基因工程2资料

1、第四章 核酸的定量和纯度检测提取的总DNA、RNA或载体DNA，外源目的DNA片段，必须对其浓度、纯度、构型、分子量大 小等基本情况进行了解，以下几种方法从不同角度对 DNA 或 RNA 进行了鉴定。第一节 紫外光谱分析法核酸的最大吸收波长为 260 nm,蛋白质为280 nm,在260nm波长时，用标准样品测得每毫升 I微 克DNA钠盐溶液的吸光度值为 0.02，即在1 OD值相当于双链 DNA浓度为50 ug/ml,单链DNA或RNA 为40 ug/ml，单链寡聚核苷酸的含量为 30 ug/ml，可以据此来计算核酸样品的浓度。DNA浓度计算：根据经验数据，若OD260=I时，dsDNA的浓

2、度为50微克/毫升，假如质粒样品pBR322 稀释 500 倍,测得光吸收值为 0.025,则该样品 pBR322 浓度为 50*0.025*500=625 微克/毫升。分光光度法不但能确定核酸的浓度， 还可通过测定在260nm和280nm的OD值的比值(OD260/OD280) 估计核酸的纯度。纯净DNA的比值为1.8 ,纯净RNA的比值为2.0。若DNA的比值高于1.8，说明DNA 样品中的 RNA 尚未除尽，若样品中含有酚和蛋白质将导致比值降低，此时，可通过苯酚-氯仿-异戊醇方270nm 存在高吸收表明有酚的干扰。DNA 的方法简便、快速。法抽提后再检测,以排除蛋白质的影响。优点：使用U

3、 V -240紫外分光光度计测定的 OD 值的比值 ( OD 260/OD 280)估计核酸的浓度和纯度， 也不能区分染色体DNA 。由于测定 OD 260时，难于注意的问题：1 )用 UV -240 可以通过 260 nm 和 280 nm 但不能区分 DNA 的超螺旋、开环、线状三种构型, 排除RNA，染色体DNA，以及DNA解链的增色效应等因素，因此测得的数据往往比实际浓度偏高。2) 用 UV -240,有因样品槽大,测定用量较多的缺点,但对于测浓度较高的样品,特别是测定寡 聚核苷酸的浓度其效果甚佳。其他 DNA 多数选用琼脂糖凝胶法进行鉴定。3) 紫外分光光度法只能用于测定浓度大于0.

4、25 ug/ml 的核酸溶液,对浓度更小的样品,可采用荧 光分光光度法。第二节 溴化乙锭 -标准 DNA 浓度比较法测定 DNA 浓度DNA 本身不产生荧光，但荧光染料溴化乙锭(EB) 嵌入碱基对之间后，可在紫外线激发下发出红色荧光。不同浓度的 DNA 溶于一定浓度的溴化乙锭溶液中，在紫外灯下所发射荧光的强度与核酸含量成正 比，使用一系列已知浓度的 DNA 溶液作标准对照，可比较出被测 DNA 样品的浓度。特点：仪器设备与操作都很简单，省时，配制一套标准浓度的DNA样品与试剂存于-20C，随时可进行测定比较。克服了 U V-240用量大的缺点，只需I ul的用量，就可测出I ng的DNA样品。

5、适合于测定 经过分离纯化后的DNA片段浓度，为DNA的重组连接提供浓度参数。在基因操作中，对于 DNA含量较少，特别是要对分离纯化后的DNA片段的浓度进行测定，用此比l5ng 。较法最为合适。此法直接简便，测定量仅需0.51微升就能比较出确切浓度，灵敏度可达影响实验结果的因素：1) 本实验对样品中含有的染色体 DNA、RNA以及质粒DNA的三种构型无法区分； 若待测样品不纯， 测得的浓度比实际浓度肯定偏高。2) 实验采用比较法，操作者的目测误差也影响准确性。3) DNA浓度大于20ng/ul以上时浓度误差较大，需要样品稀释到合适的浓度才能进行比较。第三节 DNA 的凝胶电泳带电物质在电场中向相

6、反电极移动的现象称为电泳(electro phoresis)。各种生物大分子在一定 pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。电泳技术是19世纪初发明的，人们采用各种材料作为支持电泳介质，其中以琼脂糖和聚丙烯酰胺为支持介质的凝胶电泳最为突出。凝胶电泳的原理比较筒单。当一种分子被放置在电场当中时，它们就会以一定的速度移向适当的电 极。这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它同电场的强度和电泳分子本身所携 带的净电荷数成正比。即电场强度越大，电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移的速度也就越快， 反之则较慢。由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如

7、琼脂糖凝胶和聚丙烯酞胺凝胶 等，电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。已知摩擦系数是分子的大小、极性及介质黏度的函数，因此根据分子大小的不同、构型或形状的差异，以及所带的净电荷的多寡，便可以通过电泳将蛋白 质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。-磷酸骨架中的磷 核酸分子在电场中向正电极方 DNA几乎具有等量的净电荷，因此它DNA分子的这种迁移速度（亦即电泳的迁 DNA分子比分子量较大的 DNA分子具有较紧密 DNA分子或线性DNA分子要快些。应用凝胶电泳技木分离 DNA片段的基本原理：在一定生理条件下，核酸分子之糖 酸基团是呈离子化状态的，DNA和RNA的多核苷酸链可叫做多聚阴离子，

