植物细胞工程 zhongkai

1、绪论植物组织培养 ( plant tissue culture )，是指在无菌条件下，将植物体的任何一部分，或 器官、或组织、或细胞、或原生质体，培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养环境条 件进行离体培养，使之成为完整的植物体。植物体的任何一部分是指根、茎、叶、花、果以 及它们的组织切片和细胞。外植体 (explant )：在组织培养中，把由活植物体(in vivo )上切下来以进行培养的那部分组织或器官。按外植体的来源分为：(1) 器官培养(organ culture):是指用植物体的全部或部分器官原基接种于培养基上， 这些培养的组织块可经过脱分化、产生愈伤组织，并进而再经过分化培养成幼

2、苗。( 2)胚胎培养( embryo culture )：指以胚珠、幼胚、成熟胚的离体培养，也包括胚乳 培养或子房培养。常用幼胚作材料。( 3) 组织培养 ( tissue culture )：分生组织、形成层组织、表皮组织、薄壁组织等和各 种器官组织，以及其培养产生的愈伤组织的培养。( 4)细胞培养( cell culture )：通过愈伤组织的液体振荡培养法而获得游离细胞或细胞 群的培养。( 5)原生质体培养 ( protoplast culture )：将植物体细胞的细胞壁， 通过酶解使各细胞的 原生质体形成游离状态，再进行培养，包括原生质体培养、原生质体融合(细胞杂交)、原生质体的遗传

3、操作。第二章 培养基即基本培养基和附加成分。基本培养基的配方有几百PGR 和复杂的有机物质。培养基 ，是外植体生长的营养物质， 通常含有两个组成成分，基本培养基 是只含有无机营养成分和有机营养成分的培养基。种，常用的近 1020 种。完全培养基 ，是在基本培养基的基础上，根据要求添加一些一)根据含无机营养成分的浓度高低，把培养基分为高盐型、中盐型和低盐型。二)根据培养基凝固情况分为固体培养基和液体培养基1. 固体培养基 加入了适量的凝固剂的培养基，如琼脂、卡拉胶、明胶等。2. 液体培养基 没有加入凝固剂的培养基，主要用于细胞的悬浮培养，抗褐化培养。三、培养基的成分培养基的成分主要可分水、 无机

4、盐、有机物、 天然复合物、 培养体的支持材料等五大类。1、水 水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。它是生命活动过程中不可缺少的物质。 配制培养基母液时要用蒸馏水， 以保持母液及培养基成分的精确 性，防止贮藏过程发变质。大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。2、无机元素( inorganic element)2.1 大量元素，指浓度大于 0.5mmol/L 的元素，有 N, P, K, Ca, Mg, S 等。其作用是：( 1) N 是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，是培养 物生长、胚胎发生所必需的物质。

5、在制备培养基时以NO3-N和NH4-N两种形式供应。( 3) K 对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。2) P 是磷脂的主要成分。而磷脂又是原生质、细胞核的重要组成部分。磷也是ATP、 ADP等的组成成分。在植物组织培养过程中，向培养基内添加磷，不仅增加养分、提供能量，而 且也促进对 N 的吸收，增加蛋白质在植物体中的积累。K 增加时，蛋白质合成增加，维管束、纤维组织发达，对胚的分化有促进作用。(4)Mg、S和Ca、Mg 是叶绿素的组成成分，又是辅酶的活化剂；S是含S氨基酸和蛋白质组成成分。Ca是构成细胞壁的一种成分，Ca对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用，常以 CaCl2.

6、2H2O 提供。（ 5）微量元素指小于 0.5mmol/L 的元素， Fe、 B、 Mn、 Cu、 Mo、 Co 等。铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、 过氧化氢酶等的组成成分。同时， 它又是叶绿素形 成的必要条件。培养基中的铁对胚的形成，芽的分化和幼苗转绿有促进作用。B、 Mn、 Zn、Cu、 Mo、 Co 等，也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长发育异常 现象。高等植物一般不需要 Na+，但对喜盐植物重要，C4植物也需要。3. 有机化合物（ organic compound ）（1）碳水化合物糖类 在培养基中除了作为碳源和能源外，还具有维持培养基一定的渗透压作用，蔗糖约有

7、 1/4-2/5 用于保持培养基的渗透压。（2）维生素（ vitamin ）这类化合物在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活 动，对生长、 分化等有很好的促进作用。 虽然大多数的植物细胞在培养中都有合成所必需的 维生素，但在数量上还明显不足，通常需加入 1 至数种维生素，以便获得最良好的生长，主 要有VB1 （盐酸硫胺素）、VB6（盐酸吡哆醇卜VPP（烟酸）、VC（抗坏血酸）、有时还使用生物 素、叶酸、VB2等。一般用量为 0.11.0mg/L。有时用量较高。VB1可能是必需的，对愈伤 组织的产生和生活力有重要作用， VB6 能促进根的生长， VPP 与植物代谢和胚的发育有一 定关系

8、。 VC 有防止组织变褐的作用。（3）肌醇（ myo-inositol ）又叫环已六醇，在糖类的相互转化中起重要作用。 通常可由磷酸葡萄糖转化而成，还可进一步生成果胶物质，用于构成建细胞壁。（4）氨基酸（ami no acid）是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。培养基中最常用的甘氨酸。（ 5）天然复合物它的成分大多不清楚， 所以一般应尽量避免使用。4. 植物生长调节剂 （ plant growth regulator ）在培养基的各成分中， PGR 或植物激素是培养基的关键物质，其用量虽少，但对外植 体愈伤组织的诱导和器官的分化起着重要的和明显的调节性作用。（1）生长素类（auxin）在

