[复习]组织病理切片的制作过程

1、 复习 组织病理切片的制作过程组织病理切片的制作过程1(取材组织取材的方法是制作切片的一个重要程序，根据教学、科研及外检的具体要求取自人体 (外科手术切除标本、活检标本、尸检标本 ) 或动物，并确定取材 的部位和方法。取材者需要掌握解剖学、组织学、病理学的基本理论知识，还要掌 握实际操作技术，每个组织器官的取材都有一定的部位和方法，不能任意切取组织 作为制片材料，不然，无法达到教学、科研和临床诊断的目的，具体要求如下(1) 材料新鲜 : 取材组织愈新鲜愈好，人体组织一般在离体后，动物组织在处死 后迅速固定，以保证原有的形态学结构。 组织块的大小：所取组织块较理想的体积为 2.0cmX 2.0c

2、mX 0.3cm,以使固定液能迅速而均匀地渗入组织内部，但根据制片材料和目的不同，组织块的较理想 体积也不0.2cm即可，这样可以缩短同，如制作病理外检、科研切片，其组织块可以薄取 0.1,固定脱水透明的时间，若制作教学切片厚取 0.3 ,0.5cm ，这样可以同一蜡块制 作出较多的教学切片。(3) 勿挤压组织块 ： 切取组织块用的刀剪要锋利，切割时不可来回锉动。夹取 组织时切勿过紧，以免因挤压而使组织、细胞变形。(4) 规范取材部位 ： 要准确地按解剖部位取材，病理标本取材按照各病变部 位、性质的不同，根据要求规范化取材。(5) 选好组织块的切面 ：根据各器官的组织结构，决定其切面的走向。纵

3、切或横切往往是显示组织形态结构的关键，如长管状器官以横切为好。(6) 保持材料的清洁 : 组织块上如有血液、污物、粘液、食物、粪便等，可用水 冲洗干净后再放入固定液中。(7) 保持组织的原有形态 : 新鲜组织固定后，或多或少会产生收缩现象，有时甚 至完全变形。为此可将组织展平，以尽可能维持原形。2( 固定(1) 小块组织固定法 : 这是最常用的方法，从人体或动物体取下的小块组织，须 立即置入液态固定剂中进行固定，通常，标本与固定液的比例为 1:4,20 ，但组织 块不宜过大过厚，否则固定液不能迅速渗透。故取组织块的大小一般为2.0cmX 2.0cmX 0.3cm。(2) 注射、灌注固定法 :

4、某些组织块由于体积过大或固定液极难渗入内部，或需 要对整个脏器或整个动物体进行固定。这时宜采用注射固定或灌注固定法。将固定 液注入血管，经血管分支到达整个组织和全身，从而得到充分的固定。(3) 蒸汽固定法 : 比较小而厚的标本，可采用锇酸或甲醛蒸汽固定法。如血液涂 片，则应在血片未干燥前采用锇酸或甲醛蒸汽接触固定。最常用的固定液有 10%甲醛固定液和 95%乙醇固定液。3( 脱水透明标本经过固定和冲洗后，组织中含有较多的水分，必须将组织块内的水分置换出来，这一过程叫做脱水。无论是用石蜡切片，还是用火棉胶切片，都 必须除去组织中所含水分，因含水组织与石蜡、火棉胶等包埋材料不相容，常用的 脱水剂为

5、一系列不同浓度的乙醇。脱水的步骤是 :80%、90%、95%、 100%各种浓度乙醇 2 小时，此过程可用脱水机 自控完成。丙酮也是一种脱水能力很强的脱水剂，但因其脱水能力很强，对组织有剧烈收 缩作用，在制作科研、教学切片时一般不用该试剂。因乙醇、丙酮等不溶于石蜡，还要经过一个能溶于石蜡的溶剂替代过程称为透明。常用的透明剂有二甲苯、三氯 甲烷、水杨酸甲酯等。(1) 使石蜡浸入组织中，取代组织中含有的透明剂。(2) 包埋: 将浸蜡后的组织置于融化的固体石蜡中，石蜡凝固后，组织即被包在 其中，称蜡块，此过程称为包埋。5( 切片和贴片(1) 修整蜡块 : 可视其组织的大小，在组织边缘约 0.1,0.

6、2cm 处，切去余蜡部 分，否则易造成组织皱缩不平。(2) 准备好切片用具 : 切片刀、毛笔、眼科镊子 (弯) 、漂烘温控仪(3) 安装蜡块 : 将修好的蜡块安装在金属或木制持蜡器上。(4) 安装切片刀 : 将切片刀安装在切片机的刀台上，把刀台上的紧固螺丝旋紧， 使切片时不产生振动，能保持一定的切片厚度。切片的厚度：切片机的厚度调节器上刻有0,50 um或0,25卩m可任意选择其厚度，石蜡切片的厚度一般在4,6卩m。(6) 切片(7)铺片：用眼科镊子镊起蜡带轻轻平铺在 40,45?的水面上，借水的张力和水的温度，将略皱的蜡带自然展平。(8) 贴片、烘片 ： 待切片在恒温水面上充分展平后，将蜡片

