质粒特性 第四章 基因克隆的质粒载体[优选材料]

1、第四章 基因克隆的质粒载体在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col质粒。F质粒 又叫F因子或性质粒（sex plasmid）。它们能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。R质粒 通称抗药性因子。它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。Col质粒 即所谓产生大肠杆菌素因子。它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。第一节 质粒的一般生物学特性一质粒

2、DNA细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份。绝大多数的质粒都是由环形双DNA组成的复制子（图4-1）。质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状，但在一定的条件下又可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：1当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型；2如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA（ocDNA），此即OC构型；3若质粒DNA经过适当的核酸内

3、切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线性分子（IDNA），通称L构型（见图4-2）。在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，仍具有不同的电泳迁移就绪。其中走在最前沿的是SCDNA，其后依次是L DNA和OC DNA（图4-3）。凡经改建而适于作为基因克隆载体的所有质粒DNA分子，都必定包括如下三种共同的组成部分，即复制基因（replicator）、选择性记和克隆位点。二质粒DNA编码的表型质粒DNA仅占细胞染色体组的1%3%左右，但却编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。其中对抗菌素的抗性最质粒的最重要的编码特性之一。三质粒DNA的转移（1）质粒的类型格兰氏阴性细菌的质

4、粒可以分成接合型和非接合型的两种类群。接合型的质粒（conjugative plasmid），又叫自我转移的质粒。它们除了具有自主复制所必须的遗传信息之外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。非接合型的质粒（non-conjugative plasmid），亦叫不能自我转移的质粒。它们虽然具有自主复制的遗传信息，但失去了控制细胞配骊和接合转移的基因，因此是不能够从一个细胞自我转移到另一个细胞。（2）F质粒又叫F因子，即致育因子（fertility factor）的简称，是在某些大肠杆菌细胞中发现的一种最有代表性的单拷贝的接合型质粒。F质粒有三种不同的存在方式：（i）F+细胞：以染色体外

5、环形双链质粒DNA形式存在，其上不带有任何来自寄主染色体的基因或DNA区段。（ii）F细胞：以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，同时在其上还携带着细菌的染色体基因或DN区段。（iii）Hfr细胞（高频重组细胞）：以线性DNA形式从不同位点整合到寄主染色体。F因子是雄性决定因子，所以F+细胞又叫雄性细胞，与此相应的F-细胞则叫做雌性细胞。F+细胞的表面可以形成一种叫做性须（pilus）的结构，它促进雄性细胞同雌性细胞进行配对。在合适的条件下，将雄性细胞和雌性细胞混合培养，由于性须的作用，就会形成雌-雄细胞配对。我们称这种过种为细菌的接合作用（conjugation）。配对之后F-受体细胞获得了

6、F因子，也变成为F+细胞。由F因子整合到染色体而成的Hfr细胞，就可能相发寄主染色体发生高频转移。这是一种可逆的过程，在一定的条件下，Hfr细胞又可重新变参展F+或F细胞。质粒的主要类型见表4-1。（3）质粒DNA的接合转移细胞交配对的形成 雄性细胞的性须顶端与受体细胞表面接触之后，便会迅速收缩，把给体细胞与受体细胞拉在一起。因此，性须在确立配对细胞表面间的紧密接触方面，起着至关重要的作用。但是，大肠杆菌雄性细胞是不会同其它的亦带有F质粒的细胞发生配对作用的，因为traS和traT编码的“表面排斥”蛋白质，使此种细胞无法成为接合作用的受体。这就决定了雄性细胞只能同不具F因子的雌性细胞配对的特异

7、性。质粒DNA的转移 F质粒DNA的转移是从转移起点oriT开始的。当细胞交配对建立之后，TraY和TraI蛋白质首先在oriT位点作单链切割，随后缺口链在其游离的5-端的引导下转移到受体细胞，并作为模板合成互补链，形成新的质粒分子。于是受体细胞便转变成为具有F因子的雄性细胞如图4-4。四质粒DNA的迁移作用非接合型的质粒，由于分子小，不足以编码全部转移体系所需要的基因，因而不能够自多转移。但如果在其寄主细胞中存在着一种接合型的质粒，那么它们通常也是可以被转移的。这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫做质粒的迁移作用（mobilization）。ColE1是一种可以迁移但是属于