9、组织培养中，生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根 的分化和促进细胞分裂、 伸长生长。 在促进生长方面， 根对生长素最敏感。 在极低的浓度下， （ 10-510-8mg/L ）就可促进生长，其次是茎和芽。天然的生长素热稳定性差， 高温高压或受光条件易被破坏， 在植物体内也易受到体内酶 的分解。组织培养中常用人工合成的生长素类物质。IAA （ in do acetic acid ）是天然存在的生长素，亦可人工合成，其活力较低，是生长素中 活力最弱的激素，对器官形成的副作用小，高温高压易被破坏，也易被细胞中的IAA 分解酶降解，受光也易分解。NAA （naphthalene acetic aci

10、d）在组织培养中的启动能力要比 IAA高出34倍，且由于 可大批量人工合成，耐高温高压，不易分解破坏，所以应用较普遍。NAA 和 IBA 广泛应用于生根，并与细胞分裂素互促进芽的增殖和生长。IBA （ indolebutyric acid 吲哚丁酸）是促进发根能力较强的生长调节物质，不易被过氧 化物酶分解，但价格较贵。2,4-D（ 2,4-二氯苯氧乙酸）启动能力比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效 应。作用强弱顺序： 2,4-DNAAIBAIAA 。生长素配制时可先用少量 95%酒精助溶。2,4-D可用0

11、.1mol/L的NaOH或KOH助溶。生长素常配成 1mg/ml 的溶液贮于冰箱中备用。（ 2） GA （ gibberellic acid ）赤霉素有 20多种，生理活性及作用的种类、部位、效应等 各有不同， 培养基中添加的是 GA 3，主要用于促进幼苗茎的伸长生长， 促进不定胚发育成小 植株；赤霉素还用于打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。一般在器官形成后，添 加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。一般用量为 0.1mg/L 。赤霉素溶于酒精， 配制时可用少量 95%酒精助溶。 赤霉素不耐热， 高压灭菌后将有 70%100% 失效，应当采用过滤灭菌法加入。（ 3）细胞分裂素类（ cyto

12、kinin ）有两类，一类是腺嘌呤的衍生物，包括6-BA （6-苄基氨基嘌呤）、 Kt（kinetin 激动素 ）、Zt（zeatin 玉米素 ）、2-iP（ 2-异戊烯腺嘌呤）等。另外一类是 苯基脲类，主要有吡效隆（4PU , CPPU）和噻重氮苯基脲（TDZ ）。在培养基中添加细胞分裂素有 3 个作用：1、促进细胞分裂和分化，增强蛋白质的合成，延缓组织的衰老。2、诱导芽的分化，抑制顶端优势，促进侧芽萌发生长。细胞分裂素与生长素相互作用， 当组织内细胞分裂素 /生长素的比值高时，诱导愈伤组织或器官分化出不定芽。3、抑制根的分化。因此， 细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化、 茎、苗的增殖， 而避

13、免在生根培养时使用。 作用的强弱顺序为： TDZ, 4PU ZT 2-iP BA KT 。但在组织培养中常用的是人工合 成的、性能稳定的 BA 和 KT。价格（美元 /g） BA 5.25 , 2-ip 26 , ZT 735 , TDZ 2500。生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向， 是长愈伤组织、 长根还是长芽。 如为了 促进芽器官的分化， 应除去或降低生长素的浓度， 或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的 比例。PGR的使用甚微，一般用 mg/L表示浓度。在组织培养中生长调节物质的使用浓度，因 植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异，一般生长素浓度的使用为0.055mg/L,细

14、胞分裂素 0.0510mg/L 。5. 培养材料的支持物（1）琼脂（agar）在固体培养时琼脂是最好的固化剂。琼脂是一种由海藻中提取的高 分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。6. 抗生物质 （antibiotic）抗生物质有青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在 520mg/L 之间。添加抗生物质可防 止菌类污染， 减少培养中材料的损失， 尤其是快速繁殖中， 常因污染而丢弃成百上千瓶的培 养物，采用适当的抗生素便可节约人力、 物力和时间。 尤其对大量通气长期培养， 效果更好。7、抗氧化物（ antioxide ）植物组织在切割时会溢泌一些酚类物质， 接触空气中的氧气后， 自动氧化或由酶类催化 氧

15、化为相应的醌类， 产生可见的茶色、褐色以致黑色，这就是酚污染。 这些物质渗出细胞外 就造成自身中毒，使培养的材料生长停顿，失去分化能力，最终变褐死亡。8、活性炭 （ active ca rbon ） 活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉沫结构，它结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用，它的颗粒大小决定着吸附能力、粒度越小，吸附能力越大。茎尖初代培养，加入适量活性炭，可以吸附外植体产生的致死性褐化物，其效力优于 VC 和半胱氨酸；在新梢增殖阶段，活性炭可明显促进新梢的形成和伸长，但其作用有一个 阀值，一般为 0.1%0.2%，不能超过 0.2%。活性炭在生根时有明显的促进作用，其机理一般认为与活

16、性炭减弱光照有关，可能是 由于根顶端产生促进根生长的 IAA ，但 IAA 易受可见光的光氧化而破坏，因此活性炭的主 要作用就在于通过减弱光照保护了 IAA ，从而间接促进了根的生长， 由于根的生长加快， 吸 收能力增强，反过来又促进了茎、叶的生长。此外，在培养基中加入 0.3%活性炭，还可降低玻璃苗的产生频率，对防止产生玻璃苗 有良好作用。活性炭在胚胎培养中也有一定作用，如在葡萄胚珠培养时向培养基加入0.1% 的活性炭可减少组织变褐和培养基变色，产生较少的愈伤组织。但是，活性炭对物质的吸附是无选择性的，既吸附有害物质，也吸收有利物质第二节 培养基的制备一、母液（ stock solution