8、向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链 们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下， 移率）取决于核酸分子本身的大小和构型。分子量较小的 的构型，其电泳迁移率快，而且比同等分子量的松散型的开环一、水平式琼脂糖凝胶电泳检测D-琼脂糖是一种从红色海藻产物琼脂中提取而来的线性多糖聚合物。琼脂糖是一种直链多糖，它由 半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖的残基交替排列组成的线型多聚糖。由于链状琼脂糖分子相互以氢键交联， 因此与琼脂一样能形成凝胶。琼脂糖带有亲水性，不含有带电荷的基团，不引起DNA变性，又不吸附被分离物质，因此它是一种很好的凝胶剂。当琼脂糖加热到沸点后冷却凝固便会

9、形成良好的电泳介质，其 密度是由琼脂糖的浓度决定的。有两种不同类型的琼脂糖凝胶，一种是常熔点的，另一种是低熔点的（熔点为6265C的琼脂衍生物），它一旦熔解，便可在37C持续保持液体状态达数小时之久，而在25C下也可持续保持液体状态约 10分钟。经化学修饰的低熔点 （LMP）的琼脂糖在结构上比较脆弱，因此在较低 的温度下便会熔化，可用于 DNA片段的制备电泳，但价格却相当昂贵。原理：溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物，使 DNA发射的荧光增强几十倍。而荧光的强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品作琼脂糖

10、凝胶电泳对照，就可比较出待测样品的浓度。若用薄层分析扫描 仪检测，则可精确地测得样品的浓度。电泳后的琼脂糖凝胶块直接在紫外灯照射下拍照，只需要 510ngDNA，就可以从照片上比较鉴别。如肉眼观察，可检测到0.010.1ug的DNA。在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比关系。质粒DNA样品用单一切点的酶酶切后与已知分子量大小的标准 DNA片段进行电泳对照，观察其迁移距离，就可获知待测样品的分子量 大小。凝胶电泳不仅可以分离不同分子量的DNA，也可以鉴别分子量相同，但构型不同的DNA分子。一般情况下，超螺旋型（SC）迁移速度最快，其次为线状 （L）分子，最慢的为开环状（OC）

11、分子。当提取到的质粒 DNA样品中还有染色体 DNA或RNA，在琼脂凝胶电泳上也可以分别观察到电泳区 带，由此可分析样品的纯度。有电荷效应与分子筛效应， 前者由分子所带净电荷量的多少而定, DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时， 后者则主要与分子大小及其构型有关。动，在用电泳法测定DNA分子大小时，应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低 电荷效应，使分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度的差异所决定，提高分辨率。同时适当减低电 泳时的电压，也可使分子筛效应相对增强而提高分辨率。影响琼指糖凝胶电泳 DNA迁移速率的因素：1.

12、DNA的分子大小：线状双链 DNA分子在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目以10为底的对数值成反比。分子越大，则摩擦阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。2 琼脂糖浓度：一个给定大小的线状 DNA片段，其迁移速率在不同浓度的琼脂糖中各不相同。 DNA 电泳迁移率（H的对数与凝胶浓度 成线性关系，可用如下等式表示： lgP=lgM0-K江，其中比为DNA的 自由电泳迁移率；Kr是回归系数，是一个与凝胶的性质、迁移分子的形状和大小有关的常数。因此对较小的DNA分子群得不到很好的分离 DNA分子迁移速度的差异主 所需时间长，因此通常根据待测 选择不同大小的电泳槽与合适的条件。DNA通过凝

13、胶时速度不一。这三种DNA在大孔径的琼脂糖凝胶（即琼脂糖含量低的凝胶）中，凝胶对不同大小的 DNA分子，其阻滞程度差异 不大，而DNA分子的迁移率更多地依赖于分子的净电荷，效果。如果增加琼脂糖凝胶的浓度，可在一定的程度上降低电荷效应，使 要由分子受凝胶阻滞程度的差异所决定。但高浓度的琼脂糖凝胶电泳， 分子量范围选择合适浓度的凝胶。也要根据每次电泳的不同要求，3. DNA的构象：分子量相同的超螺旋型、带切口环状及线状DNA迁移速率比线型 DNA快；在另一些条件下则恰恰相反。DNA的相对迁移率主要取决于凝胶的琼脂糖浓度，也受电流强度、缓冲液的离子强度及超螺旋型 超螺旋度的影响。在某些条件下超螺旋型

14、5V/cm 。4所加电压：在低电压时，线状 DNA 片段的迁移速率与所加电压成正比。随着电场强度的增加， 高分子量 DNA 片段的迁移率将以不同的幅度增长，不再与电压成正比。因此，随着电压的增加，琼脂 糖凝胶的有效分离范围缩小。要使大于 2kb 的 DNA 片段的分辨率达到最大，所加电压不应超过5电场方向：如果电场方向保持不变，则大于 50100kb 的 DNA 分子在琼脂糖凝胶上的迁移速率 相同。如果电场方向改变，则 DNA 分子被迫改变路径。由于 DNA 分子越大，为适应新的电场方向而重 新排列所需的时间越长，因此可以通过脉冲电场凝胶电泳来分辨极大的DNA 分子 （达到 10000kb）。

15、4 C下电泳。6碱基组成与温度： DNA 在琼脂糖凝胶中的电泳行为受 DNA 的碱基组成或凝胶电泳温度的影响 不明显。不同大小的 DNA片段的相对迁移率在 4C与30C之间不发生改变。电泳一般在室温下进行。 但浓度低于 0.5%的琼脂糖凝胶和低熔点琼脂糖凝胶较为脆弱，最好在7 .嵌入染料的存在：荧光染料EB用于检测琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA，它会使线状DNA的迁移率降低15%。染料嵌入到堆积的碱基对之间，并拉长线状和带切口的环状DNA，使其刚性更强。8电泳缓冲液的组成：电泳缓冲液的组成及其离子强度影响 DNA 的电泳迁移率。在没有离子存在 时（如凝胶中未加缓冲液 ），电导率最小，即使 D