8、非接合型的质粒。需要质粒自己编码的两种基因参与。一个是位于ColE1 DNA上的特异位点bom；另一个是ColE1质粒特有的弥散的基因产物，即mob基因（mobilization gene）编码的核酸酶。mob基因和bom基因参与ColE1质粒的迁移作用这个结论，是根据图4-5的实验结果作出的。相容性的两种质粒F和ColE1共存于同一细菌细胞中，F质粒可以为ColE1质粒提供经所缺乏的结合功能，这样使得ColE1质粒也能够发生转移作用。图4-5（a）表示位于F-细胞中的ColE1质粒的状，它的mob基因进行了转录，其产物使bom位点发生单链断裂而出现缺口，于是ColE1 DNA 便从超盘旋的的

9、结构转变成为缺口环状的构型。但ColE1质粒缺乏形成性须的能力，无力进行结合配对，所以它的DNA也就不能从一个细胞转移到另一个细胞。正是由于不能够发生转移，这种从超盘旋到缺口环状的构型转变过程，就有可能被回复，所以就出现这两种构型之间的平衡状态。图4-5（b）中的细胞同时含有F和ColE1两种质粒。F因子能够导致性须的合成，为其DNA转移提供了转移装置，因此ColE1可以被转移。而在F质粒提供的这种转移装置被分离掉的情况下，ColE1的mob-突变体便不能够转移。遗传分析证明，mob-突变是隐性的，mob基因编码一种蛋白质。而且当这种突变体质粒被分离出来时，并不是以松弛复合物的形式存在。图4-

10、5（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。图4-5（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不能发生缺口，因此仍然不能够转移。五质粒DNA的复制类型根据寄主细胞所含的拷贝数的多少，可将质粒分成两种不同的复制型：一种是低拷贝数的质粒，每个寄主细胞中仅含有13份的拷贝，我们称这类质粒为“严紧型”复制控制的质粒（stringent plasmid）；另一类是高拷贝数的质粒，每个寄主细胞中可高达1060份拷贝，这类质粒被称为“

11、松弛型”复制控制的质粒（relaxed plasmid）。质粒拷贝数,是指生长在标准的培养基条件下，每个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。表4-3列举了若干种通用的质粒复制基因的特性。表4-2列举了若干种通用质粒复制基因的特性。六质粒的不亲和性（1）质粒的不亲和性现象所谓质粒的不亲和性（plasmid incompatibility），有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖过程中，其中必有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质粒称为不亲和质粒（图4-6）。不亲和群（incompatibili

12、ty group），指具有亲缘关系，但彼此之间是互不相容的质粒。（2）质粒不亲和性的分子基础质粒不亲和性的分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。大多数质粒都会产生出一种控制质粒复制的阻遏蛋白质，其浓度是与质粒的拷贝数成正比的。阻遏蛋白质通过同其靶序列间的相互作用，使双链DNA中的一条链断裂，从而导致质粒DNA复制的启动，并建立起一种调节质粒拷贝数的负反馈环（negative feedback loop）。当质粒面临高拷贝数和高浓度的阻遏蛋白质时，其复制法动便被抑制了；而当质粒处于低拷贝和低浓度遏蛋白质的条条件下，它的复制反应便会继续进行。由于每一种质粒的复制速率拷贝数控制，都

13、是由一对不相容质粒产生的阻遏蛋白质总浓度联合调控的，这种交叉抑制的结果，使细胞中质粒拷贝数，比其单独感染状态下的正常拷贝数减少许多。如何阅读分析质粒图谱载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素1. 复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。2. 抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+3. 多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段4. P/E 启动子/增强子5. Terms 终止信号6. 加poly(A)信号 可以起到稳定mRNA作用如何阅读质粒图

14、谱第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒)所谓穿梭质粒是指一类人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可以在两种不同类群宿主中存活和复制的质粒载体。此概念不仅用于不同的微生物菌群之间，也可以推广到真核生物表达载体的构建，如用于枯草的pBE2、酵母的pPIC9K、哺乳动物表达载体pMT2 和用于植物细胞的Ti 质粒。这些穿梭质粒不仅可以在大肠杆菌中复制扩增，也可以在相应的枯草、酵母、动物或植物细胞中扩增和表达。这样利于对质粒的分子生物学操作和大量制备。第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。1. Ampr 水解-内酰胺环，解除氨苄的毒性。2. tetr

15、 可以阻止四环素进入细胞。3. camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。4. neor(kanr) 氨基糖苷磷酸转移酶 使G418(长那霉素衍生物)失活5. hygr 使潮霉素失活。第三步：看多克隆位点(MCS)。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。第五步：是否含有表达系统元件，即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转

16、录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号1. 启动子-促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。2. 增强子/沉默子-为真核基因组(包括真核病毒基因组)中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子-负增强子，负调控序列。3. 核糖体结合位点/起始密码/SD序列(Rbs/AGU/SDs)：mRNA有核糖体 4. 转录终止顺序(