17、 ）的配制和保存 在植物组织培养工作中， 配制培养基是日常必备的工作。 为简便起见， 通常先配制一系 列母液， 即贮备液。 所谓母液是欲配制液的浓缩， 这样不但可以保证各物质成分的准确性及 配制时的快速移取， 而且还便于低温保藏。 母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁 盐、有机物和 PGR 类等。配制好的母液瓶上应分别贴上标签，注明母液名称、配制倍数、日期及配 1L 培养基时 应吸取的量。二、培养基的配制1琼脂溶解 用瓷量杯装蒸馏水或自来水 300ml，加入琼脂条（或琼脂粉）5-7g，边加热 边搅拌，防止糊底。旺火煮开，再用文火加热，直至琼脂全部融化即清澈见底为度。2称好20-30g蔗糖

18、，趁热加入瓷量杯中溶解。3按表用量筒分别移取大量元素母液1、2、3 10ml，用专一对应的移液管分别吸取微量元素母液1 5ml、2 0.5ml、铁盐母液5ml、有机物母液5ml，均置入1烧杯中，若不加任何 激素，则为 MSO 培养基；若需加激素按配方移取激素母液即可。将所有母液的混合液加入 瓷量杯中，定容至 1000ml。4. pH调整 培养基配好后，用 0.1mol/L的NaOH或HCI液将培养基的pH值调整为6.0 左右。调后注意一定要摇动均匀，还要注意酸或碱液不要放置时间太久。三、培养基的分装与灭菌培养基合成后要趁热分装，100ml的容器约装入2530ml培养基，即1L培养基约装33-4

19、0 瓶左右。太多则浪费培养基，太少不易接种和影响生长。 但要根据培养对象来决定。如果培 养时间较长时， 应适当多装培养基， 生根等短期培养时， 可适当少加培养基。分装时不要把 培养基弄到管壁上，以免日后污染。装后用封口材料包扎瓶口，扎口后，写上培养基种类， 准备灭菌，注意不能放置时间过长，以免产生污染。培养基用高压灭菌。灭菌好的培养基不要放置时间太长，12 周用完，最多不能超过 1个月。第三章 植物材料与处理 第一节 植物材料的选择与处理 二、母树（株）和外植体的预处理 植物材料的预处理，近来被重视和研究的较多，国际上把这一阶段定名为Stage O， 目的有二， 其一是为获得比较清洁的材料，

20、其二是为了改变母株或外植体的生理状态， 使接种 后能更好地生长分化。（一）栽培管理1不要连作 以免土传病虫害的加剧，特别是对地下球茎、鳞茎或根茎等作材料的，危 害更大。此外，连作还会有矿质营养元素缺乏、作物根系分泌物的毒性危害等。2基质或无土栽培 最好使用蛭石、珍珠岩、泥炭等基质进行栽培，如果是土壤作基质， 在栽种前要用药物或蒸汽进行灭菌处理。3. 施肥和灌溉控制 基肥应在取材前 12 个月进行，追肥应使用化肥，不要使用喷灌， 避免将水、肥浇到植株上，以保证田间的清洁，减少病菌活动的机会。4. 病虫害防治 以确保植株的健壮生长，特别是临近取材前，更应用杀菌剂、抗生素处 理。如在采集外植体前用敌

21、菌丹（captatol）或异菌脲（iprodione）杀菌剂处理田间的披散山龙眼母树，使污染从对照的 90%减少至 14%。 Mondal 等在采集材料前， 向番木瓜植株喷 1000mg/L 的庆大霉素 （gentamycin） ，采芽后再用庆大霉素进行处理。5. 适宜的环境 要求场地开阔、阳光充足、通风透气。最好在能控制光照、温度、湿度 的温室或人工气候室内栽培， 创造生长发育的最适条件， 促使植物的生长代谢活跃， 外植体 的生理状态得到改善。（二）田间母株的处理1. 光照1.1 光周期 对光周期敏感的植物， 在控制光周期条件下培养， 可以得到对培养条件反映 更稳定的外植体。如高温和长日照处

22、理秋海棠植株叶片有利离体条件下的分化。1.2光质 光质对矮牵牛的生长有影响， 最后一次是红光， 植株分枝多， 远红光则不分枝， 前者的叶片在培养时芽的分化比后者要多 3 倍。1.3 黑暗或黄化（ etiolation ）长时间的黄化处理，有利于板栗、苹果成年树的茎尖培养 或侧芽的分化，黑暗被广泛用于木本植物母树的预处理，以减少褐化和内源菌的污染。2. 温度2.1低温促进花药培养如大白菜花药培养中在3-5 C下48-72hr,可以促进胚状体形成；打破休眠 如某些鳞茎、木本植物的种胚和芽存在休眠期，需要低温处理。如花棱草种子需 要低温休眠，胚培养时需给予2周6 C的处理。防止酚污染，如核桃茎段机关

23、5 C 12-24hr处理可减少褐变。2.2 高温 脱去植株的部分病毒。3. PGR 的预处理对母树的处理一般用喷洒， 有时也用注射的方法。 木本植物用 100-1000mg/L 6-BA 处理 可提高茎尖培养的成功率。用 CCC 处理番茄可使外植体芽的分化大量增加。将矮牵牛叶片 在 400mg/LKT 中浸 5s-10min ，可较大地促进芽分化。（三）从田间或野外采集后的材料处理1. 在温室或人工条件下培养一段时间，或在树上套袋，使用新生的部分。2. 木本植物枝条取回后用水冲洗干净后插入无糖的培养液或自来水中，使其发枝，然后以这种新抽的嫩枝作为外植体。一些木本植物的茎尖外植体用催芽溶液（f