16、NA 还能移动一点的话，也很慢。在高离子强度的缓冲液 中（如误加了 10 倍电泳缓冲液 ），电导很高并明显产热。最坏的情况是引起凝胶熔解而 DNA 发生变性。有几种不同的缓冲液可用于天然双链DNA的电泳。这些缓冲液含 EDTA（pH8,0）和Tris-乙酸（TAE）、Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）。其浓度约为50mmol/L（pH7.57.8）。电泳缓冲液通常配制成浓缩液，贮 存于室温。最常用的缓冲液是 TAE。但它的缓冲容量相当低，长时间电泳会使其缓冲容量丧失殆尽（阳极呈碱性，阴极变成酸性 ）。在进行高压、长时间的电泳时，更新缓冲液或在两槽之间进行缓冲液循环是可 取的。T

17、PE和TBE比TAE成本稍高，但它们的缓冲容量明显较高。双链线状DNA片段在TAE中的迁移速率比在TBE或TPE中快将近10%，但这些系统的分辨能力几乎相同，只是超螺旋DNA在TAE中的分辨率要比在TBE中更好。核酸电泳常用的指示剂有两种：溴酚蓝，呈蓝紫色，分子量为670道尔顿，在不同浓度凝胶中迁移速度基本相同，分子筛效应小，近似于自由电泳，故被普遍用作指示剂。在0.6%、 1%、 2%的琼脂糖凝胶电泳中，溴酚蓝的迁移率分别与I kb、0.6 kb和0.15 kb的双链线性DNA片段大致相同。二甲苯腈，呈蓝色，分子量为 554.6道尔顿，携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中迁移率比溴酚蓝慢。 根据

18、分离样品中 DNA分子的大小，可以参照指示剂溴酚蓝和二甲苯腈的迁移情况决定是否停止电泳。指示剂一般加在电泳上 样缓冲液中，为了使样品能沉入胶孔，还要加入适量的蔗糖、聚蔗糖400或甘油以增加密度。在凝胶电泳中，把含有 DNA分子的凝胶浸泡在 EB溶液中，或是将EB直接加到凝胶介质中，染料便 会在一切可能的部位同 DNA分子结合，在紫外光的照射下，DNA分子通过放射荧光而变成可见的谱带。二、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测聚丙烯酰胺凝胶电泳也是一种凝胶电泳检测DNA的方法，分辨率最高，只相差一个bp的DNA片断也能分开，且可以容纳较大容量的 DNA。但此法只能分离小于 500bP以下的双链DNA片段，琼脂糖

19、凝胶电 泳虽然分离DNA的范围较广，但对200bP以下的小片段的分离却很因难。因此将这两种方法互补起来， 就能很好地完成由5bP到50kb的双链DNA的分离、鉴定和纯化的工作。基本原理：过硫酸胺（AP）与TEMED（N,N,N 四甲基乙二胺）是单体丙烯酰胺（Acr）的催化剂与诱导 剂。它们使单体丙烯酰胺聚合成一串串长链。当溶液中的N,N -亚甲基双丙烯酰胺参与聚合反应时，长链与长链之间就交联成凝胶，链长与交联度就决定了凝胶的孔径，这种孔径与琼脂糖凝胶的密度不同， 只有DNA的小片段能进入凝胶内， 在电泳场作用下进行分离。DNA各片段在其相应的胶的位置上，然后通过溴化乙锭染色后，将凝胶移入紫外灯

20、的照射下，根据凝胶中已知浓度的标准DNA各片段的大小与荧光亮度的比较，测出未知样品的浓度与分子量大小。如果需要凝胶中那一片段，可以从胶上切割下来进 行纯化，这种纯化的 DNA纯度极高。与琼脂糖凝胶一样，聚丙烯酰胺凝胶可以灌制成各种形状、大小和孔隙度，并在许多种不同的装置 里进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳根据电泳样品的电荷、分子大小及形状的差别分离物质。这种介质既 具有分子筛效应，又具备静电效应，分辨力高于琼脂糖凝胶电泳，适用于低分子量蛋白质、寡聚核苷酸 的分离和DNA的序列分析。聚丙烯酰胺凝胶电泳可以容纳相对大量的DNA，其不足之处在于：与琼脂糖凝胶相比，凝胶的制备和电泳都比更为费事。聚丙烯酰胺

21、凝胶一律是进行垂直装置在恒定电场下电泳， 根据分离的需要，其长度可以在 10100cm 之间。虽然聚丙烯酰胺凝胶的灌制比琼脂糖凝胶繁杂，但以下几种优点是琼脂糖凝胶所不具备的：1） 分辨率极高，在同一 DNA混合物中，即使最大的片段比最小的片段长500倍（如1bP与500bp）也能 很好地分离；2） 比琼脂糖凝胶的载样量大，在I cm X I mm的胶孔中能上样到10ug的DNA样品，而分辨率并无明 显下降；3）回收的DNA样品纯度极高，可用于要求非常严格的实验，如转基因动物实验；4） 在聚丙烯酰胺凝胶分子的交联网状结构中，带有酰胺侧链的C-C聚合物不带或少带离子侧链基团；5）聚丙烯酰胺凝胶无色

