第二章 蛋白质

1、第二章 蛋白质 (protein),第一节 蛋白质概论 第二节 蛋白质的组成单位 氨基酸 第三节 肽 第四节 蛋白质的结构及其与功能的关系 第五节 蛋白质的性质 第六节 蛋白质分离、分析技术,1.1 什么是蛋白质?,蛋白质(protein)是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的一条或多条肽链组成的高分子含氮生物大分子。,一、蛋白质的定义及其功能,第一节 蛋白质概论,1. 分布广 所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。 2. 含量高 蛋白质占人体干重的45，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80。 3. 种类多 人体中蛋白

2、质种类达十万余种，每种蛋白质都有其特定的结构与功能。,1.2 蛋白质在生物体内的分布特征,生命是蛋白质的天地，没有蛋白质就没有生命!,一个细胞中约含有104种蛋白质，分子的数量达1011个,防御功能,调节功能,运动功能,结构功能,催化功能,信息传递,贮存功能,遗传调控,运输功能,1.3 蛋白质的生物学功能,二、蛋白质的元素组成,主要有c、h、o、n和s。 有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘 。,(一)组成蛋白质的元素,各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16。,由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大

3、致含量：,100克样品中蛋白质的含量 ( g % ) = 每克样品含氮克数 6.25100,蛋白质系数,(二)、蛋白质元素组成的特点,蛋白质含量测定 凯氏定氮法,测定的是总蛋白(可溶性蛋白和不可溶性蛋白)含量。 不能区分蛋白氮和非蛋白有机氮。,不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同，一般蛋白质含氮量为16%， 6.25为16%的倒数。 一份氮素相当于6.25份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质系数。 不同种类食品的蛋白质系数有所不同，计算时需校正。如玉米，荞麦，青豆，鸡蛋等为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70，

4、牛乳及其制品为6.38。,6.25蛋白质系数,三聚氰胺（英文名melamine），是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，重要的氮杂环有机化工原料。简称三胺，又叫2 ,4 ,6- 三氨基-1,3,5-三嗪、蜜胺、氰尿酰胺、三聚氰酰胺，分子式c3n6h6、c3n3(nh2)3，分子量126.12，含氮量66.7%。,奶粉-三聚氰胺事件,也被称为“蛋白精”,目前三聚氰胺被认为毒性轻微，大鼠口服的半数致死量大于3克/公斤体重。 据1945年的一个实验报道：将大剂量的三聚氰胺饲喂给大鼠、兔和狗后没有观察到明显的中毒现象。 动物长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。,

5、三聚氰胺作为一种白色结晶粉末，没有什么气味和味道，掺杂后不易被发现。 三聚氰胺其分子中含有大量氮元素。蛋白质含氮量一般不超过30%，而三聚氰胺的分子式含氮量为66左右。 通用的蛋白质测试方法“凯氏定氮法”是通过测出含氮量来估算蛋白质含量，根本不会区分这种伪蛋白氮。因此，添加三聚氰胺会使得食品的蛋白质测试含量偏高，从而使劣质食品通过食品检验机构的测试。 有人估算在植物蛋白粉和饲料中使测试蛋白质含量增加一个百分点，用三聚氰胺的花费只有真实蛋白原料的1/5。,被不法商人用作食品添加剂，以提升食品检测中的蛋白质含量指标,三、蛋白质的分类,(一) 根据蛋白质组成成分,1.单纯（简单）蛋白质,2.结合蛋白

6、质 = 蛋白质部分 + 非蛋白质部分,(三)根据蛋白质的功能,纤维状蛋白质,不溶性(硬蛋白),可溶性,角蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白等,肌球蛋白和纤维蛋白原等,外形呈纤维状或细棒状， 分子轴比(长轴短轴)大 于1(小于10的为球蛋白),1. 酶类, 占细胞内蛋白质种类的绝大部分 2. 运输蛋白, 如albumin, hemoglobin, transferrin等 3. 收缩运动蛋白, 如actin, myosin, tubulin等 4. 激素蛋白, 如insulin, growth hormone等 5. 细胞因子(cytokinin), 如egf, pdgf, il-2等 6. 受体蛋白,

7、如insulin receptor, rhodopsin等 7. 毒素蛋白, 如cholera toxin, ricin, pertussis等 8. 营养贮藏蛋白, 如protamine, glutelin等 9. 防御蛋白, 如igg等 10.结构蛋白, 如keratin, collagen等,按功能的蛋白质分类法,i. 按理化性质分: (英国physiological society, 1907) 1. 单纯蛋白 (simple protein) 1). albumin (白/清蛋白） 溶于水、盐、酸、碱溶液, 加热凝固 (血清) 2). globulin (球蛋白） 溶于盐、酸、碱溶液

8、, 加热凝固 (血清) 3). glutelin (谷蛋白） 溶于酸、碱溶液 (谷种，不溶于水和稀盐) 4). prolamine (醇溶谷蛋白）溶于70-90%酒精、酸、碱溶液 (谷种) 5). scleroprotein (硬蛋白） 不溶 (毛、发、爪、皮肤) 6). histone (组蛋白） 溶于水、酸溶液 (细胞核) 7). protamine （鱼精蛋白） 溶于水、酸溶液 (精子) 2. 结合蛋白 (conjugated protein) 1). nucleoprotein (核蛋白） 含戊糖或脱氧戊糖 (细胞核) 2). phosphoprotein (磷蛋白）含有磷酸 (以酯的