24、orcing solution）（基本成分为八羟基喹啉 8-hydroxyquinole citrate 200mg/L ， 6-BA100-800mg/L 和 GA10-100 mg/L，蔗糖2%）处理，常可提高培养的成功率。一般做法是将木本植物的外植体有forcingsolution处理一段时间（24hr）再接种到培养基上。3. 黄化处理 在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养，待抽出徒长的黄化枝条时取 材，如使用仙客来黄化的叶柄进行培养时，可控制内生菌的污染。4热击Langens等将美丽百合（Lilium speciosum）的鳞茎外植体放入试管中进行43C热击处理，罗伯利械的休眠芽进行

25、42.5C或45C热击处理，可有效地减少内生菌污染。5. 用抗生素进行预培养朱光廉对相思树的芽和茎段灭菌时， 用皂液刷洗和乙醇杀菌后，转入0.2%苯菌灵（benlnete）和0.2%链霉素溶液中，在摇床上振荡过夜。湿热灭菌 即高压蒸汽灭菌，是最有效的一种方法。布类（如工作服、口罩）、胶塞、金属器械、 玻璃器皿以及某些培养用液都可用此法灭菌。 培养基在制备后的 24h 内完成灭菌 工序。第二节 外植体灭菌1. 茎尖、茎段、叶片灭菌的方法 （1）植物的茎、叶部分多暴露在空气中，易受到泥土、肥料中的杂菌污染。将采来的 材料除去不用的部分， 表面不光滑或长有绒毛难以洗净的材料， 要用毛刷充分刷洗。 把

26、材料 切割成适当大小，即灭菌容器能放入为宜。置自来水龙头下流水冲洗几 min 至数小时，冲 洗时间视材料清洁程度而宜。 易漂浮或细小的材料， 可装入纱布袋内冲洗。 流水冲洗在污染 严重时特别有用。洗时可加入洗衣粉清洗， 然后再用自来水冲净洗衣粉水。 洗衣粉可除去轻度附着在植物 表面的污物，除去脂质性的物质，便于灭菌液的直接接触。当然， 最理想的清洗物质是表面 活性物质吐温。洗后的材料用滤纸吸干水分。（ 2）对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成，准备好灭菌的烧杯、玻璃 棒、75%酒精、灭菌液、无菌水等。用75%酒精浸泡1030s, 些特殊的材料，如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗，多

27、层鳞片的休眠芽等等，以及主要取用内部的材料，则可 只用 75%酒精处理稍长的时间。处理完的材料在无菌条件下，待酒精蒸发后再剥除外层， 取用内部材料。（3）用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多，可根据情况选取12 种使用见表 4-5。上述灭菌灭剂应在使用前临时配制，氯化汞可短期内贮用。灭菌时，把植物材料转放到烧杯或其他器皿中，记好时间，倒入灭菌溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与灭菌溶液充分接触，驱除气泡，使灭菌彻底。在快到时间之前 12min ，开始把灭菌液倾入一备好的大烧杯内，要注意勿使材料倒出，倾净后立即倒 入无菌水， 轻搅刷洗。灭菌时间是从倒入灭菌液开始，至倒入无菌水时为止。记录

28、时间还便 于比较灭菌效果，以便改正。灭菌液要充分浸没材料，宁可多用些灭菌液，切勿勉强在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌。在灭菌溶液中加吐温 -80 或 Triton X 效果较好，这些表面活性剂主要作用是使药剂更易 于展布， 更容易浸入到灭菌的材料表面。 但吐温加入后对材料的伤害也在增加， 应注意吐温 的用量和灭菌时间，一般加入灭菌液的 0.1-0.5%。最后一步是用无菌水刷洗，刷洗要每次 3min 左右，视采用的灭菌液种类，刷洗 310 次左右。无菌水刷洗作用是免除灭菌剂杀伤植物细胞的副作用。2. 其他外植体灭菌的方法（1） 果实和种子的消毒视果实和种子的清洁程度，先用自来水冲洗1020

29、min，甚至更长时间。再用 75%酒精迅速漂洗一次。果实用 2%NaCI0溶液浸10min，后用无菌蒸馏 水冲洗 23 次后，就可取出果实内的种子或组织进行培养。种子则先要用10%NaClO 溶液浸泡2030min，对难以消毒的还可以用 0.1%汞或1%2%溴水消毒5min。（2）根及地下部器官的消毒 由于它们长在土壤中，可预先用自来水冲洗、软毛刷 刷洗，再用纯酒精漂洗后， 置于 0.1%0.2% 升汞浸 510min 或 2%NaCI0 溶液浸泡 1015min ， 然后以无菌水冲洗 3 次， 用无菌滤纸吸干水分后即可接种。 若条件许可， 还可将材料浸入消 毒液中进行抽气减压，以帮助消毒液渗

30、入，达到彻底灭菌的目的。（ 3）花药的消毒通常用于组织培养的花药，实际上多未成熟，由于它的外面有花萼、花瓣或颖片保护，基本上处于无菌状态， 故只需将整个花蕾或穗消毒即可以了。一般用 75%酒精浸泡数秒钟，然后用无菌水冲洗23次，再在漂白粉上清液中浸泡10min，经无菌水冲洗 23 次即可接种。3. 难灭菌材料的特殊方法（ 1）间隙灭菌法 按常规灭菌后，将外植体培养在一不含 PGR 和维生素的简单培养基 上 20-24hr ，取出，再消毒一次，接入正式培养基中。（2）预培养法 将植物材料放入混和抗生素和杀菌剂的溶液中振动培养 4-12 小时， 然 后再按常规灭菌程序消毒。（ 3）减压抽滤法 将植

