线粒体途径在脱氧胆酸诱导食管黏膜上皮细胞凋亡中的作用

1、DOC格式论文，方便您的复制修改删减线粒体途径在脱氧胆酸诱导食管黏膜上皮细胞凋亡中的作用(作者：单位：邮编：)作者：吴建涛，徐天娇，龚均，王进海，董蕾【摘要】目的 观察线粒体途径在脱氧胆酸(deoxycholate, DCA)诱导体外培养的人正常食管黏膜上皮细胞凋亡中的作用。方法采用无血清的角朊细胞培养基体外培养人正常食管黏膜上皮细胞，米用流式 细胞仪检测Rh123和/PI的荧光强度，分析线粒体跨膜电位(田m) 的变化情况；蛋白免疫印迹法检测细胞色素 c(Cyt.c)、Caspase 3和多 聚(ADP核糖)聚合酶(PARP)的表达及抑制剂对细胞凋亡和 Caspase 3活化的影响。结果 食管

2、黏膜上皮细胞用100 gol/L的 DCA处理后，PI阴性但Rh123低染的细胞在对照组为(1.8 ).6)%， 48h 为(30.5 1.7)%;用 200 pmol/L 的 DCA 处理后，PI 阴性但 Rh123 低染的细胞36h可达(43.1 ).2)%(P0.05)。PI阴性但Rh123低染细 胞开始出现，并逐渐增加，DCA诱导细胞凋亡时线粒体跨膜电位下 降，表明凋亡细胞在逐渐增多。Cyt.c和活化的Caspase3的抗体显 示，随着线粒体AWm的下降，Cyt.c、Caspase 3酶原也被剪切活化，Casapse _|3的底物PARP也发生了降解活化。Caspase |3特异性抑

3、制剂DEVDpMK部分抑制了 DCA诱导食管上皮细胞的凋亡，但对 线粒体跨膜电位的下降则没有影响。结论DCA诱导食管黏膜上皮细胞凋亡是通过线粒体途径引起的，线粒体、Caspase 3、PARP的活化共同参与了 DCA诱导食管黏膜上皮的凋亡过程。【关键词】脱氧胆酸;食管黏膜上皮细胞；线粒体途径；凋亡ABSTRACT: Objective To study the role of mitochondrial pathway in deoxycholate (DCA) induced apoptosis of human no rmal esophageal mucosal epithelial c

4、ells.Methods Cultured normal human esophageal mucosal epithelial cells were treated with deoxycholate. We used flow cytometry to determ ine mitochondrial membrane potential ( AWm) and its permeability. Expressions of caspase 3, cytochrome c and poly (ADP_ ribose) polymerase (PARP) were detected with

5、 Western blott ing. Caspase 3 inhibitor DEVDFMK was used to explore the role of caspase in deoxycholate induced apoptosis of human normal esophageal epithelial cells.Results Esophageal epithelial cells treated with 100 gol/L of DCA, PI _negative but low Rh123 stained cells in the con trol group (1.8

6、0.6)%, 48h was (30.5 1.7)%; after200 gol/L of DCA treatment, PI negative but low Rh123 stained cells numbered up (43.1).2)% at 36h (P0.05). PI _negative but lowRh123 sta ined cells bega n to appear, and gradually in creased,DCA in duced apoptosis whe n the mitocho ndrial membra ne pote ntial decreas

7、ed, in dicat ing that apoptotic cells gradually in creased. Cyt.c and activati on of Caspase3 an tibody showed thatwith the decline in m of mitochondria, cleavage of Cyt.c, Caspase J3 and poly (ADP ribose) polymerase (PARP ) of Casapse J3 substrate also occurred in the degradation activation. Caspas

8、e 3 specific inhibitor DEVDFMK could partially inhibit the DCA Ji nduced apoptosis of cells, but did not affect the decrease in mitocho ndrial membra ne pote ntial.Con clusi on DCA in duces theapoptosis of esophageal mucosal epithelial cells through the mitochondrial pathway. Mitochondria, caspase 3

