.6.7 液相色谱 -质谱 /质谱法的测定低限 检测低限按 3 ng/mL ，液态燕窝制品称样量为 10克，依据测定公式，唾液酸含量

24、的最低 检测限为 0.001%， 10mg/Kg。6.7 验证情况6.7.1 分光光度法的验证情况就分光光度法， 我们请中国广州分析测试中心、 广州市质量监督检测研究院、 广州市赛特检 测有限公司参与了验证， 表 9 为我室检测结果、 表 10 12 为分别上述单位的验证结果， 根 据数据分析得出结论，方法没有显著性差异。共同的试验条件：燕窝样品在 105烘箱中烘干，冷却后研磨，过 100 目筛，称取 0.12-0.13g （ m）粉末到 三角瓶中，加入 50醋酸溶液 20ml，加热回流 10 分钟，冷却后，用水定容至 100ml。摇匀 后吸取 10ml 至离心瓶，加 1.2g 硫酸铵，溶解摇

25、匀， 3000 转离心 10min。取上清液 2ml 置于 10ml 比色管中，加入茚三酮指示剂 2ml 与冰醋酸 2ml ，摇匀，在 100水浴中反应 10min， 立即取出试管在流水中迅速冷却，用1cm 比色皿，在 470nm波长处测定吸光度 OD。按公式计算样品中唾液酸含量。表 9 我室对样品 A07002和08021的检测结果1 样品：白燕窝（编号 A07002）实验次数123456结果（ %）9.599.199.939.489.629.50平均值（ %）9.55RSD（%）2.512 样品：血燕（编号 08021 ）实验次数123456结果（ %）9.8010.0210.139.86

26、9.5010.29平均值（ %）9.93RSD（%）2.79表 10 中国广州分析测试中心对样品 A07002 和 08021 的检测结果1 样品：白燕窝（编号 A07002）实验次数123456结果（ %）9.028.898.598.939.219.08平均值（ %）8.95RSD（%）2.362 样品：血燕（编号 08021 ）实验次数123456结果（ %）9.649.109.209.569.669.17平均值（ %）9.39RSD（%）2.75表 11 广州市质量监督检测研究院对样品 A07002和 08021 的检测结果1 样品：白燕窝（编号 A07002）实验次数123456结果（

27、 %）9.399.209.129.6910.108.98平均值（ %）9.41RSD（%）4.432 样品：血燕（编号 08021 ）实验次数123456结果（ %）10.129.8910.379.5010.499.48平均值（ %）9.98RSD（%）4.30表 12 广州市赛特检测有限公司对样品A07002 和 08021 的检测结果1 样品：白燕窝（编号 A07002）实验次数123456结果（ %）9.209.599.019.898.898.90平均值（ %）9.25RSD（%）4.422 样品：血燕（编号 08021 ）实验次数123456结果（ %）9.299.4810.019.4

28、89.479.72平均值（ %）9.58RSD（%）2.646.7.2 液相色谱 -质谱 /质谱法就液相色谱 -质谱/质谱法， 我们请中国广州分析测试中心、 广州市质量监督检测研究院、 广州市赛特检测有限公司与了验证， 表 13 为我室检测结果、表 14 16 为分别中国广州分 析测试中心、 广州市质量监督检测研究院、 广州市赛特检测有限公司的验证结果， 根据数据 分析得出结论，方法没有显著性差异。共同的试验条件：1 液相色谱条件色谱柱： Thermo Hypersil Gold C18, 150 2.1mm, 3 m进样量： 5 L；流速： 200 L/min ； 流动相：甲醇 -5mMol

29、/L 甲酸铵盐 = 4+6 （ v/v ） 柱 温： 40oC2 质谱条件雾化气（ NEB ） 4.0 ；气帘气（ CUR ） 10.0 ；辅助加热气 7.0 L/min ；碰撞气（ CAD ） 6.0； 均为氮气。喷雾电压（ IS）-4250V ；去集簇电压 -42V ；辅助加热气温度（ TEM ） 530。 ESI-、MRM 方式检测。监测离子： m/z 308/87 ，170，262 ，（定量离子对） ，m/z 308/87 3 样品稀释：消化液以流动相稀释至合适浓度， 12000r/min 离心 5min，0.2 m 滤膜过滤后 上机。表 13 我室对样品 A07002 和 08021

30、 的检测结果1 样品：白燕窝（编号 A07002 ）实验次数123456结果（ %）9.7710.1010.189.859.249.47平均值（ %）9.77RSD（%）3.702 样品：血燕（编号 08021 ）实验次数123456结果（ %）10.249.689.919.759.510.08平均值（ %）9.86RSD（%）2.76表 14 广州市质量监督检测研究院对样品A07002 和 08021 的检测结果1 样品：白燕窝（编号 A07002 ）实验次数123456结果（ %）9.048.919.179.288.769.33平均值（ %）9.08RSD（%）2.432 样品：血燕（编号 08021 ）实验次数123456结果（ %）9.459.278.999.068.829.55平均值（ %）9.19RSD（%）3.07表 15 中国广州分析测试中心对样品 A07002 和 08021 的检测结果1 样品：白燕窝（编号 A07002 ）实验次数123456结果（ %）8.769.339.5