9、形式) (动物细胞、体液) 3). lipoprotein (脂蛋白) 含脂质 (动植物细胞) 4). chromoprotein (色蛋白） 含带fe、cu等的有机色素 (动植物细胞) 5). glycoprotein (糖蛋白） 含糖及其衍生物 (动植物细胞),蛋白质的经典分类法,蛋白质的经典分类法（2）,3. 衍生蛋白质 (derived protein) i). primary protein derivatives 天然蛋白质经少量变性后的产物 1). gelatin (明胶） 胶原蛋白(collagen)加酸水解产物 2). protean 水溶性蛋白质经水、酶、稀酸作用而不溶化

10、3). metaprotein (变性蛋白质） 经稀酸、稀碱变性后的蛋白质 4). coagulated protein (凝固蛋白质） 机械搅拌, 加酒精后形成的不溶物 ii). secondary protein derivatives 进一步分解后的变性蛋白质 1). primary proteose (初生蛋白胅）溶于水, 加热不凝固, 易盐析 2). secondary proteose 溶于水, 加热不凝固, 难盐析 3). peptone (蛋白胨） 溶于水, 加热不凝固, 不能盐析 4). peptide 氨基酸的组成和序列一定的小分子,对蛋白质化学有突出贡献的nobel奖获得

11、者,1902年 h. e. fischer (德，化) 肽键理论，多肽合成 1910年 a.kossel (德，医) 组氨酸、组蛋白的发现，碱基的发现 1915年 w.h.bragg/w.l.bragg (德，物） 用x射线测定晶体物质结构 1926年 t.svedberg (瑞，化) 用超离心手段决定蛋白质的分子量 1946年 j.b.summer (美，化) 蛋白质酶的结晶，证明酶的本质为蛋白质 1948年 a.w.k.tiselius (瑞，化) 电泳装置的开发，血清蛋白的研究 1952年 a.j.p.martin/r.l.m.synge (英，化分配层析发明，氨基酸的分离 1954年

12、l.pauling (美，化) 蛋白质二级结构，抗原抗体反应理论 1958年 f.sanger (英，化) 胰岛素一级结构的测定 1962年 m.f.perutz/j.c.kendrew (英，化) x射线确定蛋白质的立体结构 1972年 g.m.edelman/r.r.porter (美，医抗体的化学构造与功能的解明 1972年 w.h.stein/s.more (美，化) rnase的一级结构和活性中心的解明 1972年 c.b.anfinsen (美，化) 蛋白质的一级结构决定其立体结构 1998年 s.b.prusiner (美，医) prion:蛋白立体结构的变化导致疾病,第二节 蛋

13、白质的组成单位 氨基酸,一、蛋白质的水解,蛋白质和多肽的肽键可被催化水解 酸/碱能将蛋白完全水解 酶水解一般是部分水解,得到各种aa的混合物,得到多肽片段和aa的混合物,氨基酸是蛋白质的基本结构单元,蛋白质月示胨多肽肽aa 1*104 5*103 2*103 1000 200 100 -500,酸水解：色氨酸破坏，天冬酰胺、谷胺酰胺脱酰胺基 碱水解：消旋，色氨酸稳定 酶水解：水解位点特异，用于一级结构分析，肽谱,二、蛋白质的基本单位氨基酸,存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的编码氨基酸仅有20种，且均属 l-氨基酸（甘氨酸除外）。,2.1 氨基酸的结构特点,2.1 氨基酸的结构

14、特点：,侧链（r基团）不同，理化性质不同,羧酸分子中-碳原子上的一个氢原子被氨基取代,氨基酸的 结构通式,除过甘氨酸外，其他氨基酸中的碳 都为不对称的碳原子，构成了氨基 酸的两种构型，即l-氨基酸和d-氨 基酸。组成人体蛋白质的氨基酸均 l-氨基酸。,与羧基相连的碳原子都有 个氨基，因而称为氨基酸,分 类 依 据,-c-c-c-c-cooh -c-c-c-c(nh2)-cooh -氨基酸 -c-c-c(nh2)-c-cooh -氨基酸 -c-c(nh2)-c-c-cooh -氨基酸,什么是-氨基酸？,l-型和d-型的由来 甘油醛的旋光性,左旋甘油醛的构型,右旋甘油醛的构型,按原子排列次序法确定

15、了l-型和d-型氨基酸，以甘油酸构型为参考，氨基在- 碳原子左侧者为l-型，右侧者为d-型。,l-和d-并不代表aa的旋光性，只代表绝对构型。 为了正确表示左旋和右旋，采用（）和（）的符号，（）代表右旋，（）代表左旋。 物质的旋光性与手性原子上的构型没有确定的关系。,右旋d-型甘油醛,左旋d 型乳酸,2.2 氨基酸的分类,1. 基本氨基酸（编码蛋白质的氨基酸）：组成蛋白质，20种; 2. 稀有氨基酸：是多肽合成后由基本aa经酶促修饰而来; 3.非蛋白质氨基酸：存在于生物体内但不组成蛋白质 (约150种)。,(1) 按照r基的化学结构分类 r为脂肪烃基的氨基酸（5种）,1. 基本氨基酸(20种)

16、的分类,含一氨基一羧基的中性氨基酸,借 一 两 饼 干 异 亮 丙 甘,r基均为中性烷基，r基对分子酸碱性影响很小， 它们几乎有相同的等电点(6 .00.03)； gly不含手性碳原子的氨基酸，不具旋光性 ; 从gly至ile，r基团疏水性增加。, r为脂肪烃基的氨基酸（5种）,r中含有羟基和硫的氨基酸（共4种）,羟基氨基酸,含硫氨基酸,不解离,巯基,ser的-ch2oh基（pka=15）在生理条件下不解离，在大多数酶的活性中心都发现有ser残基存在。 ser和thr的-oh往往与糖链相连，形成糖蛋白。 cys的r中含巯基（-sh）， 具有两个重要性质： （1）在较高ph值条件，巯基离解。 （