22、透明，比琼脂糖凝胶的紫外线吸收低，抗腐蚀性强，机械强度高，韧性好。影响DNA片段分离纯化的因素：尽管聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖凝胶有以上优点，但还是有多种 因素影响 DNA 分子条带分离纯化的效果，因此在聚丙烯酰胺凝胶电泳时有如下几个方面要注意的：1）电泳中气泡的影响：2）点样孔的阻塞影响：3）电泳条件的影响：4）最少上样量的估计：5）DNA的聚 丙烯酰胺凝胶电泳的结果分析。常用的丙烯酰胺凝胶有非变性与变性两种：1）用于分离和纯化双链 DNA片段的非变性聚丙烯酰胺凝胶2）用于分离、纯化单链 DNA的变性聚丙烯酰胺凝胶三、脉冲电泳检测琼脂糖电泳是根据DNA分子量大小来筛选DNA分子的一种方法。琼

23、脂糖浓度低，胶的孔径大，则可 以允许通过的DNA分子也越大，然而当DNA分子太大时，实际上已无法通过胶孔，所有超过一定大小的 线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速率相同，这时，琼脂糖的分离能力达到了极限，而琼脂糖凝 胶的孔径也不是可以无限增大的，且随着胶浓度的降低，胶越来越软易碎而难以操作。一般来说，普通 的琼脂糖凝胶电泳只能对 50kb以下的DNA片段进行分离分析。但是，即使低等真核生物的一条染色体就 有7000kb，高等真核生物的染色体更大，一个基因有几千kb，怎么才可能尽量完整地来研究这些大段的DNA 呢？为了解决这一问题，1984年，发展了脉冲电泳技术。1. 原理： DNA 分子在

24、两个交替改变的电场力作用下，不断地改变自己的形状，当它由“线团”状变 成“束”状时，就有可能进入凝胶。在电场力的作用下，象蛇一样地爬行，这时，大分子移动慢，小分 子移动快。当电场发生变化时，DNA分子又再次改变自己的形状，沿着新的电场方向移动，在这一过程中，大分子较小分子要困难些，所化的时间也长一些。由于上述两个因素，再加上小分子DNA在凝胶孔中移动时受到的摩擦力也比大分子小，因此整个电泳过程的总效应是小分子移动快，大分子移动慢。一 般的琼脂糖凝胶中：DNA分子移动距离与其分子长度 （bP）的对数成反比。但是脉冲电泳不符合这一规律。由于移动过程与分子改变自身形状的时间有关，脉冲长则更适合于大分

25、子的分离，一般用长脉冲、 低电压分离较大的分子；短脉冲高电压分离小的分子，琼脂糖的浓度也可随所分离的DNA分子的大小而作相应的变化。脉冲电泳的诞生，使可以分离的DNA分子的上限大大提高，最大可达 9000kb，使人类有可能对一些大的 DNA 片段进行分析研究。脉冲电场凝胶电泳分辨力的极限取决于几个因素，包括：1）两个电场的均一程度。2）电脉冲的绝对长度。3）用于产生两个电场的电脉冲长度的比例。4）两个电场与凝胶所成的角度。5）两个电场的相对强度。2用于脉冲电泳的 DNA 的制备（包块法）：为避免大分子 DNA 在抽提过程中受到剪切，可以在琼脂糖块或小珠中进行细胞原位裂解。由于琼脂 糖块更有效，

26、是目前应用最多的抽提大分子DNA的方法。此法使细胞裂解，蛋白酶消化，DNA分子酶解等整个过程在一定浓度的琼脂糖块中进行，避免了液相中和有机试剂中的剧烈处理，保证DNA分子受到最小的机械损伤，被用于哺乳动物人和其他真核生物的总DNA的提取。琼脂糖块可以直接加到脉冲电场凝胶的加样孔中，也可以在上样前使之熔化。第五章 分子克隆中所用酶 通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核苷酸发生水解断裂的蛋 白酶叫做核酸酶。其中专门水解断裂RNA分子的叫做核糖核酸酶 (RNase)，而特异水解断裂 DNA分子的则叫做脱氧核糖核酸酶(DNase)。核酸酶按其水解断裂核酸分子的不同方式，可

27、分为两种类型：一类是从核酸分子的末端开始，一个核苷酸一个核苷酸地消化降解多核苷酸链，叫做核酸外切酶(exonuclease)；(endonuclease)。另一类是从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫做核酸内切酶第一节 核酸内切限制酶核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的酶。主要是从原核生物中分离纯化出来的。根据1994年美国出版的分子生物学百科全书的统计数字，仅n型核酸内切限制酶一项就已从各种不同的微生物当中，分离出了2300种以上、可识别230种不同的DNA序列。在核酸内切限制酶的作用下，侵入细菌的“外源”DNA分子便会被

28、切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的 DNA 由于修饰酶 (通常是一种甲基化酶 )的保护作用，则可免受限制酶的降解。目前已经鉴定出3种不同类型的核酸内切限制酶，即I型酶、 II型酶和III型酶。最初在限制-修饰系 统中发现的限制酶属于第I型限制酶，它们的切割位点是随机的，至少距识别位点lOOObp。第川型限制酶的切割位点距识别序列 3端为2426bP。第n型限制酶的切割位点一般在识别序列上或与之靠近，而且具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。n型核酸内切限制酶具有 3个基本的特性：在DNA分子双链的特异性识别序列部位切割DNA分子，产生链的断裂；2个单链断裂部位在 DNA分子上的分

29、布通常不是彼此直接相对的；断裂结果形成的 DNA 片段往往具有互补的单链延伸末端。限制酶的命名是根据分离出该酶的微生物的学名进行的，通常为3个字母：第一个字母大写，来自BamH I 。微生物属名的第一个字母；第二、第三个字母小写，来自微生物种名的头两个字母。如果该微生物有不 同的变种和品系，则再加一个大写的来自变种或品系的第一个字母。从同一种微生物中发现的几种限制 酶，则根据其被发现和分离的顺序用I、n、III等罗马数字表示。例如，从淀粉液化芽孢杆菌(Bacillusamyloliguefaciens )H株中发现并分离的第一种限制酶，被称为绝大多数的n型核酸内切限制酶，都能够识别由4 一 8