9、 and activation of PARP cleavage are also invo Ived in the apoptosis.KEY WORDS: deoxycholate; esophageal mucosal epithelial cell; mitochondrial pathway; apoptosis近年来，十二指肠胃食管反流在胃食管反流病的发生发展过程 中所起的作用越来越受到国内外学者的重视，尤其是十二指肠反流物中的胆酸在胃食管反流病及其并发症(反流性食管炎、Barrett _s食管 以及食管癌)的发病中所起的作用及其对食道黏膜上皮细胞的损伤作 用。在多种十二指肠反流物

10、质中，胆酸被认为是较严重的损伤物质1， 并且一些胆酸可诱导细胞凋亡造成食管上皮细胞损伤24。线粒体途径是引起细胞凋亡的重要途径之一。线粒体的功能改变与细胞凋亡密切相关。许多因素，包括死亡受体介导的信号、促凋亡因子等，引起线粒体功能损伤可使线粒体跨膜电位(mitocho ndriamembrane potential, m)降低和 线粒体 通透性(mitochondria permeability transition, MPT)改变，使线粒体膜间隙存在的大量小分 子蛋白物质释放出来，并由此引起促凋亡物质释放等一系列变化，包括细胞色素c(cytochrome c, Cyt.c)、多聚(ADP_核

11、糖)聚合酶 poly(ADP ribose)polymerase, PARP、Omi/HtrA2 等细胞凋亡诱导 因子，从而诱导半胱天冬肽酶依赖和非依赖性细胞凋亡5 6。本课题的前期研究已经证实，胆酸(盐)能诱导食管黏膜上皮细 胞凋亡力9，但引起凋亡的通路尚不清楚。因此，本研究将探讨脱氧 胆酸(deoxycholate, DCA)在诱导食管黏膜上皮细胞凋亡时线粒体膜 通透性和膜电位在细胞凋亡中的作用，确定其是否通过线粒体途径诱 导细胞凋亡。1材料与方法1.1主要试剂 DCA购自Sigma公司;碘化丙碇、Annexin检 测试剂盒购自BD Biosciences公司;胎牛血清购自杭州四季青生物工

12、 程有限公司；蛋白酶抑制剂及罗丹明(Rhodamine, Rh123)购自美国 Sigma公司，罗丹明用三蒸水配成 10血/mL的储存液，4C避光保 存;Caspase _|3、PARP、Cyt.c、辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗购 自 Cell Sig nali ng Tech no logy,In c.;Caspase 3 特异抑制剂DEVDFMK购自美国Calbiochem公司，使用前溶解于 DMSO并分 装保存于-20 C; 3 act in的抗体购自江苏碧云天生物技术研究所。1.2细胞培养和处理 实验过程中，细胞以5X105细胞/mL的 密度接种培养，经DCA按实验设计所需时间和

13、浓度处理后，并在有/ 无Caspase 3抑制剂50呵ol/L DEVDjFMK预处理的情况下与所需 DCA 一起进行孵育。1.3流式细胞仪检测线粒体跨膜电位线粒体的检测按试剂盒说明书操作流程进行。实验分为对照组和实验组。大约5 X105细胞/mL用100 mol/L、200 mol/L的DCA在不同时间段诱导食管 细胞，收集细胞，PBS漂洗;10/mL的碘化丙碇（PI）于37 C中孵育 30min，PBS漂洗;250/mL的PI染色。Rh123和/PI的荧光强度由 Beckman Coulter公司的流式细胞仪检测。1.4蛋白免疫印迹法检测 Caspases和PARP的表达细胞用PBS 清洗

14、，用上样缓冲液（62.5mmol/L Tris HCI，pH 6.8，100mmol/L DTT，69mmol/L SDS，300mmol/L 甘油，10mg/L 溴酚蓝）裂解。总 蛋白经80120g/L的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移到硝酸 纤维素膜，用2g/L的丽春红染色以确定蛋白上样量是否相同。膜经 50g/L的脱脂奶粉室温封闭1h后，用Cyt.c、活化的Caspase_3（1 : 1000）和PARP（1 500，F2）的抗体4 C孵育过夜，经 PBS充分漂洗 后用HRP标记的二抗杂交。B _ act in抗体杂交，作为上样量的内参。1.5统计学分析 采用SPSS13.0统计学软件