17、2）两个cys的巯基氧化生成二硫键，生成胱氨酸。 met在生物合成中是一种重要的甲基供体。,r中含有羟基和硫的氨基酸（共4种）, r中含有酰胺基团的氨基酸（2种）,酰胺基中氨基易发生氨基转移反应,含酰胺基氨基酸, r中含有酸性基团的氨基酸（2种）,asp侧链羧基pka=3.86； glu侧链羧基pka=4.25 ； 它们是在生理条件下带有负电荷的唯有的两个氨基酸；,r中含碱性基团的氨基酸（3种）,碱性氨基酸,lys侧链氨基的pka为10.53, 生理条件下, lys侧链带有一个正电荷（-nh3+）, 侧链的氨基反应活性增大。 arg是碱性最强的氨基酸, 侧链上的胍基是已知碱性最强的有机碱, p

18、ka值为12.48, 生理条件下完全质子化。,pro的-亚氨基是环的一部分，因此具有特殊的刚性结构。 pro残基一般出现在两段-螺旋之间的转角处，pro残基所在的位置必然发生骨架方向的变化。,含亚氨基,在280nm处，trp吸收最强，tyr次之，phe最弱；, r为芳香烃的氨基酸（3种）,his是 pka 值最接近生理ph值的一种 (游离氨基酸中为6.00, 在多肽链中为7.35 ), 是在生理 ph 条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸； his在酶的酸碱催化机制中起重要作用。, r基中含杂环的氨基酸（1种）,(2)按照r基(侧链)的极性性质(疏水性程度)可以分为4类：,非极性侧链氨基酸(8种)

19、水溶性小。其侧链为非极性疏水基团。 极性中性侧链氨基酸(7种) 易溶于水，但色氨酸微溶于水。其侧链具有亲水性(除外色氨酸) 。 酸性氨基酸(2种) 侧链上有羧基，在水溶液中能释放出h+而带负电荷。 碱性氨基酸（3种） 侧链上有氨基、胍基、咪唑基等，在水溶液中能接受h+ 而带正电荷。,20种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下:,缬氨酸 valine val v 5.96,非极性侧链氨基酸 (8种),甘氨酸 glycine gly g 5.97,丙氨酸 alanine ala a 6.00,亮氨酸 leucine leu l 5.98,异亮氨酸 isoleucine ile i 6.02,苯丙氨

20、酸 phenylalanine phe f 5.48,脯氨酸 proline pro p 6.30,中文名称 英文名称 缩写符号 结构式 等电点,h,ch3,ch3-ch,ch3,ch3-ch2-ch,ch3,蛋氨酸 methionine met m 5.74,极性中性侧链氨基酸 (7种),色氨酸 tryptophan try w 5.89,丝氨酸 serine ser s 5.68,酪氨酸 tyrosine try y 5.66,半胱氨酸 cysteine cys c 5.07,天冬酰胺 asparagine asn n 5.41,谷氨酰胺 glutamine gln q 5.65,苏氨酸

21、threonine thr t 5.60,中文名称 英文名称 缩写符号 结构式 等电点,中文名称 英文名称 缩写符号 结构式 等电点,酸性氨基酸 (2种),天冬氨酸 aspartic acid asp d 2.97,精氨酸 arginine arg r 10.76,组氨酸 histidine his h 7.59,hooc-ch2,谷氨酸 glutamic acid glu e 3.22,碱性氨基酸 (3种),中文名称 英文名称 缩写符号 结构式 等电点,赖氨酸 lysine lys k 9.74,1.含硫氨基酸,2.3 几种特殊氨基酸,2.芳香族氨基酸,3.支链氨基酸,亮氨酸,ch2,chc

22、ooh,nh2,苯丙氨酸,4.亚氨基酸,脯氨酸,u 必需氨基酸： 成年人：thr、 val、 leu、ile、 phe 、trp、lys、 met 婴儿期：arg和his供给不足，属半必须氨基酸 u 非必需氨基酸：,2. 非编码的蛋白质氨基酸,也称修饰氨基酸，是在蛋白质合成后，由基本氨基酸修饰而来 （1）4-羟脯氨酸 （2）5-羟赖氨酸 （3）6-n-甲基赖氨酸（存在于肌球蛋白中） （4）-羧基谷氨酸 （5）tyr的衍生物: 3.5 -二碘酪氨酸, 甲状腺素(甲状腺蛋白中) （6）锁链素由4个lys组成（弹性蛋白中）。,主要存在于结缔组织的纤维状蛋白中,存在于凝血酶原及某些具有结合ca2+离子

23、功能的蛋白质中,3. 非蛋白质氨基酸,不组成蛋白质，但有生理功能 （1）l-型 氨基酸的衍生物 l-瓜氨酸、l-鸟氨酸是尿素循环的中间物 （2）d-型氨基酸 d-glu、d-ala（肽聚糖中）、d-phe（短杆菌肽s） （3）-、-、-氨基酸 -ala（泛素的前体）、-氨基丁酸（神经递质）,2.3 氨基酸的功能： (1) 组成蛋白质; (2) 充当化学信号分子(一些aa及其衍生物); -氨基丁酸, 色氨酸衍生物: 5-羟色胺、褪黑激素都是神经递质; 甲状腺素(tyr衍生物) , 吲哚乙酸(trp衍生物)都是激素; (3) 是许多含n分子的前体物; 核酸的含氮碱基、血红素、叶绿素的合成都需要aa