30、个核苷酸组成的特定的核昔酸序列，我们称这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。一般说来，同一种 DNA分子中，识别序列短的出现概率大，识别序列长的出现概率小。原则上有n个核苷酸的识别序列的出现概率为1/4n。如Sau 3A的识别序列只有4个核苷酸GATC，则间隔256(44)个核苷酸就有一次机会出现这个识别序列；Not I的识别序列有8个核苷酸GCGGCCGC，则须间隔65536(48)个核苷酸才有一次机会出现这个识别序列。因此要获得不同长度的DNA片段，就得选用识别序列长短不同的限制性核酸内切酶进行切割。但实际上未必所有的限制性核酸内切酶识别序列的出现概率都符合这样 的规律。往往是富AT的识别

31、序列在富AT的DNA分子中出现的概率高， 在富GC的DNA分子中出现的概率 低；而富GC的识别序列在富AT的DNA分子中出现的概率低，在富GC的DNA分子中出现的概率高。 由于那些长的识别序列和富 GC或富AT的识别序列在DNA分子中出现的概率很低，所以把这些识别序列相应 的限制性核酸内切酶称为稀切酶 (rare cutting enzymes) 。为了获得大的片段 ,有时须采用稀切酶切割。已发现多种限制性核酸内切酶属稀切酶，如富GC识别序列的稀切酶有 Apa l(GGGCCC)、Bgl I (GGCN5GCC)、BssH II(GCGCGC)、EclX I和 Xma III(CGCGCG)、

32、Ksp I和 Sac ll(CCGCGG)、Nar I(GGCGCC)和 Sma I(CCCGGG);富 AT 识别序列的稀切酶有 Asn I 和 Ase I(ATTAAT)、Dra I(TTTAAA)和 Sspl(AATATT)。有的限制性核酸内切酶可识别两种以上的核苷酸序列。如Acc I既可识别GTATAC，又可识别GTCGAC ； Dde I可识别的核苷酸序列有 CTAAG、CTTAG、CTGAG和CTCAG。这样的限制性核酸内切 酶为获得多种酶切片段提供了方便。有一些来源不同的限制酶能识别同样的核苷酸靶子序列，这类酶称为同裂酶(isoschizomers)。同裂酶产生同样的切割，形成同

33、样的末端。“完全同裂酶”能识别和切割完全相同的序列，女0Hi nd III与Hsu I,“不完全同裂酶”虽能识别相同序列，但切割方式不同，如Xma I和Sma I。某些限制酶的识别序列中存在简并现象，即识别序列中的个别碱基可以允许一定程度的替换。有些酶来源各异，识别的靶子序列也各不相同，但都产生出相同的黏性末端，称为同尾酶（isocaudamer）。常用的限制酶 BamH I、Bcl I、Bgl n、Sau3A I和Xho n就是一组同尾酶，它们切割 DNA之 后都形成由GATC 4个核苷酸组成的黏性末端。由同尾酶所产生的DNA片段是能够通过其黏性末端之间的互补作用而彼此连接起来。但由一对同尾

34、酶分别产生的黏性末端共价结合形成的位点，称为“杂种位 点” （hybrid site），一般是不能再被原来的任何一种同尾酶所识别。亦有例外情况，如由Sau3A I 和 BamH I同尾酶形成的杂种位点，对 Sau3A I仍然是敏感的，但已不再是 BamH I的靶子位点。5侧切割总结限制性内切酶的切割方式：根据切割位点相对于对称轴的位置而言有三种，在对称轴 产生 5粘端，在对称轴的 3侧切割产生 3粘端，在对称轴处切割产生平端。总结识别位点与切割方式之间的关系：可分为如下四种：（1）识别顺序不同，切割方式也不同， :如EcoR I和Pst I的识别位点不同，切割方式也不同，EcoR I产生的是5

35、粘端，Pst I产生的是3粘端。（2）识别顺序不同，切割产生的粘末端相同；此时两种酶产生的相同粘端，可用连接酶将其连接起来，这两 种酶称为同尾酶。（3）识别顺序相同，切割方式不同；如 Sma I与Xma I。（ 4）相同的识别顺序，切割 方式亦相同；通常，我们将来源不同，但能切割同一靶序列的那些酶称为同裂酶或异源同工酶。1）DNA 样品的纯度， 2）DNA 核酸内切限制酶的缓冲液。DNA 排列顺序。但在某些反应DNA 片段会产生新的酶切位点， EcoR I ，一般条件下它识别 GAATTC核酸内切限制酶对 DNA底物的酶解作用是否完全，直接关系到连接反应、重组体分子的筛选和鉴定 等实验结果。核

36、酸内切限制酶活性的充分发挥受到以下几个因索的影响： 的甲基化程度，3）酶切消化反应的温度， 4） DNA的分子结构，5）内切酶的星号活性：内切酶通常有严格的识别特异性，能精确地识别 条件下，识别顺序的特异性可能发生变化。结果一种内切酶酶切同一种 得到不同的酶切片段，这就是内切酶的星号活性。最常见的例子是 六个核苷酸顺序，而 EcoR I（表现有星号活性），仅能识别AATT四个核苷酸的顺序。在这种条件下的酶解 反应，电泳后出现的 DNA条带数可能增多。促使内切酶产生星号活性的因素有多种，主要由如下一些因素引起：（1）甘油浓度过高。这是引起星号反应的常见原因。（ 2）离子强度不合适。盐浓度降低也可