15、进行数据分析。结 果以均数士标准差（s）表示，组间比较米用x 2检验和t检验，P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1 DCA诱导细胞凋亡时线粒体跨膜电位下降为了阐明DCA诱导食管黏膜上皮细胞凋亡的机制，我们首先通过PI和Rh123双染检测该胆盐对于线粒体m的作用。Rh123是一种亲脂性阳离子， 可发射绿色荧光，可被线粒体吸收，并且其吸收量与线粒体AWm成正比。正常的活细胞因为线粒体m高，所以其摄入的Rh123也高， 因此细胞会发出绿色荧光；而细胞发生凋亡时线粒体m会降低，从 而会减低对Rh123的吸收，细胞表现为Rh123低染。未处理的活细 胞可被Rh123染色，而未被PI染色。当食管黏

16、膜上皮细胞用100卩 mol/L的DCA处理后，PI阴性但Rh123低染的细胞在对照组为(1.8 ).6)%，36h 为(8.1 ).2)%，48h 为(30.5 .7)%(图 1A)，食管黏膜 上皮细胞用200 gol/L的DCA处理后，PI阴性但Rh123低染的细 胞36h可达(43.1 ).2)%(P0.05)(图1B)。PI阴性但Rh123低染细胞 的开始出现，并逐渐增加，DCA诱导的细胞凋亡时线粒体跨膜电位 的下降，表明凋亡细胞在逐渐增多。2.2 DCA诱导细胞凋亡时Cyt.c、Caspase 3和PARP的活化Cyt.c和活化的Caspase 3的抗体显示，随着线粒体AWm的下 降

17、，可检测到Cyt.c、Caspase _3酶原也被剪切活化，产生17kd的 活性片段(图2A)。与此相一致的是，在 DCA处理后，Casapsej3的 底物PARP也发生了降解活化(图2B)。2.3 Caspase _3抑制剂部分抑制 DCA诱导的细胞凋亡 用Caspase 3特异的抑制剂 DEVDFMK来研究Caspase 3在DCA诱 导食管上皮细胞凋亡中的作用。食管黏膜上皮细胞用50 mol/L的DEVDMK预处理1h，再加入DCA处理细胞，蛋白免疫印法结果 显示，DEVD FMK几乎可完全抑制DCA诱导的Caspase 3的活化(图 3A);annexin V/PI双染检测结果表明，细

18、胞凋亡也仅受到部分抑制。食管黏膜上皮细胞单用300 gol/L DCA处理12h能显著诱导细胞凋 亡，annexinV+/PI-细胞百分比为(34.3 0.5)%，而用 Caspase 3 抑 制剂DEVDFMK预处理组 annexin V+/PI-细胞百分比降至(17.4 0.3)%，两者有明显统计学差异(P0.05)，显示DCA的诱导细胞凋亡 效应显著降低(图3B)。2.4 Caspase |3抑制剂对线粒体跨膜电位的下降没有影响尽管蛋白免疫印法结果显示，DEVDFMK几乎可完全抑制 DCA诱导的 Caspase 3的活化(图3A);annexin v/PI双染流式细胞仪检测结果表 明，细

19、胞凋亡也仅受到部分抑制。然而， DEVDFMK预处理并不显 著影响DCA诱导的线粒体AWm的下降，DCA处理组为(31.2 ).7)%， 而DEVDFMK预处理组为(24.3 1.8)%，两者无显著统计学差异 (P0.05，图 4)。食管细胞经50呵ol/L DEVD JFMK预处理1h，再用300呵ol/L DCA处理12h，蛋白免疫印迹检测 Caspase J3，讨act in作为上样量 的内参。A :流式细胞仪检测 Ann exin V/PI;B : Caspase |3为活化 Caspase _|3;两者相比，*P0.05。3讨论十二指肠胃食管反流中的胆酸(盐)已被确认为胃反流病中的一