24、 (4) 一些基本氨基酸和非基本aa是代谢中间物; 精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸)尿素循环的中间物,蛋白质氨基酸残基数的计算,20种常见氨基酸的平均分子量为138； 组成蛋白质的氨基酸的平均分子量为128； 对于简单蛋白质，用110除它的相对分子量即可约略估计出其氨基酸残基数目； 每个氨基酸残基的平均分子量为110。,(1) 无色晶体，熔点较高（200300） ；水中溶解度各不同，取决于侧链，不溶于有机溶剂。 (2)氨基酸的旋光性（符号和大小）取决于它的r基的性质，并与溶液的ph值有关。 外消旋物：d-型和l-型的等摩尔混合物。 内消旋物：分子内消旋 胱氨酸有三种立体异构体：l-、d-和内消旋胱氨酸

25、。 l-胱氨酸和d-胱氨酸是外消旋物,三、氨基酸的理化性质,3.1 一般物理性质,氨基酸在晶体和水溶液中主要以兼性离子形式存在,晶体溶点高 离子晶格，不是分子晶格。 不溶于非极性溶剂 极性分子 介电常数高水溶液中的氨基酸是极性分子。,(3) 氨基酸的光吸收：（构成蛋白质的20种aa） 在可见光区都没有光吸收 在近紫外光区(220-300nm)只有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸r基含有共轭双键，有特征吸收。 phe（f）max257 nm，257=2.0 x102 tyr（y）max275 nm，275=1.4x103 trp（w）max280 nm，280=5.6x103 可以依据是朗伯比尔定律通过

26、利用分光光度法测定280 nm 处的紫外吸收值的方法对蛋白溶液进行定量。在280nm处蛋白质溶液吸光值与其浓度成正比。 在远紫外光区(220nm)均有光吸收。,spectroscopy of amino acids,only the aromatic amino acids absorb light in the uv region,3.2 氨基酸的化学性质,(1). 两性解离及等电点:,ph=pi,phpi,phpi,兼性离子,阳离子,阴离子,在pi时，aa在电场中既不向正极也 不向负极移动，处于两性离子状态,在pi时，aa 的溶解度最小,解离方式取决于所处溶液的酸碱度,两性电解质,离子化合

27、物,-羧基pk1在2.0左右,当ph3.5,-羧基以-coo-形式存在; -氨基pk2在9.4左右,当ph8.0时,-氨基以-nh3+形式存在; 在ph3.5-8.0时,带有相反电荷。,等电点(isoelectric point, pi) 当溶液为某一ph值时，aa的氨基和羧基的解离度完全相等，正负离子浓度相等。aa主要以兼性离子的形式存在，分子中所含的正负电荷数目相等，净电荷为0。这一ph值即为aa的等电点（pi）。,(2) 氨基酸等电点的计算： 酸碱滴定法： 根据可解离基团的pk值计算：,结构不同的氨基酸pi不同,对于侧链含有可解离基团的aa解离原则及解离百分数,先解离-cooh，随后其他

28、-cooh； 后解离-nh3+，随后其他-nh3。 总之羧基解离度大于氨基，-c上基团大于非-c上同一基团的解离度。 aa在某一ph条件下的解离百分数公式： ph=pk+lg (质子受体/质子供体),氨基酸等电点的计算,侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的pk1和pk2的算术平均值： pi = (pk1 + pk2 )/2,phpi, 带负电。,侧链含有可解离基团的氨基酸，其pi值也决定于两性离子两边的pk值的算术平均值。 酸性氨基酸： pi = (pk1 + pkr-coo- )/2,碱性氨基酸：pi = (pk2 + pkr-nh2 )/2,二十种基本氨基酸，除his外，在生理ph

29、（ph 7附近）下都没有明显的缓冲容量，因为这些氨基酸的表观解离常数都不在ph 7附近，缓冲容量只有在接近表观解离常数值时才表现出来。his咪唑基的解离常数为6.0，在ph 7附近有明显的缓冲作用。血红蛋白含有较多的his残基，在ph 7左右的血液中具有明显的缓冲能力，对运输氧和二氧化碳重要。,总结,(3)氨基酸的主要化学反应,-氨基参加的反应,-羧基参加的反应,-氨基与-羧基都参加的反应,侧链基团参加的反应,nh2 常温 oh r ch cooh + hno2 r ch cooh+h2o+n2 3-4min van slyke 法测氨基氮（体积）的基础。 n2中的1/2为氨基氮。 -氨基的反

30、应速度较其他快。 除脯氨酸外,用途：氨基酸定量和蛋白质水解程度的测定,与亚硝酸反应(van slyke定氮),-氨基参加的反应,与甲醛发生羟甲基化反应,用途：可以用来直接测定游离氨基及氨基酸的浓度,氨基酸的氨基与 甲醛的羰基发生 加成反应，降低 氨基酸中氨基的pka。, 烃基化反应,dnfb/fdnb法或sanger reaction,用途：是鉴定多肽n-端氨基酸的重要方法,ph 8-9,aa氨基一个氢原子可被羟基 （包括环烃及其衍生物）取代,2,4-二硝基氟苯,sanger reaction,sanger法n端测序-2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链n-端的游离氨基作用，生成二硝基苯