31、物材料放入杀菌剂中， 减压抽去植物组织中的气体， 使杀菌剂更 容易进入组织，维持数 min 后，取出再按常规方法消毒。（ 4）培养基中加入抗生素、杀菌剂法在培养基中加入少量的抗生素 10-20mg/L ，能有效地抑制细菌的生长；加入一些杀菌剂如甲基托布津、多菌灵等，也有一定的杀菌作用。外植体大小目前许多植物的茎尖培养表明，外植体（茎尖）越小成活率越低。因此除非用于去除 病毒，否则不宜将外植体切得太小。在甘蔗心叶愈伤组织的培养中发现，材料大小对分化生长有明显的影响（表3 1）。通常情况下，叶片、花瓣等面积约为5mm2，茎段则长约0.5-1.0cm。但并不是说外植体越大越好，外植体过大，不易彻底灭

32、菌。如木薯，只有在 2mm 以上长的茎尖才能形成完整植株； 长度不到 2mm 的茎尖仅产生愈伤组织或根。但脱毒培养多用较小的外植体，如麝香石竹用 2mm 大小的外植体时只长根，而用 7.5mm 大小的外植体培养则仍有病毒存在。此外，外植 体的大小与褐变及玻璃化有关。如金冠苹果茎尖小于0.5mm 时褐变严重；当茎尖长度在515mm 时褐变较轻，成活率可达 85%（蒋迪军、牛建军，1 992）。第三节 无菌操作技术一、接种前的准备接种时由于有一个敞口的过程， 所以是极易引起污染的时期， 这一时期主要由空气中的 细菌和工作人员本身引起。 为了做好接种前的准备工作， 宜制定出分门别类的操作卡片， 包

33、括操作程序（Protacol / Procedure）卡片，如过滤灭菌液加入培养基的分装、外植体接种、 继代培养等等。各卡片上记有需用器材和物品名称、要求及数量等，这对初学者尤为重要。1. 接种室内消毒 保持定期用 1 %3%的高锰酸钾溶液对设备、墙壁、地板等进行擦洗， 并用甲醛熏蒸接种室。2. 洗手和着装接种员的头发、衣服、手指都不同程度地带有许多杂菌，先剪除指甲，用 肥皂洗净双手，最好再用 0.2%新洁尔灭溶液擦洗或浸泡 1 0min ；在缓冲间换好专用实验服， 戴上帽子，并换穿拖鞋等；3. 培养皿、 酒精灯和其他工具应事先放在超净工作台上，并用 75%酒精擦洗或喷洒消毒。工作台面上的用品

34、要合理布局，原则上应是右手使用的东西放在右侧，左手用品放在左侧， 酒精灯置于中央。如图。4在接种前打开超净工作台的风机，接种前用紫外灯照射 20-30min，接种室空间大的需用30-50min。超净工作台也有紫外灯，主要用于消毒台面上用品，对台面流动的空气无意 义。紫外灯照射后15min，操作人员方可入内。5. 在使用期间用 75%的酒精或 3%的来苏儿喷雾，使使空气中的细菌和真菌孢子随灰尘 的沉降而沉降。6. 上工作台后，经常用 75%酒精棉球擦拭双手，特别是指甲处。7. 超净工作台面要用 0.2%新洁尔灭或 75%酒精擦洗，使超净工作台对接种环境污染的 控制更有成效。8. 点燃酒精灯或煤气

35、灯，先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪刀从头至尾过火一 遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干。9. 工作人员的呼吸所产生的污染，主要是在接种时谈话或咳嗽所引起的，因此，在操作 时应禁止谈话并应戴上口罩。注意： 不要把东西迎面堆的太高，以免挡住气流。二、接种接种是将已灭菌好的根、茎、叶等离体器官，经切割或剪裁成小段或小块，放入培养基 的过程。以上已叙述接种前的材料表面的灭菌消毒，现将接种前后的程序连贯地介绍。1. 将初步洗涤及切割的材料放入烧杯， 带入超净台上， 用消毒剂灭菌， 再用无菌水冲洗， 最后沥去水分，取出放置在灭过菌的4 层纱布上或滤纸上。2. 材料吸干后，一手拿镊子，一手拿

36、剪刀或解剖刀，对材料进行适当的切割。如叶片切成 0.5cm 见方的小块； 茎切成含有一个节的小段。 微茎尖要剥成只含 12 片幼叶的茎尖大小， 需要在双筒实体显微镜下放大操作。 分离工具一定要放好， 工具要锋利且切割动作要快， 防 止挤压，以免使材料受损伤而导致培养失败。注意：接种时要防止交叉污染发生， 因此刀和镊子等接种工具每次使用前都应放入 75% （或 95%）酒精中浸泡，然后在火焰上反复灼烧，放凉后才接种，否则会烫伤外植体。使 用后的工具仍然插入盛有酒精的瓶中。在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。（ 3）用灼烧灭菌过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。具体操作过程是：

37、 左手拿试管或三角瓶，用右手轻轻取下包头纸，以免纸上的灰尘飞扬， 造成污染。 将试管几 乎水平拿着， 使试管口靠近酒精灯火焰， 并将管口在火焰上方转动， 使管口里外灼烧数秒钟。 若用棉塞盖口，可先在管口外面灼烧，去掉棉塞，再烧管口里面。注意， 打开瓶盖时， 最大污染的机会是管口边缘的微生物落入管内， 因为试管或容器在 贮存期间积累了少量的灰尘；另外，灭菌冷却时，在管口形成负压，当开盖时，空气进入而 带入灰尘。所以，试管应斜拿，利用酒精灯火焰附近气流上升，以减少灰尘的落入；开盖前 要用火焰转动灼烧瓶口，把灰尘固定在瓶口上，以杀死菌类。然后用镊子夹取一块切好的外植体送入试管内， 轻轻插入培养基上。

