国境口岸圣路易斯脑炎病毒实时荧光RT-PCR方法编制说明(可编辑)

1、国境口岸圣路易斯脑炎病毒实时荧光RT-PCF方法 编制说明出入境检验检疫行业标准草案编制说明1 基本信息1.1标准草案名称 中文国境口岸圣路易斯脑炎病毒实时荧光 RT-PCR佥测方法英文 Detection Method for St.Louis Encephalitis Virus by real-time fluorescence RT-PCR at frontier ports1.2 与国际标准和国外先进标准一致程度情况 等同修改非等效 标准号英文名称中文名称1.3 任务来源 批准立项的文件名称和文件号 质检科研公益性行业专项 （200810162） 项目 计划编号 2011B307k1

2、.4 制（ 修） 订情况 制定 修订 替代的标准编号1.5 起止时间 2011 年 6 月- 2012 年 10 月1.6 项目承担单位 中国检验检疫科学研究院、深圳出入境检验检疫局1.7 起草团队 胡孔新、史蕾、杨鹏飞、燕清丽、张丽萍、徐焕洲、孙肖红、 刘丽娟、杨宇、王静1.8 专业类别 食品 （ 化妆品 ）检验 ; 卫生检疫 ; 动物检疫 ; 植物检 疫;纺织产品检验 ; 轻工产品检验 ; 机电产品检验 ; 化工、矿产品和金属 材料检验；管理；鉴定;包装及危险化学品1.9 标准体系表代码1.10调整情况 将“国境口岸圣路易斯脑炎病毒实时荧光RT-PCR方法”改为“国境口岸圣路易斯脑炎病毒实

3、时荧光RT-PCRi测方法”。2 背景情况2.1 目的、意义圣路易斯脑炎 (St Louis Encephalitis,SLE) 是由圣路易斯脑炎病毒引起 , 经蚊媒传播的人畜共患中枢神经系统感染性疾病。最初于 1932 年夏流行于美国伊利诺斯 (Illrnois) 州的帕里斯 (Paris), 翌夏又爆发流行 于密苏里 (Missouri) 州的圣路易 (St.Louis) 市一带,病例达 1000余人,故命名为 圣路易脑炎。圣路易斯脑炎病毒 , 属黄病毒科 Flaviviridae 黄病毒属 Flavivirus 单股正链RNA病毒，与日本脑炎病毒、西尼罗病毒、默累谷脑炎病毒(Murray

4、Valley Encephalitis virus) 、昆津病毒 (Kunjun virus) 等同属一个血清型 , 是 一种虫媒病毒 , 主要经库蚊 (在美国确定的传播媒介以蚊子 Culex tarsalis 、 Culex pipiens 、 Culex quinquefasciatus 和 Culex nigripalpus为主) 传播,鸟类为主要宿主 , 以鸟-蚊-鸟的循环作为基本传播周期。人类是目前已知的自然 感染该种病毒后致病的唯一物种 , 该病毒感染人类后可引起发热、头痛等流感样 症状 , 也可表现为中枢神经系统感染症状 , 严重者可死亡。本病流行限于北美洲 , 主要在密西西比河

5、和俄亥俄河流域。圣路易脑炎病毒在美国已流行数十年。 SLE 爆发于夏季 , 主要出现在美国佛罗里达和中西部、西南部的州以及密西西比河流 域。各年龄组均可发病，但儿童发病者相对较少，老年人易发生严重感染。SLE流 行基本环节为蚊一鸟一蚊传播环。 本病传染源主要是野鸟和家禽 , 呈周期性爆发。 城市中鸽子和麻雀在病毒的自然界增殖中起重要作用。 作为一种蚊传播的病原体 , 主要传播媒介是跗斑库蚊 (culextarsalis) 、尖音库蚊 (culexpipiens) 和黑须库 蚊(nigripapus)。境外一些来自疫区的现症患者或媒介通过国境口岸的带入，均可引起登革圣路易脑炎病毒在我国的扩散。因