31、衍生物（dnp-氨基酸）。 在酸性条件下水解，得到黄色dnp-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的dnp-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。,用途：是鉴定多肽n-端氨基酸的重要方法,edman氨基酸顺序分析法（异硫氰酸苯酯pitc法），是一种n-端分析法。特点是能够不断重复循环，将肽链n-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。,用途：是鉴定多肽n-端aa和aa顺序的重要方法,edman法/异硫氰酸苯酯pitc法, 酰基化反应,用途：鉴定多肽n-端氨基酸,微量a的定量测量。,丹磺酰氯法（dns-cl）, hx,用途：用于保护氨基以及肽链的合成。,氨基保护反应,用途：是多种酶促反应的中间过程。, -生成西

32、佛碱反应(schiff base),醛类化合物,氨基酸,西佛碱,用途：氨基酸氧化酶催化的反应。,-脱氨基反应,氧化酶催化,酮酸,氨基的化学反应: 与茚三酮 (ninhydrin) 反应 定量反应 与亚硝酸反应 van slyke定氮 与2,4-二硝基氟苯 (dnfb) 反应 测序 与甲醛的反应 氨基滴定 与酰化基的反应 氨基保护基 与二甲基氨基萘磺酰氯 (dns-cl)的反应 测序 与荧光胺的反应 微量检测 与edman试剂 (苯异硫氰酸) 和 测序 有色edman试剂的反应,总 结, 成盐或成酯反应, 成酰氯反应, 脱羧基反应, 叠氮反应,-羧基参加的反应, strecker降解反应,-羧基

33、参加的反应, strecker降解反应,strecker降解反应：-氨基酸与-二羰基化合物反应时，-氨基酸氧化脱羧生成比原来氨基酸少一个碳原子的醛，氨基与二羰基化合物结合并缩合成吡嗪；此外，还可降解生成较小分子的双乙酰、乙酸、丙酮醛等。 1862年strecker发现四氧嘧啶能将ala分解为乙醛和co2，此反应称strecker降解。 不同-氨基酸与还原糖加热能按strecker降解生成各种特殊醛类，不仅与褐变有关，还与香气的产生有关。,a. aa + naoh 氨基酸钠盐(氨基酸的碱金属盐能溶于水，重金属盐不溶于水) b. hclaa + etoh 氨基酸乙酯的盐酸盐 当aa的-cooh变成

34、甲酯、乙酯或钠盐后，-cooh的化学反应性能被掩蔽或者说cooh被保护，-nh2的化学性能得到了加强或活化，易与酰基结合。 为什么aa的酰基化和烃基化在碱性溶液中进行？,-成盐、成酯反应, 形成酰卤的反应,用途：常作为多肽合成活性中间体，活化羧基。, -叠氮化反应,用途：脱羧酶催化的反应, -脱羧（基）反应,与茚三酮反应,成肽反应,-氨基与-羧基都参加的反应,-氨基和羧基共同参与的反应,茚三酮,水合茚三酮,紫色产物,pro、hypro ?,茚三酮反应 （氨基酸定性、定量分析）,氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm处。由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因

35、此可作为氨基酸定量分析方法。,(蓝紫色),茚三酮反应,弱酸 加热,用途：是多肽和蛋白质合成的基本反应,成肽反应,侧链的化学反应 羟基: 酯化 蛋白质磷酸化 巯基: 氧化还原-二硫键形成与还原,-侧链基团的反应,作用：与金属离子的螯合性质可用于体内解毒,巯基（-sh）的反应,与重金属反应,作用：氧化还原反应可使蛋白质分子中二硫键形成或断裂。,巯基的氧化及二硫键的还原,作用：氧化还原反应可使蛋白质分子中二硫键断裂。二硫苏糖醇(dtt)也可以用来打开胱氨酸上的二硫键。,dtt,二硫键的断裂,与碘乙酸反应,二异丙基氟磷酸酯, dfp、dipf、difp,+hf,作用：可用于修饰蛋白质。,羟基的反应,第

36、 三 节 肽,一、氨基酸在蛋白质分子中的连接方式,(一)肽键(peptide bond)是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。,肽键,肽键,r,nh2,ch,c,o,r,nh,ch,c,o,oh,二肽,氨基酸残基,氨基酸残基,肽键的键长为0.132nm，短于单键的0.147nm，长于双键的0.123nm，故具有部分双键的特性，不能自由旋转且具永久偶极。,-,+,牛核糖核酸酶,多肽链,肽基的c、o和n原子间的共振相互作用,肽键共振的结果, 限制肽键的自由旋转，给肽主链的每一个氨基酸残基只保留两个自由度。 组成肽基的4个原子和2个相邻的c原子倾向于共平面，形成所谓的多

37、肽主链的酰胺平面（amide plane）或称肽平面（peptide plane）。, cn 键的长度为0.133nm，比正常的 cn 单键（0.145nm）短，但比典型的 c=n 键（0.125nm）长。估计肽基中的 cn 键具有约40%的双键性质，而 c=o 键具有40%的单键性质，在室温下足以防止 cn 键旋转。这样就产生两个重要结果：（1）肽键的亚氨基在ph 0-14的范围内没有明显的解离和质子化的倾向；（2）肽键中的cn单键不能自由旋转，使蛋白质能折叠成各种三维构象。 杂化的中间态酰胺带有0.28个净正电荷，羰基带有0.28个净负电荷，肽键具有永久偶极。,(二)肽平面 (肽单元 ),