37、能引起星号反应。 （3）阳离子变化。若将Mg2+改为Mn2+可能促使EcoR I和Hi nd川产生星号活性。（4）溶液中pH变化。如用EcoR I酶切时， 反应溶液的pH值由7.5升高到8.5时也会出现星号反应。（5）有机溶剂残留的影响。在基因工程操作中都希望减少或避免这种星号反应的出现。为此进行酶切反应时，应该按制造厂商推荐的条件进行反应，尤其应注意甘油浓度、盐离子浓度、二价离子的种类和浓度以及反应溶液的pH值。核酸内切限制酶在分子克隆中的应用：限制酶是分子克隆中最常用的工具酶，只要进行分子克隆操作，就必定要用限制酶，归纳起来，主要用在这几方面： DNA重组，组建新质粒，DNA分子杂交，制备

38、DNA放射性探针，绘制 DNA物理图谱，DNA序列分析，DNA甲基化碱基的识别与切割， 基因定位及 DNA 同源性研究。第二节 DNA 连接酶1967年，世界上有几个实验室几乎同时发现了一种能够催化2条DNA分子之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶（ligase）。这种酶能够参与 DNA裂口的修复，在一定条件下还能连接DNA分子的自由末端。连接的功能是通过合成相邻核苷酸之间的磷酸二酯键，从而修复缺口（nick）或单链的裂口 （gap）。DNA片段的DNA连接酶有E. coli DNA连接酶和T4DNA连接酶。DNA连接T4DNA 但DNA 连接酶能催化双链 DNA 片段紧靠在一起的 3羟基末

39、端与 5磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键， 使两末端连接。目前用于连接酶只能催化双链 DNA 片段互补黏性末端之间的连接， 不能催化双链 DNA 片段平末端之间的连接。 连接酶既可用于双链 DNA片段互补黏性末端之间的连接，也能催化双链DNA片段平末端之间的连接，平末端之间连接的效率比较低。核酸DNADNA连接酶同核酸内切限制酶一样，都是在体外构建重组DNA分子所必不可少的基本工具酶。内切限制酶可以将DNA分子切割成不同大小的片段，然而要将不同来源的DNA片段组成新的杂种分子，还必须将它们彼此连接起来。目前有3种体外连接DNA片段的方法：用DNA连接酶连接具有互补黏性末端的DNA片段；用T4DN

40、A连接酶直接将平末端的 DNA片段连接起来，或是用末端脱氧核苷酸 转移酶给具平末端的 DNA片段加上Poly（dA）-poly（dT）尾之后，再用DNA连接酶连接起来；先在 DNA片 段末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成黏性末端，再用DNA连接酶连接起来。这3种方法虽然互有差异，但共同的一点都是利用DNA连接酶所具有的连接和封闭单链DNA的功能。第三节 分子克隆中的其他工具酶一、 DNA 聚合酶：DNA 聚合酶：能够把脱氧核糖核苷酸连续地加到双链 DNA 分子引物链的 3-OH 末端，催化核苷酸的 聚合作用，而不发生从引物模板上解离的情况。到目前为止，已经从大肠杆菌中纯化了3种不同类型的

41、DNA聚合酶，即DNA聚合酶I、DNA聚合酶n和DNA聚合酶III，分别简称为Pol I、Pol II和Pol III 。 Pol I 和Pol II的主要功能是参与 DNA的修复过程，而Pol III的功能看来是同DNA的复制有关。在这3种DNA聚 合酶中，只有Pol I同DNA分子克隆的关系最为密切。1 .大肠杆菌 DNA 聚合酶 I （E. coli DNA Pol I）:大肠杆菌DNA聚合酶I由大小两个亚基组成，具有3种酶活性，（1）大亚基的5 7 3DNA聚合酶活性和（2）375外切酶活性及 小亚基的573DNA外切酶活性。（1）需要以单链DNA作模板，并需要3为一 0H 的引物。（

42、2）从游离的3一0H末端降解单链或双链 DNA成为单核苷酸，其意义在于识别和消除不配对的核 苷酸，保证DNA复制的忠实性。（3）从5末端降解双链DNA成单核苷酸或寡核昔酸。也降解DNA： RNA杂交体的RNA成分（具有RNA酶H活性）。利用该酶活性，可进行切口平移法标记DNA。2 .大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）酶：该酶是用枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解大肠杆菌DNA聚合酶I而得到的该酶大片段，亦称Klenow酶，从全酶中去除了 573外切酶活性，保留了 573 DNA聚合酶活性及375外切酶活性。Klenow酶的用途：（I）用同位素标记 DNA片段的末端。 补平5粘端。（3）合成

43、cDNA的第二条链。 （4）Sa nger双脱氧法进行序列分析。（5）定位突变。3. T4噬菌体DNA聚合酶：来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，与Klenow相似，有57 3聚合酶活性及375外切酶活性，但其375外切酶活性对单链作用比对双链DNA更强，外切酶活性比 Klenow酶强200倍。因其不从单链 DNA模板上置换寡核苷酸引物，故在体外诱变反应中效率比 Klenow酶更强。该酶用途基本与 Klenow 致，不同之处在于可对3突出端的DNA分子进行末端标记。这是利用其强劲的375外切酶活性切除3突出端，产生3凹端。4. T7噬菌体DNA聚合酶及测序酶：T7噬菌体DNA聚合酶来源于T7噬菌体

