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文档简介

1、WESTERN BLOT操作步骤WESTERN BLOT操作步骤聚丙烯酰胺凝胶电泳灌胶：注意：Acrylamide(聚丙烯酰胺)剧毒，需戴手套操作1.将玻璃板用清洗剂洗干净后，自来水冲净，蒸馏水冲三遍（勿用酸泡）。2.固定好玻璃板，配制分离胶溶液(10ml两板,一板可减半配制)根据分子量选择相应浓度的分离胶。胶浓度超纯水凝胶储备液Gel bufferpH8.810%SDS10%APSTEMED10%常用4.1ml 3.3ml 2.5ml 0.1ml 50L15L12%小分子量3.4ml4.0ml 2.5ml 0.1ml 50L15L8%大分子量4.7ml 2.7ml 2.5ml 0.1ml 5

2、0L15L3.用1000L移液器吸取分离胶溶液，缓缓灌入夹缝中，勿产生气泡，每板大约4.5ml灌完后在胶顶部加无水乙醇封闭。4.待分离胶凝固（约40min）倒掉无水乙醇，用超纯水清洗三次。用滤纸吸掉多余水分。5.配制浓缩胶溶液(10ml-四板量,两板可减半配制)胶浓度超纯水凝胶储备液Gel bufferpH6.810%SDS10%APSTEMED5% 5.7ml 1.7ml 2.5ml 0.1ml 50L20L6.灌浓缩胶，并插梳子。7.室温聚合30-45min，将玻璃板固定于电泳槽内，倒入适量的1电泳缓冲液，拔出梳子。上样，电泳10L移液器逐个加样，（第一道加5RSB 5l和Marker 8

3、l，空泳道加5RSB 5l）。加适量1电泳缓冲液，接好正负电极。开始设为90V恒压。观察marker的移动情况，尽量拉长自己感兴趣的区域，适时终止电泳.转膜1.将电泳后的胶取出浸入转膜液，（注意胶方向，做好标记）摇床缓慢摇30min。戴手套裁取PVDF膜（8.35.2cm），甲醇浸透，倒掉甲醇，浸入转膜液中，至少5min。将取下胶的玻璃板清洗干净。2.用转膜液润湿一张厚滤纸，铺于半干转印仪的底层电极板上，将PVDF膜铺于滤纸上，勿留气泡，将凝胶贴于PVDF膜上，不留气泡。3.润湿另一张厚滤纸，盖在凝胶上面，用玻璃试管赶去气泡。4.盖上顶层电极板，接通正负极电源，15V（不超过25V）转印20min。5.配封闭液。杂交1.取出PVDF膜，和胶相邻面向上浸入封闭液置于摇床缓慢摇1hr以上。2.倒掉封闭液，洗膜液略洗一下，取15ml离心管加入用5ml 杂交液，按适当比例稀释一抗（按说明书要求），管上注明抗体名称，来源，分子量和稀释比例。摇床上室温杂交2hr或4杂交过夜。3.取出PVDF膜，用TBST洗3次，每次5min。4.倒掉TBST，把PVDF膜放入装有二抗（实验室提供）的15ml 离心管中，摇床上杂交1hr。5.取出PVDF膜，用TBST洗3次，每次5min。ECL反应1.倒掉洗膜液，吸去多余液体，转膜时与胶相邻的一面向上，铺于玻璃板上。2.将ECL试剂盒内的detection

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