38、参与肽键的4个原子和与之相连的两个碳原子(c1、c、o、n、h、c2)共处同一平面，称肽平面； 此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元 (peptide unit) 。,肽键平面示意图,肽平面,肽平面的意义：,肽键平面是蛋白质分子空间结构的基本单位 肽键平面是蛋白质分子具有空间结构的根本原因,c1和c2在肽平面上的顺、反构型,肽平面内，因为顺式构型两个r基有空间位阻，所以反式构型比顺式构型稳定，因此肽链中肽键几乎都是反式构型。,脯氨酸的亚氨基形成的肽键,of the peptide bonds between amino acid residues other than pro, over

39、99.95% are in the trans configuration. for peptide bonds involving the imino nitrogen of proline, however, about 6% are in the cis configuration; many of these occur at turns.,trans cis,（三）酰胺平面与-碳原子的二面角（ 和 ）,二面角 两相邻酰胺平面之间，能以共同的c为定点而旋转，绕c-n键旋转的角度称角，绕c-c键旋转的角度称角。和称作二面角，亦称构象角。,多肽链的特点：,1、肽键 2、aa残基 3、两个末

40、端（方向性） 4、主链和侧链 5、肽键平面(肽单元）,小 结,对于小分子量的肽的命名，是从其n端开始，称为某氨酰某氨酰某氨酰某氨基酸，下例写成ser-gly-tyr-ala-leu，左边是n端，右边是c端。 对于生物体内的具有特定结构和功能的小分子量肽，还有特别名称，如脑啡肽、内啡肽、催产素、加压素等。,二、肽的命名,体内许多激素属寡肽或多肽。,焦谷氨酸 组氨酸 脯氨酰胺,促甲状腺素释放激素(trh),三、肽的理化性质,由于短肽晶体的熔点都很高，说明短肽的晶体是离子晶格，在水溶液中以偶极离子存在。 在ph014范围内，肽键中的酰胺氢（亚氨基-nh-）不解离，所以肽的酸碱性主要决定于肽链末端的-

41、羧基、-氨基以及r基团上的可解离基团。在长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链上的。 因为肽链末端的-羧基和-氨基相距很远，它们之间的静电引力较弱，所以它们的酸碱性比氨基酸的-羧基和-氨基弱。r基上可解离基团的解离常数也有所变化。,肽末端-羧基pka值比游离aa中的大。 肽末端-氨基pka值比游离aa中的小。,在某一ph下，肽中各可解离基团解离得到的净电荷为0，这个ph就是该肽的等电点。 肽的化学反应和氨基酸的一致。n端的氨基酸残基也可以与茚三酮反应，这一反应可用于肽的定性和定量测定。 双缩脲反应是肽和蛋白质特有的，氨基酸没有此反应。一般含有两个或两个以上肽键的化合物与cuso4碱性溶液都能发

42、生双缩脲反应，生成紫红色或蓝紫色的络合物，利用这个反应可以用分光光度法（540nm）测定蛋白质的含量。,四、生物活性肽（简称活性肽）,1. 一类分子量小于6000d，具有多种生物学功能的寡肽/多肽。,4.1 活性肽的定义及来源,活性肽食用安全性极高,第四节 蛋白质的分子结构,(the molecular structure of protein),构型: 一个有机分子中各个原子特有的固定的空间排列。构型的改变必须通过共价键的断裂。 构象：是指取代基团当单键旋转时可能形成的不同的立体结构，构象的改变不涉及共价键的改变。,蛋白质分子具有的特定的空间结构，即构象。 蛋白质的构象分为： 主链构象：多肽

43、链上各原子的排布及相互关系； 侧链构象：各氨基酸侧链基团中原子的排布及相 互关系； 两者关系：相互依存、相互影响,蛋白质结构的组织层次,一级结构：多肽链的氨基酸序列 二级结构：多肽链借助于氢键排列成有规律的、局部的结构 三级结构：多肽链借助各种非共价键弯曲、折叠成具有特定走向的紧密球状构象 四级结构：寡聚蛋白质亚基间的结合，亚基间不同的排列方式会形成不同的构象。,一、蛋白质分子中的共价键与次级键,共价键,次级键,化学键,肽键,一级结构,氢键,二硫键,二、三、四级结构,疏水键,离子键,三、四级结构,范德华力,多肽链中的次级键(非共价键),1. 氢键(hydrogen bond) ： 常见于连接在

44、一电负性很强的原子（n,o）上的氢原子，与另一电负性很强的原子(o)之间。 键能较低(12kj/mol)，易被破坏； 在维系蛋白质的空间结构稳定上起着重要作用（数量多）。,2. 疏水键：,非极性物质在含水的极性环境中存在时，会产生一种相互聚集的力，称为疏水键或疏水作用力。 蛋白质分子中的许多氨基酸残基侧链也是非极性的，这些非极性的r基在水中也可相互聚集，形成疏水键，如leu，ile，val，phe，ala等的侧链基团。,3. 范德华引力（van der waals) ：,原子之间存在的相互作用力。,4. 离子键/盐键(salt bond) ：,由带正或负电荷基团之间相互吸引或排斥而形成的化学键

45、。 在近中性环境中，蛋白质分子中的酸性氨基酸残基侧链电离后带负电荷，而碱性氨基酸残基侧链电离后带正电荷，二者之间可形成离子键。 多肽链两端的解离状态，也亦带电荷。,维持蛋白质分子构象的各种化学键,二、蛋白质的特有的天然空间结构构象,一级结构：氨基酸顺序 二级结构：螺旋、折叠、转角，无规卷曲 三级结构：螺旋、折叠、转角、松散肽段 四级结构：多亚基聚集,包括组成蛋白质的多肽链数目 多肽链的氨基酸顺序 有些蛋白质还包括多肽链内或链间二硫键的数目和位置 其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础,蛋白质的一级结构决定高级结构,1.定义：指多肽链中氨基酸的排列顺序。,(一)、蛋白质的一级