44、感染的大肠杆菌，是两种蛋白的复合物。其作用与Klenow酶相似，具有573聚合酶活性及375外切酶活性，无573外切酶活性。该酶是所有 DNA聚合酶中持续合 成能力最强的一个，所合成的DNA的长度亦比其他聚合酶长得多。其375外切酶活性比Klenow酶强1000倍。该酶的用途与 T4DNA 聚合酶相似。另外还可用于拷贝长段模板的引物延伸反应。测序酶是经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶，该酶具有57 3的聚合酶活性，其持续合成能力很强，而37 5外切酶活性则是丧失的，故该酶是San gei双脱氧测序法对长片段 DNA进行序列分析的理想用酶。5. TaqDNA 聚合酶：该酶是一种耐热的依赖于 DNA的

45、DNA聚合酶，具有57 3聚合酶活性及依赖于57 3聚合作用的外切 酶活性，聚合酶的最适反应温度为7580 C。该酶的主要用途是进行 PCR反应。6 .逆转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）：商品化的逆转录酶有两种，均具有 573DNA聚合酶活性，其底物是 RNA或DNA模板及带3一OH的 RNA或DNA引物。RNA酶H活性（57 3及375外切核糖核酸酶活性）：能持续地、特异地降解 RNA-DNA 杂交体中的RNA。两种逆转录酶在许多方面有差别，如 RNA酶H活性强弱、最适反应温度及 pH等。逆转 录酶的主要作用是将 mRNA反转录成cDNA ,并可用反转录成的cDNA进行序列分析，再推导出

46、RNA序列。7.末端转移酶 （末端脱氧核苷酸转移酶 ）：来源于小牛胸腺，在二价离子存在条件下，催化dNTP加于DNA分子的3一 OH端，DNA分子可以是单链，亦可是双链（主要是3一OH突出的双链）。在适当条件下，也可在 DNA平末端或3凹端的3一OH端 加上dNTP。该酶主要用途是给载体或 cDNA加上互补的同聚物尾，其次是标记DNA片段的3一OH端。二、碱性磷酸酶：包括细菌碱性磷酸酶（BAP）和小肠碱性磷酸酶（C I P）,其作用是去除 DNA、RNA、NTP和dNTP的5 磷酸根。可用于去除 DNA片段的5-P,以防自身环化；另外在用 32P标记5末端前，可先用其去除 DNA或 RNA 上

47、的 5-P。三、核酸酶：1. SI核酸酶：降解单链DNA或RNA，产生带5磷酸的单核苷酸或寡聚核苷酸。酶量中等时可在切口 或小缺口处切割双链核酸，酶量大时则可切割双链核酸。该酶用于去除DNA片段粘末端而产生平端。打开 cDNA 中发夹结构， 使其成平端。 分析 DNA:RNA 杂交体的结构， 可证明基因内部内含子的存在。2 绿豆核酸酶（Mung-bean酶）：将单链DNA降解为5端带磷酸的单核苷酸或寡核苷酸。只有酶量大 时才能将双链核酸完全降解，该酶的作用与SI酶相似，但比SI酶温和。其主要用途是将 DNA突出端改为平端。3.核糖核酸酶：RNaseA来源于牛胰，是内切核糖核酸酶， 专门降解RN

48、A。RNaseT,来自米曲霉菌， 具有碱基专一性，特异性降解RNA成3鸟苷酸或3端为鸟苷酸的寡核昔酸链。 这两种酶的用途：在质粒 提取时降解RNA ;从DNA-RNA杂交体中去除未杂交的 RNA区。4 .脱氧核糖核酸酶I （DNA酶I ）:为内切核酸酶，水解单链或双链DNA。用途缺口平移法标记DNA时，先在DNA双链上随机产生切口，以及其它需产生单切口的用途。建立随机克隆，以便进行序 列分析。5.外切核酸酶 III（ExoIII） ：催化双链 DNA3 羟基端逐一除去单核苷酸。底物为线状双链 DNA 及切口 或缺口的环状 DNA ，不降解单链 DNA 及3粘端双链 DNA 。此外还具有另二种活

49、性， 即无嘌呤 DNA 特异的 内切核酸酶活性，RNA酶H活性及3磷酸酶活性（去除3末端磷酸）。除以上所介绍的工具酶外，还有其他常用的基因工程工具酶，它们的作用在这里不详细介绍了。第六章 目的基因的制备与克隆随着基因工程研究工作的不断深入，绝大多数具有重要经济意义的转基因动物、转基因植物品种的 培育获得成功，表明动物、植物的许多优良品质特性，完全可以通过转基因技术得以实现。遗憾的是， 目前已经分离鉴定的具有优良品质的基因不多，致使许多重要的有经济价值的生物体无法培育出性状更 加优越的转基因品系，因此目的基因的分离引起了分子生物学家和遗传学家的关注。一般来说，目的基因的克隆分为两大类：一类是构建

50、感兴趣的生物个体的基因组文库，即将某生物 体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型，从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另 一类是利用 PCR 扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因， 然后将之克隆表达。 这两大类战略的 选择往往取决于对待克隆目的基因背景知识的了解程度、目的基因的用途以及现有的实验手段等因素， 只有在目的基因克隆战略确定之后，才能制订基因克隆的各项单元操作方案。第一节 直接分离法 限制性核酸内切酶酶切分离法适于从简单基因组中分离目的基因。 质粒和病毒等 DNA 分子小的只有 几千碱基，大的也不超过几十万碱基，编码的基因较少，获得目的基因的方法也比较简单。1对己测