38、 若是叶片直接附在 培养基上，以放 13 块为宜。至于材料放置方法，茎尖、茎段要正放（尖端向上）或横放， 叶片要将叶背接触培养基（叶背比叶表有更多的气孔，利于吸收水分和养分） ，其他尚无统 一要求。 放置材料数量现在倾向少放， 通过统计认为： 对外植体每次接种以一支试管放一枚 组块为宜，这样可以节约培养基和人力，一旦培养物污染可以抛弃。操作时动作要准确敏捷， 但不必太快，以防空气流动，增加污染机会。 不能用手触及已 消毒器皿， 如已接触， 要用火焰灼烧消毒触及部。 接完种后， 将管口在火焰上再灼烧数秒钟。 并用棉塞，塞好后，包上包口纸，包口纸里面也要过火。所有材料接种完毕，做好标记，注明接种植

39、物和处理名称，接种日期。注意接种时， 接种员双手不能离开工作台， 接种完毕后要清理干净工作台， 可用紫外灯 灭菌 30min 。若连续接种，每 5 天要大强度灭菌一次。第四章 灭菌与无菌操作 常用的灭菌方法可分为物理和化学两类，即：物理方法如干热（烘烧和灼烧） 、湿热（常压 或高压蒸汽） 、射线处理（紫外线、超声波、微波） 、过滤等；化学方法是使用升汞、甲醛、 过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精等化学灭菌剂。这些方法 和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。（一）物理灭菌法1. 射线灭菌 主要是指使用 60Co、 X 射线和加速器等发出的辐射，能消毒灭菌，适用于

40、灭菌量大和不适合做高压或过滤灭菌的培养器皿，如塑料制品。2. 紫外线灭菌 是目前各实验室常用的灭菌法，方便，效果好。适用接种室、超净台上 或接种箱里的灭菌。 适用空气、 操作台表面和一些不能使用其他方法消毒的培养器皿 （如塑 料培养皿，培养板等）的灭菌。紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌，细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。紫外线的波长为200300nm ，其中以 260nm 的杀菌能力最强。培养室的紫外线灯应距离地面2.5m，使每cm2有0.06微瓦能量的照射，才能发生有效的灭菌作用。经紫外线照射20、 40、60min 后，空气中细菌数分别下降71%， 7

41、9%， 86%，说明用紫外线灭菌， 经一定时间后能杀灭空气中的大部分细菌。 其缺点是产生臭氧， 污染空 气，对身体有害。由于紫外线的穿透物质的能力很弱，3-5mm 厚的玻璃就能阻挡射线；射线照射不到的部位起不到灭菌作用。故灭菌时，物品不宜相互遮挡。紫外线对细胞、 试剂和培养液都有不良影响， 对人皮肤和眼睛也有伤害， 应该避免边照 射边进行操作。3. 微波炉（红外线）灭菌 适用少量的培养基灭菌，但灭菌的时间、沸腾问题的解决和 灭菌的效果有待实验确定。4. 干热灭菌 主要用于玻璃器皿的灭菌。干热灭菌后的器皿干燥，易于贮存。干热灭菌是利用烘箱加热到160180 C的温度来杀死微生物。由于在干热条件下

42、，细菌的营养细胞的抗热性大为提高，接近芽孢的抗热水平，通常采用170C持续90min来灭菌。干热灭菌的物品要预先洗净并干燥， 工具等要妥为包扎， 以免灭菌后取用时重新污染。 包扎 可用耐高温的塑料。 灭菌时应渐进升温， 达到预定温度后记录时间。 烘箱内放置的物品的数 量不宜过多，以免妨碍热对流和穿透，到指定时间断电后，待充分冷凉（60C以下），才能打开烘箱， 以免因冷空气骤然进入引起玻璃炸裂， 影响灭菌效果。 干热灭菌热传导慢， 能源 消耗太大，浪费时间。金属器械如解剖刀、剪刀等，高温会使刀口钝化；橡胶、塑料制品也 不能使用该法。5. 湿热灭菌 即高压蒸汽灭菌，是最有效的一种方法。布类（如工作

43、服、口罩）、胶塞、金属器械、 玻璃器皿以及某些培养用液都可用此法灭菌。 培养基在制备后的 24h 内完成灭菌 工序。高压灭菌的原理是： 在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢， 压力不断上升，使水的沸 点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在O.IMpa的压力下，锅内温度达 121 C。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。（细菌的芽孢在 100C的沸水中能生存好几个小时。 ）注意应完全排除锅内的空气， 使锅内全部是水蒸汽， 灭菌才能彻底。 高压灭菌放气有几 种不同的做法，但目的都是要排净，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放 气阀，通电后，待压力上升到 0.05Mpa

44、 时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后， 再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达到 O.IMpa时，开始计时，维持压力0.10.15Mpa , 20min 。高压灭菌前后的培 养基，其 pH 值下降 0.20.3 单位。 高压后培养基 pH 值的变化方向和 幅度取决于多种因素。在高压灭菌前用稀碱适当调高 pH 值。培养基成分单一时和培养基中 含有高或较高浓度物质时， 高压灭菌后的 pH 值变化幅度较大， 甚至可大于 2 个 pH 值单位。 环境 pH 值的变化大于 0.5单位就有可能产生明显的生理影响。高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖， 从而改变培养基的渗透压。 在 8%20