46、结构(primary structure),氨基酸序列多样性决定蛋白质空间结构和功能的多样性,半胱氨酸,胱氨酸,半胱氨酸,-,ooc,-,ch,-,ch,2,-,s,+,nh,3,s,-,ch,2,-,ch,-,coo,-,+,nh,3,-,ooc,-,ch,-,ch,2,-,s,+,nh,3,s,-,ch,2,-,ch,-,coo,-,+,nh,3,2.主要的化学键： 肽键，二硫键。,胰岛素（insulin）,功能： 促进葡萄糖的氧化，降低血糖。 促进蛋白质及脂类的合成代谢。,insulin,牛胰岛素的一级结构,意 义,蛋白质一级结构是由遗传信息决定的。 蛋白质一级结构是蛋白质空间构象和特异

47、生物学功能的基础。,1. 肽键具有部分双键性质： 肽键不能自由旋转。 组成肽键的四个原子和与之相连的两个碳原子(c) 处于同一个刚性结构的平面肽平面内。 2. 二面角所决定的构象能否存在: 受主链原子空间位阻限制，只有部分搭配被允许。 3. 侧链 r 基的影响（空间位阻、相互吸引或斥力）,蛋白质多肽链空间构象数目的限制因素,(二)、蛋白质的二级结构, 定义 蛋白质分子中某一段肽链的局部空间 结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象 。, 主要的化学键 氢键,1. 定义与主要化学键,2. 蛋白质二级结构的主要形式, -螺旋 ( -helix ) -折叠 ( -pl

48、eated sheet ) -转角 ( -turn ) -凸起( -bugle ) 无规卷曲 ( random coil ),-螺旋:以 碳原子为转折点，形成右手螺旋,以链内氢键保持稳固。 氢键由肽键中氮原子上的氢与其n端第四个羰基上的氧之间形成的。 不同类型的螺旋结构中，氢键封闭形成的环中含aa残基及原子数均不同(310, 3.613, 4.416)。 各aa残基的r基团均伸向螺旋外侧。,1951年根据 x 射线衍射图提出,-螺旋的结构特点,a. 由l型氨基酸构成的多肽链可以卷曲成右手螺旋，也可卷曲成左手螺旋，但右手螺旋比较稳定（因为在左手螺旋中碳与羰基过于接近，不稳定）。只在嗜热菌蛋白酶中

49、发现一圈左手螺旋。 b. 螺旋的直径是11埃，螺旋上升一圈需要3.6个aa残基，相当于向上平移5.4埃，即每个aa残基高度为1.5埃。（1埃=0.1纳米=10-10米）,c. 有螺旋的帽化现象(螺旋两端各有4个aa残基不参加螺旋内氢键形成）。 d. 相邻的螺圈之间形成链内氢键，氢键的取向几乎与中心轴平行(螺旋结构允许所有的肽键都参与链内氢键的形成，因此相当稳定)。 e. r基（空间形状、大小、电荷）对螺旋的形成和稳定有重要影响。,r基对螺旋的影响,脯氨酸由于其亚氨基少一个氢原子，无法形成氢键，而且cn键不能旋转，所以是螺旋的破坏者，肽链中出现脯氨酸就中断螺旋，形成一个“结节”。 侧链带电荷及侧

50、链基团过大的aa不易形成螺旋。 甘aa侧链太小，构象不稳定，是螺旋的破坏者。,一条肽链能否形成螺旋，以及螺旋的稳定 性怎样，与其一级结构有极大关系, -折叠,是一种比较伸展、成锯齿状的结构。 两条肽链走向不同。 氢键在股间形成。,-折叠的结构特点,a. 肽链伸展，肽平面间折叠成锯齿状。 b. 若干条肽链或一条肽链的若干肽段平行排列，相邻主链骨架之间靠氢键维系。氢键与链的长轴接近垂直。 c.折叠有两种类型，一种是平行式，即所有肽链的氨基端在同一端；另一种是反平行式，即所,有肽链的氨基端按正反方向交替排列。从能量上看，反平行式更为稳定。 d. 侧链基团较小，分布于片层的上下。侧链主要是甲基，因为除

51、甘氨酸外，丙氨酸是主要成分。如果肽链中侧链过大，并带有同种电荷，则不能形成折叠。, -转角,肽链出现180回折的部分形成,由第一个aa残基中羰基上的氧与第四个aa残基中 氮原子上的氢之间形成氢键，构成一个紧密的环。,甘氨酸（无侧链空间位阻），脯氨酸（不能形成氢键）易出现在-转角。,3. 超二级结构和结构域,超二级结构： 若干个相邻的二级结构元件（主为螺旋、折叠）组合在一起、彼此相互作用，形成种类不多的、有规则、在空间中可以辨认的二级结构组合体或二级结构串，在多种蛋白质（主要为球蛋白）中充当三级结构的构件。 超二级结构的组合形式、及,结构域(domain) ： 大分子蛋白质的三级结构常可分割成一

52、个或数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行使其功能，称为结构域。 结构域在空间上彼此分隔，各自有部分生物学功能。,(三)、蛋白质的三级结构,疏水作用力,2.主要的化学键,整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置，即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。只有具有三级结构的多肽链才能称为蛋白质。,1. 定义,肌红蛋白的 三级结构图,丙糖磷酸异构酶 三级结构图,肌红蛋白的单结构域,本质：肌红蛋白 = 一条多肽链（153aa残基）+ 一个辅基(亚铁血红素)组成 形状：呈紧密球形多肽链中氨基酸残基上的疏水侧链大都在分子内部,亲水侧链多位于分子表面,因此其水溶性较好。,肌红蛋白 (mb),三维结构,肌红