6、此 , 随着我国与世界各国交通往来 的日益频繁 , 在国境口岸建立一种圣路易脑炎病毒的快速检验鉴定方法 , 是检验 检疫机关迫切而重要的 工作内容之一。制定本标准主要是想通过实时、快速的 检测鉴定手段 , 判断国境口岸可疑病 人或可疑蚊子是否携带圣路易脑炎病毒 ,从 而防止圣路易脑炎病毒传入 , 具有重要的社会效益和经济效益。2.2 与国内外相关标准、文献的关系 针对圣路易斯脑炎病毒实时荧光RT-PCR方法目前还没有相关的国家标准或行业标准,只在一些文献中找到对该 病毒的相关检测报道。3 编制过程3.1 准备阶段 （可选项）3.2 分工情况 深圳出入境检验检疫局负责引物探针设计及方法的建立。中

7、国检验检疫科学研究院负责验证。3.3 标准草案编写情况 已完成3.4 征求意见情况 （ 适用于送审稿 ） 挂网征求意见。3.5 审定情况（ 适用于报批稿 ） 专家审定通过3.6 预期的管理目标 （适用于规程类标准 ）或技术指标（适用于方法类标准 ） 建立方法并进行实际应用。4 主要技术内容的确定4.1引物、探针的设计与合成 从NCBI下载圣路易斯脑炎病毒的核酸全序列 共11株,用DNAMAN件进行序列分析,找到共同的NS5呆守区进行引物及探针设 计见图1oNS5蛋白具有RNA依赖的RNA聚合酶活性,也是黄病毒属中最保守的蛋 白。在 PrimerExpress 3.0 上面进行设计得到引物及探针

8、 （见表 1、图 1）。 图 1圣路易斯脑炎病毒基因组NS5保守区核苷酸序列队列比较表1实时荧光RT-PCR所用的引物和探针4.2 阴性对照克隆质粒、 阳性对照克隆质粒的准备 由上海辉睿生物公司利用全基因合成技术合成 WN、V DEN、SLE、HBV、YFV、JE 等黄热病毒科的参照小片段DNA分别与pGEM-TEasy载体(美国Promega公司产品)构建各自的克隆质粒。 其中 WNV-plasimid 作为阳性对照克隆质粒 ,DEN-plasimid 、SLE-plasimid 、 HBV-plasimid 、YFV-plasimid 、JE-plasimid 作为阴性对照克隆质粒。4.3

9、 方法优化TaqMan RT-PCR 反应选用的试剂盒为 Ag-Path-IDTM One step RT-PCR Kit( 美国 Ambion 公司产品), 扩增和检测在全自动荧光定量仪 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR Systems 上进行。4.3.1 扩增程序的确定 根据引物、探针的具体特性 , 仪器上的反应程序在退火延伸条件选择上试验了 3种温度和3种时间:95 C 10分钟,95 C 15秒 (58/60/62) C (30/45/60)秒，在退火延伸阶段进行单点荧光检测。各种试剂的加 样量分别为每个反应管中含 2 x RT-PCR Rea

10、ction Buffer 12.5 ul,WNV-FP12.5卩 mol/L1ul、WNV-RP12.51 mol/L1ul,WNV-P12.5 卩 mol/L0.5ul, 25 x RT-PCREnzymeMix 1卩L,模板DNA5ul,用超纯水补足到反应总体积 25卩L。结果均可见 阳性扩增曲线 , 但考虑到使引物扩增有更好的特异性和缩短反应时间 , 最后确定 扩增程序为:95 C 10分钟,95 C 15秒60E 45秒,40次循环。4.3.2 最佳引物浓度的确定应用以上扩增程序 , 先固定探针终浓度为250nM,正、反向引物浓度在 250nM 500nM 750nM 1000nM 1