45、% 蔗糖范围内，高压灭菌后的培养基渗透压约升高0.43 倍。培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解， 可使 15%25%的蔗糖水解为葡萄和果糖。 培养基 pH 值小于 5.5，其水解量更多，培养基中添加 0.1%活性炭时，高压下蔗糖水解大大 增强，添加 1% 活性炭，蔗糖水解率可达 5%。实验中， 应在瓶盖上进行标记， 以防止不同培养基的混淆。 如用一般墨水在灭菌前写上， 灭菌后容易被消除掉。可用CoCl2.6H2O 2g、30%HCl 10ml 、蒸馏水 88ml 配成墨水写字，经高温后可现出字迹。6. 灼烧灭菌 适用金属器械类。在无菌操作时，把镊子、剪刀、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之

46、前取出在酒精灯火焰上灼烧灭菌。冷却后，立即使用。操作中可采用250 或500ml 的广口瓶，放入 95%的酒精，以便插入工具。7. 过滤灭菌 一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的， 不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法。在无菌条件下，当已经灭菌过的培养基冷却至50 C后，加入不耐热的物质。（二）化学灭菌法1. 灭菌方法（ 1）熏蒸灭菌 用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中， 以杀死空气和物体表面的微生物。 这种方法简便， 只需要把灭菌的空间关闭紧密即可。 熏蒸 时，房间可预先喷湿以加强效果。（ 2）喷雾灭菌 一些物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾

47、灭菌，如工作人员的皮肤、操 作台表面、 无菌室内的桌椅、 墙面、 空气和植物材料表面等。化学制剂有来苏儿 （1%2%）、新洁尔灭（ 0.25%1% ）、过氧乙酸和 75%的酒精等。（3）浸泡灭菌 从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。这些污 染一旦带入培养基， 便会造成培养基污染。因此， 植物材料常用化学灭菌剂浸泡， 进行表面 灭菌处理。2. 灭菌剂种类、作用与评价化学灭菌剂的种类很多， 它们使微生物的蛋白质变性， 或竞争其酶系统， 或降低其表面 张力，增加菌体细胞浆膜的通透性，使细胞破裂或溶解。一般说来，温度越高，作用时间越所以要制成水溶状态，但石炭酸和酒精例外。58ml/

48、m 3 用量，将甲醛长，杀菌效果越好。 另外，由于灭菌剂必须溶解于水中才能发挥作用， 如升汞与高锰酸钾。 还有灭菌剂的浓度一般是浓度越大杀菌能力越强， 石炭酸（ C6H5OH）， 3%-5% ， 5%以上对感觉神经有麻痹作用。（ 1）熏蒸剂 甲醛，常用熏蒸剂，熏蒸时，房间关闭紧密，按 置于广口容器中，加 24g/m3 高锰酸钾促使甲醛迅速挥发，熏蒸密闭 1224hr 。高锰酸钾 2%5% ，杀菌力很强，酸性条件下能提高其杀菌作用。冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效果不如甲醛。乳酸蒸汽对空气消毒十分有效， 但刺激味较强， 常用于无菌室内或周围环境的定期消毒。 消毒时， 将少许乳酸放入一平皿或开口较大的

49、容器内， 下方用酒精灯加热， 使乳酸挥发弥漫 整个室内。（ 2）喷雾或擦拭消毒剂 来苏儿对皮肤有刺激性，不宜用作皮肤的消毒剂； 新洁尔灭（溴代十二烷基二甲基卞基胺），阳离子型表面活性杀菌剂，使用浓度0.1%0.25% ，通过阳电荷结合破坏菌体外膜结构，导致蛋白质变性。常用于器械、皮肤和 操作表面的浸泡和擦拭消毒。酒精（ 75%），和新洁尔灭一样，也是实验室常用的杀菌剂，但不能杀灭真菌。过氧乙酸CH3COOOH，在0.5%浓度10min即可将芽孢杀灭， 消毒能力较强， 可用作各 种物品的表面消毒。 使用时用水稀释，用喷洒和擦拭方法消毒。但稳定性差，稀释液有效期 短，只能维持 3 天左右。（3）浸

50、泡杀菌剂75%酒精 具有较强的穿透力和杀菌力，常作为表面灭菌的第一步，它具有浸润和灭 菌的双重作用， 但不能达到彻底的灭菌， 必须结合其他药剂灭菌。 有时，为了提高乙醇的杀 菌效果，可在乙醇溶液中加入 0.1%的酸或碱，因为 日+和OH-可改变细胞表膜带电荷的性质 而增加膜透性，提高乙醇的杀菌效果。由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用，加之 75%酒精穿透力强，能使植物组织内的物质溶解，蛋白质变性，杀伤植物细胞，所以浸润时 间不能过长，通常外植体浸入 1530s 即可。升汞（Hgcl2）是有剧毒的重金属盐杀菌剂，其杀菌原理是Hg+可与带负电荷蛋白质结合，使菌体蛋白变性，酶失活。其使用浓度为0

51、.1%0.2% ，一般浸泡 612min ，就可有效地杀死附着在外植体表面的细菌及真菌芽孢， 是一种极有效的杀菌剂， 灭菌效果极好。 但用升 汞灭过菌的外植体材料要用无菌水反复多次冲洗， 洗去残留的汞， 否则对培养的外植体会产 生毒害作用。通常用无菌水冲洗不得少于5 次，每次不少于 3min ，以尽量去除残毒。次氯酸钠（ NaclO） 用市售的“安替福民”配制 2%10%的 NaClO ，灭菌时只需浸泡 530min，再用无菌水冲洗 45次即可。由于它可分解出具杀菌作用的氯气，灭菌处理后易 于除去，不留残留，既有强杀菌力，又对植物无害，是组培中常选用的杀菌剂之一。漂白粉 一种常用的低毒有效的消

