实验操作步骤整理

1、免疫组化1. 切片常规脱蜡至水化:烧片 80oC， 1h； 松节油 I 20min， II 15min； 100%乙醇 I 8min， II 5min； 95%乙醇 I 5min ， II 5min ； 75%乙醇 I 5min ， II 5min ； 蒸馏水 5 min x3;PBS 5min x1.2. 失活内源性过氧化物酶3% H2O2 37oC 20min;PBS 5min x3；甩干。3. 抗原修复A 9ml+B 41ml+450ml 水（柠檬酸缓冲液） 400ml （360 水+40） 或： Tris-EDTA 修复水浴 98oC 15min； 室温冷却；PBS 5min x3 甩

2、干4. 血清封闭37oC 30min ； 甩干，不洗。5抗（1:200稀释）4oC过夜（或室温2-3h）,对照加PBS （稀释比例，来源） 6.PBS 5min x4；二抗 37oC 30min；PBS 5min x37.SABC染 色990ul PBS +10ul SABC37oC 30mi n.SABC稀释 100 倍；或三抗孵育8.DAB染色1滴A摇匀，加1滴B和1滴C后摇匀，室温1-2min。A:浓缩缓冲液； B: DAB; C: H2O2配好后遮光， 30min 内使用，剩余弃去。1ml 水中加 水：双蒸水； 现配现用，9复染浸于苏木素中 1min盐酸酒精（ 1ml HCl， 100

3、ml 95%酒精）几秒钟清水冲洗， 清水冲洗， 返蓝：清水冲洗 10min 。10. 脱水75%酒精 1min ；85% 1min；95% 1min；100% 4min。11. 晾干后封片，标记，观察，截图，分析。常用单位换算1M=1mol/L;1uM=1umol/L;5%琼脂溶液：称取5g琼脂粉溶于100ml生理盐水。5%为质量分数单位，以1L水为1Kg算, 则 5g 每 100g 即 5g 每 100ml 。免疫印迹常用抗原分子量GAPDH 36KDaRNA提取 准备试剂：氯仿，异丙醇，1. 样品处理1 ）样品处理：取新鲜或 品体积一般不要超过积的IGF 95KDaRNAse-free-d

4、dw（DEPC水）,75%乙醇（ddw 配制）。-70 C冻存组织，每 30-50mg组织加入1ml TRNzol-A匀浆处理，样 10%；2）单层培养细胞：移出培养基，PBS冲洗，加入TRNzoI-A解细胞，每10cm2面积加入1ml TRNzol-A+;2. 将匀浆或裂解细胞在15-30 C放置5min，轻轻吹打，使核酸蛋白复合物完全分离；3. 4C, 1400rpm 离心，10min，取上清置-80C冻存；4. 每1mlTRNzol-A+对应至少0.2ml氯仿，盖好瓶盖，剧烈震荡15s,室温放置3min ;5. 4C, 1400rpm离心，10min，样品会分为三层：黄色有机相，中间层和

5、上层无色水相；RNA主要在水相中，把水相（约500ul）转移到新管中。在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置 20-30min；6. 4C, 1400rpm离心，10min，去上清，离心后 RNA位于管壁一侧底部形成胶水样沉淀；7. 加入1ml75%乙醇（DEPC水配制）洗涤沉淀。1ml TRNzol-A+对应1ml75%乙醇；8. 4 C, 1400rpm, 10min,倾出液体，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要 吸到沉淀；RNA。9. 室温倒置EP管晾干，加入50UIDDW，反复吹打，混匀，充分溶解Western blot 分离胶: 下层分离胶10ml :dH2

6、OArc-bis(30%)4xTris-SDD( PH 8.8)AP (10%)TEMED8%4.73ml2.68ml2.5ml100ul4ul10%4.1ml3.3ml2.5ml100ul4ul12%3.4ml4.0ml2.5ml100ul4ul15%2.4ml5.0ml2.5ml100ul4ul上层浓缩胶5ml:dH2OArc-bis(30%)4xTris-SDD( PH 6.8)AP (10%)TEMED4%3.04ml0.67ml1.25ml40ul5ul5%2.865ml0.83ml1.25ml50ul5ul厚板是上述的1.5倍:下层分离胶15ml :dH2OArc-bis(30%)

7、4xTris-SDD( PH 8.8)AP (10%)TEMED8%7.095ml4.02ml3.75ml150ul6ul上层浓缩胶7.5ml :dH2OArc-bis(30%)4xTris-SDD( PH 6.8)AP (10%)TEMED4%4.56ml1.005ml1.875ml60ul7.5ulRunning Bufer(10x, 1L)Tris-base30.3gGlyci ne144gSDS10g加入DDW补齐到1L。小分子( 180) Trans Buffer(1x, 500ml)Tris-base1.5gGlyci ne7.2gSDS0.1g甲醇100ml加入DDW补齐到500

8、ml。大分子( 180) Trans Bufer(1x, 600ml)Tris-base1.8gGlyci ne8.64gSDS0.12g甲醇120ml加入DDW补齐到600ml。PBS配方1L (细胞室用)：KH2 PQ0.2g(无水)Na2H PQ - 12H2O3.49gNaCl8gKCL0.2g加入DDW补齐到1L,滤过。PBS Buffer 1LPH7.67.47.27.0NaCl(g)8.58.58.58.5Na2 HP O4(g)2.22.22.22.2NaH2 PO4(g)0.10.20.30.4加入DDW补齐到1L。TBS (10x, 1L)NaCl87.66gTris12.