20、 种致病因子。DCA是十二指肠反流中的重要成分，参与了对食管黏 膜上皮细胞的损伤作用7【9。本实验结果证实，DCA可以引起食管 上皮细胞凋亡时线粒体 Cyt.c的释放和线粒体m的下降。在结肠 癌细胞系和其他细胞系中，胆酸（盐）对线粒体的毒性作用可使线粒体 功能异常，从而增加线粒体 Cyt.c的释放5,10 , Cyt.c会从跨膜电位 下降的线粒体的膜间隙中释放出来， 与Aparfl及ATP结合形成凋亡 体（apoptosome），激活 Caspase 9，活化的 Caspase _ 9 又可激活 Caspase 3，而活化的Caspase 3执行凋亡功能11。我们的结果显 示，胆酸诱导的细胞凋

21、亡伴有线粒体 m的下降、Caspase 3和 PARP的活化，但Caspase J3特异的抑制剂仅能部分削弱 DCA诱导 的凋亡。Casapse h途径部分参与了胆酸诱导的食管黏膜上皮细胞凋 亡，说明胆酸（盐）在不同细胞系中引起细胞凋亡的机制不完全相同。线粒体是细胞内重要的细胞器，线粒体功能改变与细胞凋亡密 切相关。许多因素，包括死亡受体介导的信号、促凋亡因子的释放、 活性氧过度生成、能量产生障碍、胞质内钙失衡等生长因子抑制剂及 毒素等，可以使线粒体的功能损伤，诱导细胞凋亡12。线粒体功能的损伤通过线粒体膜通透性增加介导，线粒体膜通透性转运孔道的开 放使线粒体膜间隙存在的大量小分子蛋白物质释放

22、出来，包括Cyt.c、Smac/DIABLO、Omi/HtrA2细胞凋亡诱导因子、核酸内切酶 G，诱 导半胱天冬肽酶依赖和非依赖性细胞凋亡56，13，Cyt.c释放被认 为是凋亡过程中的关键事件1415。胆盐对线粒体的毒性作用可使线 粒体功能异常，从而增加线粒体的Cyt.c的释放16。线粒体在细胞凋亡的发展过程中所起的重要作用，主要包括线粒体膜通透性转换 （MPT）的发生和细胞凋亡早期中线粒体跨膜电位（如）的降低，由此引起促凋亡物质释放等一系列变化，最终导致染色质浓集、DNA核小体间断裂等凋亡典型表现。线粒体内膜存在着一种质子泵，它将基 质内质子泵入外室，从而形成横跨线粒体内膜内正外负的线粒体

23、膜电 位，在几乎各种类型的细胞凋亡中，均出现 m下降，并且这种改 变发生于凋亡细胞的形态学改变之前，提示 m下降为凋亡早期阶 段现象。本研究结果显示，胆酸诱导的细胞凋亡伴有线粒体m的下降，提示胆酸诱导食管上皮细胞凋亡的早期有线粒体跨膜电位的变 化，线粒体途径也参与其诱导食管上皮细胞凋亡的过程。在细胞凋亡中起中心作用的是半胱氨酸蛋白酶(Caspases)家族成员，但它受到细胞线粒体途径的活化影响并相互作用。本实验观察到DCA作用后活化的Caspase 3增多，证实其诱导培养的正常食 管黏膜细胞的凋亡是以Caspase _3的激活为信号途径。但是，Caspase J3的激活是多种诱导凋亡信号的共同