51、序的 DNA 分子，只需用已知识别序列的限制性核酸内切酶进行一次或几次切割，分离纯 化所需 DNA 片段，与适当载体重组后转化受体菌后即可得到目的基因的克隆。2对己知定位的目的基因，只要根据目的基因两侧的已知的限制性核酸内切酶识别位点，用适当 的限制性核酸内切酶切割，一次就可获得目的基因。3即使含目的基因的 DNA 分子未定序或无定位，也只须先通过酶切分析，随后再通过部分酶切， 克隆构建一个非常简单的基因组文库，从中钓出目的基因。第二节 鸟枪法对于高等真核生物而言，基因组 DNA 十分庞大，基因可达数万个，且基因组成结构复杂，除编码序 列，还有非编码序列及调控序列，基因间还存在大量的间隔序列和

52、重复序列，因此，单个目的基因在整 个基因组中所占的比例极其微小，除少数例外，绝大多数基因难以直接分离得到。为了解决这个难题， 一种可行的方法就是将这个基因扩增，增加成功分离目的基因的可能性。由于要分离的目的基因往往是 未知基因，进行特异性扩增，只能对所有基因进行扩增，也就是构建该生物材料的基因组文库。然后再 根据不同的方法将所需的克隆筛选出来，最后分离得到目的基因。基因主要定位在细胞的染色体上，因此染色体 DNA 是分离目的基因的主要材料。早期，人们利用机械剪切力和超声波等物理方法或限制性核酸内切酶酶切等生物化学方法将生物细胞染色体DNA打断，随后通过T4DNA连接酶把这些片段与适当的质粒载体

53、进行重组，转化受体菌后进行无性繁殖，获得一大群含不同外源DNA片段的克隆，再用简便的筛选方法从众多的转化菌株中筛选出含有某一目的基因的菌 株，从中获得所要的基因。这就是所谓鸟枪法（shotgun）或霰弹法从基因组中分离目的基因策略。简言之，鸟枪法就是将某种生物体的全基因组或单一染色体切成大小适宜的DNA片段，分别连接到载体 DNA上，转化受体细胞，形成一套重组克隆，从中筛选出含有目的基因的期望重组子。一、鸟枪法操作的基本程序1.目的基因组DNA片段的制备：从作为供体的生物细胞中按照常规方法分离纯化其染色体DNA，在一般条件下，由于分离纯化操作中的物理剪切作用，制备出的染色体DNA片段平均大小约

54、在lOOkb左右。然后将染色体 DNA用下列方法切成片段，以便与载体分子进行体外重组。（1）机械切割：供体染色体DNA可用机械方法（如超声波处理等）随机切割成双链平头片段，采取合适的超声波处理 强度和时间，可以将切割的 DNA片段控制在一定的大小范围内，其上限是载体的最大装载量，而下限至 少应大于目的基因的长度，否则无法在一个重组克隆中获得完整的目的基因。一般来说，将外源DNA片段处理成略小于载体装载量上限的长度始终是正确的，因为每个重组克隆中含有的外源DNA片段越大，后续筛选的规模就越小。当染色体DNA上目的基因区域的限制性酶切图谱未知时，采用机械切割制备待克隆DNA片段是首选方法，但由于这

55、些DNA片段具有随机平头末端，因此必须插入在载体DNA的平头限制性酶切位点上，而且克隆的外源DNA片段很难完整地从重组分子上卸下。（2）限制性内切酶部分酶解：采用识别序列为四个碱基对的限制性内切酶（如Mbo I、Sau3A或AluI等）部分降解染色体DNA，也可获得大片段的DNA分子。由于这些限制性内切酶的识别顺序在任何生物基因组中频繁出现，因此只要采 取合适的部分酶解条件，同样可以获得一定长度的 DNA随机片段，而且经部分酶解获得的 DNA片段具有粘性末端，可以直接与载体分子拼接。（3）特定限制性内切酶全酶解：如果染色体DNA上目的基因的两侧（非内部）含有己知的限制性内切酶识别位点，而且两者

56、之间距 离不超过载体装载量的上限，那么用这一种（或两种）限制性内切酶完全酶解染色体 DNA片段更为有利，所产生的DNA片段呈非随机性，在某些程度上可以简化后续的重组和筛选操作。同时，重组分子可用相 同的限制性内切酶完全切下插入片段，这使得利用限制性酶切图谱法直接筛选期望重组子成为可能。2 .外源DNA片段的全克隆：根据外源DNA片段的末端性质及大小确定克隆载体，鸟枪法一般选择质粒或花DNA作为克隆载体，受体细胞大多选择大肠杆菌，只有当后续筛选必须使用外源基因表达产物检测法时，才选择那些能使外 源基因表达的相应受体系统。3.期望重组子的筛选：从众多的鸟枪法克隆中快速检出期望重组子的最有效手段是菌

57、落（菌斑）原位杂交法或外源基因产物功能检测法，前者需要理想的探针，后者则依赖于简便筛选模型的建立。在既无探针又难以建立快速筛 选模型的情况下，也可采用限制性酶切图谱法对所获重组克隆进行分批筛选。4目的基因的定位：在绝大多数情况下，利用鸟枪法获得的期望重组子只是含有目的基因的DNA片段，必须通过次级克隆或插入灭活，在己克隆的 DNA片段上准确定位目的基因，然后对目的基因进行序列分析，搜寻其编码 序列以及可能存在的表达调控序列。二、非随机鸟枪法：鸟枪法克隆目的基因的工作量之大是可想而知的，对目的基因及其编码产物的性质了解得越详尽， 工作量就越少。如果已知目的基因两侧的限制性酶切位点以及两个位点之间的距离，则可在克隆前就制 备非随机的待克隆DNA片段，这样可以有效地缩小筛选的规模和工作量，基本程序：用待定的限制性内 切酶完全降解染色体 DNA，酶解产物通过琼