52、毒剂，一般含 10%20% （重量 /体积）的 Ca（ClO） 2使用浓度一般为 5%10% 或其饱和溶液。它易吸潮散失有效氯而失效，故要密封、避光、 干燥贮藏，但贮藏不能超过一年，应随配随用。双氧水或称过氧化氢 是分解中释放原子态氧来杀菌的，常用 6%12%的双氧水溶液处 理外植体材料， 灭菌效果也相当好， 加上该药剂在外植体表面容易除去， 又不会损伤外植体， 通常用于叶片的灭菌。新洁尔灭 是一种广谱表面活性灭菌剂。 它对绝大多数植物外植体伤害很小， 效果很好。 通常使用1： 200稀释液，刷洗、浸泡外植体 30min，甚至可更长的时间。在用上述药剂进行接种材料的灭菌处理时， 为了使休养菌剂

53、湿润整个组织， 还需在药液 中加入润湿剂。如加入数滴或直至 0.1%的湿润剂吐温（ Tween） 80 或吐温 20。有时还可以 用磁力搅拌、超声振动等方法使杀菌剂达到外植体表面，灭菌彻底。虽然在植物组织培养中通常都以升汞或次氯酸钠来进行外植体灭菌，但二者在常规灭菌剂量范围内均可对植物材料产生多种生理影响。 如汞会抑制 IAA 对细胞壁的影响， 而 NaClO 会影响灭菌的黄瓜种子， 其发芽系数低于用升汞灭菌的， 但苗高、 苗重、 子叶重、 子叶开度、 叶绿素含量和可溶性蛋白质含量都比升汞灭菌时高。 因此， 在选择消毒剂时， 除了考虑灭菌 效果和清除残留物的难易程度外，还应适当注意灭菌剂对外植

54、体的生理影响。（三）抗菌素消毒 主要用于培养基。第六章 植物组织培养中的污染和防止“污染” 概念应是： 凡混入培养环境中对组织和细胞生存有害的成分都应视为污染。 因此，污染应包括以下两大类；微生物：真菌、细菌、酵母菌、支原体和病毒；通常说的污染主要是前三者，因微 生物来源不同，又分为外源菌污染和内源菌污染。化学物：主要是指醌引起的褐化，又叫酚污染。一、污染的途径（一）空气接种室和培养室的空气是扩散微生物的主要途径。二）培养器皿和培养基 培养器皿和容器洗刷不干净残留污染物，培养基消毒不彻底，培养基放置时间过久积 累灰尘，都可引入有害物。（三）操作 操作中马虎、接种动作不准确、灭菌观念不强，使用的

55、器械沾染了微生物，或封瓶口 时不严，都可发生污染。（四）外植体 初代培养中外植体污染比较普遍，有的是消毒时间不够，有的是含菌量 多或体内带菌，难于灭菌。二、细菌性污染1. 症状 培养基表面或培养物附近出现粘液状菌落，或浑浊的水迹状痕迹，或有泡沫的 发酵状情况。有的菌落有红、黄、绿等色素，有的色素溶于水，间有不溶于水，散布于培养 基的。3. 污染原因 外植体消毒不彻底； 培养基灭菌时，高压灭菌锅末排尽冷空气，灭菌压力不够，或温度不够，或持续时间 不够； 使用了末消毒好的工具，手接触了外植体或器皿的边缘等交叉感染所致； 人呼吸时排出或头发洒落的细菌。4. 防止对策 培养基灭菌后在培养室放置23天观

56、察有无细菌感染的菌落； 接种前，剪指甲，将手用肥皂洗干净，再用70%酒精擦洗； 避免交叉感染，工具用一次即需消毒一次； 操作时，应戴消毒好的口罩和工作帽，穿消毒好的工作服，并严禁谈话。另外， 培养过程中， 蚂蚁和空气中肉眼看不见的螨虫爬入培养容器中也会导致细菌污染。 要用杀螨剂处理培养室。三、真菌性污染1. 症状 一般接种后 3 5 天就可发现菌丝，随即在培养基或培养物上发现不同颜色的 菌落。3. 污染原因 接种室空气含真菌孢子（大环境污染）； 瓶口边缘的灰尘； 取放瓶塞（盖）时扬起或由于负压带入的灰尘和孢子； 超净工作台因使用时间过久或长时间没使用导致滤器堵塞。4. 防止对策 接种室经常处于

57、工作状态，定期用40%甲醛和高锰酸钾进行熏蒸消毒； 每次使用接种室和超净工作台先用紫外灯杀菌20min，再用75%酒精喷雾降尘； 用 75%酒精擦洗容器外部，再放入超净工作台上； 接种时，动作要轻，瓶子斜拿，瓶口放在火焰上，利用气流上升的原理，以阻止空气 中孢子落入瓶内。 经常清洗滤器，必要时更新。一、褐化现象的机理酚类（phenol）物质被氧化成有毒的苯醌（quinones）,成棕褐色或暗褐色，它们会逐渐 扩散到培养基中， 抑制其它酶的活性， 毒害整个外植体组织。 又称为酚污染 （phenol pollution） 。二、褐化现象的原因在自然条件下， 细胞中的酚和醌之间保持一种动态平衡， 酚氧化酶类处于抑制状态， 醌 类物质保持在一个较低的水平。在合适的pH、温度和水活性条件下，酚类物质、酚氧化酶和氧气聚合在一起时发生氧化反映。当植物组织被切割、接种时的机械损伤或组织的老化、 病变使酚氧化酶激活，都会引起褐变。1. 酚类物质 2.酚氧化