53、蛋白的三级结构,共有8段-螺旋，占全部序列的75%。整条肽链折叠成紧密球状，疏水侧链大都在分子内部，极性、带电荷的侧链则在分子表面。其分子表面形成一个深的疏水口袋，血红素通过与周围氨基酸残基的次级键以及血红素铁与近端的his形成的配位键而“藏”在洞中。 该口袋允许o2进入。 co也能与血红素结合，co的毒性是因为它与血红素的亲和力更大，从而阻止o2与血红素的结合。,要点：,具有三级结构的某些蛋白质多肽链即可表现生物学活性，对这类蛋白质来说，三级结构是其分子结构的最高形式。 结构域:存在于蛋白质三级结构中能够发挥生物学功能的特定区域。 如果蛋白较小，只含一个结构域，则结构域和三级结构是一个意思。

54、,球蛋白分子三级结构的共同特点,含多种二级结构构成元件； 具明显的折叠层次； 疏水侧链多分布在分子内部，亲水侧链多分布在分子表面。 分子表面常具有疏水空穴活性部位；,2.主要化学键 亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。,(四)、蛋白质的四级结构,1.定义 蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。,有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基 (subunit)。,血红蛋白的四级结构,(1)血红蛋白的结构： 由四个亚基组成，2个-亚基，2个-亚基，每个亚基由一条多肽链与一个血红素辅基组成。个亚基以正

55、四面体的方式排列，彼此之间以非共价键相连。,3. 血红蛋白 (hemoglobin, hb) 的结构与功能,血红蛋白,血红蛋白（22），有稳定的四级结构，与氧的亲和力很弱。但当氧与血红蛋白分子中一个亚基的血红素辅基的铁结合后，fe2+被拉回卟啉环，铁卟啉环由圆顶状变成平面，与配位键连接得his发生位移，并引起该亚基构象改变，一个亚基构象的改变又引起其余亚基的构象相继发生改变，亚基间的次级键被破坏，结果整个分子从紧密的构象变成比较松散的构象，易于与氧结合，使血红蛋白与氧结合的速度大大加快。 血红蛋白上有co2结合部位，因此，血红蛋白还能运输co2,(2)氧结合引起的血红蛋白构象变化,肽键,氢键,

56、疏水键,氢键,5.1 决定蛋白质高级/空间结构的因素,1. 链的折叠模式取决于其特定的氨基酸序列。 （1972年诺贝尔化学奖，核糖核酸酶的去折叠和重折叠过程，发现在相同的环境中去折叠的蛋白质都会恢复到原来的空间结构，认为蛋白质链会以自由能最低的方式形成三维结构，由此推测蛋白质的折叠密码隐藏在氨基酸排序中，即所谓的安芬森原则：蛋白质一级排序决定三维结构。） 2. 细胞内特有的微环境（ph、离子强度、水、温度）是蛋白质折叠成天然构象的重要环境因素。 3. 维持蛋白质高级结构的作用力: 二硫键, 非共价键。,五、蛋白质结构与功能的关系,(一)一级结构与功能的关系,天然状态，有催化活性,尿素、 -巯基

57、乙醇,去除尿素、 -巯基乙醇,非折叠状态，无活性,1.核糖核酸酶一级结构与功能的关系,二硫键破坏后，生物学活性丧失。,(1)将a链n端的第1个氨基酸残基切去，其活性只剩210，再将第24位氨基酸残基切去，其活性完全丧失。,(2) 将a、b两链间的二硫键还原，a、b两链即分离，胰岛素的功能完全消失。,(3) 将b链第2830位氨基酸残基切去，其活性仍能维持100%。,2.胰岛素一级结构与功能的关系,3.血红蛋白一级结构与功能的关系,例：镰刀形红细胞贫血,n-val his leu thr pro glu glu c(146),hbs 肽链,hba 肽 链,n-val his leu thr pr

58、o val glu c(146),分子病：由于dna的突变，导致其所编码的蛋白质分子aa序列异常、生物学功能改变的遗传性疾病。,得到结论,存在种属差异 一级结构与蛋白质的活性密切相关 不变残基：不变残基的改变影响蛋白质的构象与功能 可变残基：可变残基的改变不影响蛋白质的构象与功能 一级结构的改变一定有相应功能的改变： 如无活性的酶原向活性酶的转变过程,(二)蛋白质空间/高级结构与功能的关系,表现： 轻度改变：使功能改变（变构效应） 严重改变：则功能丧失（蛋白质变性作用）,空间结构决定生物学功能,1血红蛋白空间结构与功能的关系,hb未结合o2时，4个亚基结构紧密,称紧张态(t态)。随着o2 的结合,空间结构发生变化，使结构相对松弛，称松弛态(r态)。t态对氧亲和力低,r态对氧亲合力高，是hb结合o2 的形式。肺毛细血管o2 分压高,促使t态转变成r态,组织毛细血管, o2 分压低,促使r态转变成t态。,例：疯牛病中的蛋白质构象改变 疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, prp)引起的一组人和动物神经退行性病变。 正常prp富含-螺旋，称为prpc。在某种未知蛋白质作用下转变成为-折叠的prpsc，从而致病。,蛋白质构象疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨廷顿舞蹈病、疯牛病等。,2朊病毒蛋白空间结构与功能的关系,免疫球蛋白的基本构成,富含脯氨酸，易伸展弯曲