11、250nM之间选择。 按表 2 所列浓度加上、下游引物终浓度选择合适的引物浓度。 图 2 最佳引物 浓度的确定 以 Ct 值最小 , 扩增曲线也最明显的曲线所对应的引物浓度为最佳 浓度，见图2。最终确定SLE-FP终浓度500nM,SLE-RP终浓度为500nM4.4最佳探针浓度的确定根据选择好的最佳正、反向引物浓度 SLE-FP终浓度500nM,SLE-RP终浓度为500nM,进一步进行探针浓度的确定，在125nM250nM 500nM 750nM 1000nM之间选择。图 3 最佳探针浓度的确定以 Ct 值最小 , 扩增曲线也最明显的曲线所对应的探针浓度为最佳浓度, 见图 3 。最终确定

12、SLE-P 终浓度 250nM。4.5 标准曲线、线性范围与重复性分别将SLE质粒的标准品按10倍梯度稀 释成105 -101copies DNA/uL,依次用荧光定量RT-PCR法对上述各定量样品进行 检测, 建立标准曲线 （见图 4、图 5）, 测定其最大稀释度 , 确定敏感性可检测到 50 copies/卩L样品,表明该检测体系具有较高的检测灵敏度。通过分析表明,本检测体系在用空白对照及类似 SLE的DNA乍为扩增对照时，没有发现非特异性产物 的生成，表明该体系对于SLE的检测是特异的。通过4次批间重复检测，体系的变 异系数小于 1%,表明该检测体系具有良好的可重复性。图4 SLE标准曲

13、线-QPCF扩增曲线图5 SLE标准曲线-线性关系分别将SLE质粒的标准品按10倍梯度稀释成105 -101copies DNA/uL,标准 曲线的斜 率为-3.31, 相关系数大于 0.99。标准曲线每个稀释点的 Ct 值与标准 方差 （ 见表 3）表3标准曲线每个稀释点的Ct值与标准方差种类 结果 Ct 值1 2345SLE 20.9020.8720.9520.91 24.0124.0224.9724.03 27.6227.7027.6527.66 31.1731.2131.1431.17 34.8134.8534.8534.85标准差 SD 20.91 0.029 24.00 0.023

14、 27.66 0.029 31.17 0.02534.84 0.0174.6 特异性评价 根据Gen Ba nk中SLE病毒NS5基因的序列信息，利用BLASTt匕对,设计高度特异的引物和探针。 通过对SLE-plasimid、WNV-plasimid、 DEN-plasimid 、 HBV-plasimid 、 YFV-plasimid 、 JE-plasimid 的 检 测 验 证,SLE-plasimid可见标准扩增曲线，其他均未见扩增曲线，未出现交叉反应。结 果表明本试验建立的荧光定量 RT-PCF方法具有很高的特异性（图6）。图 6 SLE 探针及引物的特异性检测4.7 不同试剂的测

15、试本研究方法主要采用 Ag-Path-IDTM One step RT-PCRKit（美国Ambion公司产品），除此以外,还选用了多种试剂 按优化好的引物和探 针浓度进行了测试,即按SLE-FP终浓度500nM,SLE-RP终浓度500nM,SLE-Probe 终浓度250nM反应总体积为25卩L的情况下，模板DNA量为5卩l.除了按不同试 剂选用不同的反转录和 Taq酶激活条件外,PCR条件仍按45C 10分钟,95 C 10 分钟,95 C 15秒-60C45秒,40次循环。结果所有试剂均可得到很好的扩增结果。这些试剂包括 :Quanti Fast Probe QPCR Kits（QIAGEN 产品 , 货号 204454）、 One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit（ 大连宝生物 DRR064A）。5 验证情况 （ 适用于方法类标准 ）5.1 验证单位情况 验证单位 验证人员 验证时间年 月日 年 月日年 月日年 月日年 月日年 月日 年 月日5.2 验证过程5.3 验证数据分析5.4 验证评价5.5 其他应说明的情况6 附加说明 （ 可选项 ）6.1 宣贯标准的建议6.2 修订和废除现行有关标准的建议6.3