24、途径。例如，在凋亡的死亡受体途径、线粒体和内质网 3种信号途径中均有Caspase 3的 激活。本研究结果显示，培养的正常食管黏膜细胞是通过线粒体信号 途径、Caspase _3系统来诱导食管黏膜细胞凋亡的。作为线粒体凋亡 途径的主要物质Bcl2蛋白家族调节着凋亡的发生，其主要是抑制凋 亡发生，其代表为 Bcl2、Bcljxl，而Bcl2家族的其他蛋白如 Bax和 Bad的表达增加则促进凋亡发生1719。胆酸通过Bcl2家族之一的 Bid诱导激活Bax。Bax是胆酸诱导的线粒体 Cyt.c释放的上游调控 者1619。Bax穿入定位到线粒体，就伴随着线粒体通透性转变和 Cyt.c的释放。Bcl2

25、蛋白家族在调节胆酸诱导食管上皮细胞凋亡中的作用尚需进一步研究。总之，DCA诱导食管黏膜上皮细胞凋亡可以通过线粒体途径， 引起了线粒体通透性增高和膜电位下降，Cyt.c的释放、Caspase 3和PARP的活化;抑制剂实验也证实，线粒体、Caspase _3的活化共 同参与了 DCA诱导凋亡的过程。【参考文献】1 JANKOWSKI JA, ANDERSON M. Review article: man ageme nt of oesophageal ade no carc inoma|con trol of acid, bileand in flammatio nin in terve nti

26、o nstrategies for Barrett _soesophagus J. Alime nt Pharmacol Ther, 2004, 20 (Suppl 5):7180.2 STEIN HJ, KAUER WK, FEUSSNER H.Bile acids as comp onents of the duode no gastric refluxate: detecti on, relati on ship to bilirubi n, mecha nism of injury, and cli nical releva nee J. Hepatogastroe nterology

27、,1999,46(25):66 J73.3 TORCHIA EC, STOLZ A, AGELLON LB. Differentialmodulati on of cellular death and survival pathways by conjugated bile acids J. BMC Biochem, 2001, 2(1):11.4 SCHLOTTMAN K, WACHS FP, KRIEG RC.Characterizati on of bile salt in duced apoptosis in colon can cer cell lines J. Can cer Re

28、s, 2000, 60(15):42704276.5 SCHLOTTMANN KS, WACHS FP, KRIEG RC, et al. Characterizati on of bile salt in duced apoptosis in colon can cer cell lines J. Can cer Res, 2000, 60(15):4270 J4276.6 RUPNIEWSKA Z, BOJARSKA JUNAK A. Apoptosis:mitochondrial membrane permeabilization and the role played by Bcl J

29、2 family protei ns J. Postepy Hig Med Dosw (On li ne),2004,58:538 547.7 张茹，龚均，王晖，等.脱氧胆酸诱导正常人食管黏膜 上皮细胞凋亡及其机制探讨J.第一军医大学学报，2005, 25(10):1240 J1243.8 张茹，龚均，史冉庚，等.胆汁反流对大鼠食管粘膜炎 症损伤和凋亡的作用J.四川大学学报：医学版，2006, 37(5):750 J753.9 ZHANG R, GONG J, WANG H, et al. Bile salts inhibit growth and in duce apoptosis of c

30、ulture huma n no rmal esophageal mucosal epithelial cells J. World J Gastroenterol, 2005, 11(41):6466 6471.10 WEBSTER CR, USECHAK P, ANWER MS. cAMP in hibits bile acid in duced apoptosis by blocki ng caspase activati on and cytochrome c release J. Am J Physiol, 2002,283:G727G738.11 HENRYMowatt J, DI

31、VE C, MARTINOU JC, et al.Role of mitoch on drial membra ne permeabilizati on in apoptosis and can cer J. On coge ne, 2004, 23:2850|2860.12 ORRENIUS S. Mitocho ndrial regulation of apop toticcell death J. Toxicol Lett, 2004, 149(1):1923.13 YERUSHALMI B, Dahl R, DEVEREAUX MW, et al. Bile acid i nduced rat hepatocyte apoptosis is in hibited by antioxidants and blockers of the mitochondrial permeability tran sition J. Hepatology, 2001, 33:616 J626.14 CHEN Q, GONG B, ALMASAN A. Dist inct stages ofcytochrome c release from mitochondria:evidenee for