9、11g加水补齐到1L。稀释用 TBST( 1x, 1L)TBS 10x100ml纯水900mlTwee n2mlBSA Buffer 5%:TBST/ PBS50mlBSA2.5gNaN3 (防腐)0.01g加入50ml的大离心管中溶解，以后分装使用。NaN3 浓度：0.02% (g/ml).一抗:BSA Buffer8ml抗体8ul1:1000配制，加入12ml的小离心管中。GAPDH 1:20000 配制。5%脱脂奶粉（质量体积比， 即5g溶于100mlTBST中）2.5g; 50mlRb/MS抗体2ul二抗:1:25000或1:30000稀释配制，加入50ml的大离心管中溶解。稳定 tr

10、ansfection带GFP的报告质粒luciferase报告质粒G418筛选1. 预实验G418浓度；2. 预实验及转染后消化铺板的密度相近；3. 正式实验过夜，加入 G418，大量死亡很正常；4. 有限稀释法，12小时后观察可能出现单个细胞的孔，标记；5. 2-3天对标记的孔要格外关注；6. 10天，将长的足够大的单右要小心消化下来，至24孔放大。免疫共沉淀1. 种板，6孔板，3.5皿，80-90%，处理；2. 倾去培养基，预冷3. 力口 500ml IP Buffer4. 离心 1000r/5min5. 取上清200ul至新PBS冲洗两遍；（提前加蛋白酶抑制剂），冰上裂解15min，使刮

11、刀; （4 C最好）;EP管中，剩余冻存；6. 200ul+1ug 抗，4 C孵育 2-4h;7. 加珠子7ul, 4C,孵育过夜。次日8. 离心3000r/3min，小心倾去上清，用PBS洗3次（避免剧烈震荡）9. 10-30ul 上样缓冲液（2.5x, 20ul）。转染 transfection电击法，磷酸钙法，脂质体法，病毒介导法真核细胞由于外源 DNA掺入而获得新的遗传标志的过程1. 瞬时转染，不整合，高水平表达，仅数天，多用于启动子和调控元件的分析，超螺旋DNA。2. 稳定转染，整合，低水平，持久，线性DNA。MTT分析法吸光度以活细胞代谢物还原剂的染料，作用于活细胞线粒体中的呼吸链

12、,0-0.7之间，否则不是直线关系MTT噻唑蓝为基础，MTT为黄色化合物，是种可以接受氢离子 在琥珀酸脱氢酶和细胞色素c的作用下四唑环开50%的N,N-二甲基酰胺和 20%490nm处的光度值OD值，以裂，生成蓝色的 formazan（甲瓒）结晶，其生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸 脱氢酶消失，不能将 MTT还原）。formazan结晶可溶解于含 的十二甲基磺酸钠（pH4.7）的MTT或DMSO,用酶标仪测定 反映出活细胞的数目。步骤：1000-10000个细胞接种到 961. 接种细胞：用含10%FBS培养基配成单个细胞悬液，以每孔 孔板，每孔体积200ul ；2. 培养细胞：同一

13、般培养条件，培养 3-5天（根据实验目的和要求定）3. 呈色：培养之后，每孔加 DMSO 200UI,震荡10min，使结晶充分溶解4. 比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光的值。Tran swell1. Tran swell小室制备无基质胶Tran swell小室制备。1）包被基质膜；2）水化基质膜。有基质胶Tran swell小室制备。2. 制备细胞悬液无血清培养基饥饿12-24h，去除血清的影响；消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1-2遍，用含BSA的无血清培养基重悬，调整密度至1-10X105;3. 接种细胞取细胞悬液100-200UI加入小室；下室加50

14、0ul含FBS或趋化因子的培养基；培养细胞；4. 结果统计直接计数：贴壁细胞计数，非贴壁细胞计数；间接技术：用于穿过细胞过多时。基因敲除siRNA（small interfering RNA,小分子干扰 RNA片段）：双链RNA经酶切后会形成很多小片段, 其一旦与mRNA中的同源序列互补结合， 会导致mRNA失去功能，即不能翻译产生蛋白质， 也就是基因沉默。厂RNA病毒感染：病毒被清除。RNAi（RNA interferenee）:双链RNA对基因的表达的阻断作用。 siRNA的作用：外源双链RNA 转座子的转录产物：转座子的表达被阻断。J外源导入基因：外源导入基因被阻断。1. 起始阶段Dicer酶：是RNase III家族中特意识别双链 RNA的一员，以ATP依赖方式逐步切割双链