7、捞到载玻片的中段处 倾去载玻片上的余水，置入 60,65?恒温箱内或切片漂烘温控仪的烘箱内烤片 15,30分钟，脱去溶化组织间隙的石蜡。6(染色和封片常用的染色方法是苏木素-伊红(Hematoxyli n-Eosi n)染色法，简称 H.E 染色法。这种方法对任何固定液固定的组织和应用各种包埋法的切片均可使 用。苏木素是一种碱性染料 , 可使组织中的嗜碱性物质染成蓝色，如细胞核中的染 色质等; 伊红是一种酸性染料，可使组织中的嗜酸性物质染成红色，如多数细胞的 胞质、核仁等在 H.E 染色的切片中均呈红色。H.E染色程序如下：脱蜡、脱苯、复水、染色、脱水、透明、封固常规苏木素染色中的对比染色是用

8、伊红 , 近年来在英、美国家的一些实验室则 采用焰红(Phloxine),此外也有用桔黄G(OrangeG)比布里希猩红(Biebrichscarlet) 、波尔多红 (Bordeaux red) 等作为对比染色。伊红为染胞质、胶原纤维、 肌纤维、嗜酸性颗粒等常用的染料。1 . 取材取材的好坏，直接影响切片的质量。医生在取材时，首先要有一把锋利的取材 刀，在切割组织时要避免取材刀来回拖拉，切取的组织块厚薄要均匀，一般厚度以0.2 ,0.3cm 为适，较容易发脆的组织如甲状腺、肝脏、血块、淋巴结、大块癌组 织等可适当厚一点，而脂肪组织、肺组织、纤维性肿瘤、平滑肌瘤等致密的或试剂 不易渗入的组织应

9、取薄一些 ; 淋巴结应修掉两侧球冠，并尽量剔除周围的脂肪组 织。在取材中还应十分注意组织内是否有缝线或骨组织，如碰到不可避免的钙化组 织，应与技术室讲明，在切取纤维组织、肌肉、组织、胃肠道时，应注意纤维及肌 肉的走向，取材时尽可能按与纤维平行走向切取为佳。2 . 固定固定是技术室工作的第一步，也是在整个制片过程中无法补救的一步。所谓固定”，就是组织离体后，用各种办法使其细胞内的物质尽量接近其生活状态时 的形态结构和位置的过程。固定的目的是为了防止组织细胞自溶与腐败，防止了细 胞内的酶对蛋白质的分解作用，使细胞内的各和成分如蛋白质、脂肪、碳水化合物或酶类转变为不 溶性物质，以保持原有的结构与生活

10、时相仿。另外，组织固定后，均呈一定的硬化 状态，增加组织韧性，而且不易变形，有利于以后的组织处理。所以组织一旦离体必需及时固定，固定液的量应为组织的 5 倍。固定的关键主要与固定的及时性、固 定液的选择、固定液的浓度、固定的温度和时间有关。最常用的固定液为 10,福尔马林。笔者认为， 10, 福尔马林由于受到福尔马林的质量、使用时的挥发和取材时 带入的水分影响，浓度被降低致组织固定不足，而高浓度的福尔马林，降低了对组 织的穿透性，形成周围固定好而中央固定不到的现象。通过实践，本人认为以酸性12,15,的福尔马林最佳。大标本（2cm厚）一般需要6,12个小时，小标本一般需要 3,6个小时；当室温

11、低18?时，可在37?以下的温箱内加温4,6个小时。由于HE染色最佳着色PH为3.5,4.5,中性福尔马林对苏木素染色有一定影响，细胞核容易发 灰, 核染色质不佳。所以 , 尽管中性福尔马林对抗原有很好的保存作用，但酸性福 尔马林对绝大多数抗原来说也有很好的保存作用，所以在没有特别处理的情况下常 规HE用12,15,酸性福尔马林也可以（每100毫升12,15,福尔马林液内加5毫升冰 醋酸）。骨髓、结缔组织固定以Bouin液为佳，经Bouin液固定后的组织必须流水 冲洗 4 小时以上。有条件的单位可根据不同要求选用二种或二种以上的固定液 ； 少 数单位还可建立组织冷冻库，以便适应各种特殊的处理要

12、求。3. 水洗固定后水洗 （10,20 分钟） ，通常被很多人所忽视，而水洗不彻底，容易造成脱 片和染色不鲜艳。对需做免疫组织化学的组织，更不应当忽视。福尔马林不利于组 织块内抗原的保存4 . 脱水和透明所谓脱水就是利用脱水剂将组织内的水分置换出来，以利于有机溶剂的渗入， 这一过程称为脱水。脱水是否彻底，直接关系到组织是否能充分透明，而脱水过度（原因是组织在纯酒精内时间过久，发生组织质地发生变化 ）容易造成组织发脆。造成组织发脆的原因还有加温 （温度超过 35?）、脱水剂内加有丙酮、浸蜡用的石蜡中二甲苯过多等等。一般我们总认为组织发脆跟高浓度酒精有关，而忽视了与低浓度的酒精关系，其实低浓度的酒

13、精具有强大的穿透力，比纯酒精更容易渗透到组织块内部使之脱水，组织如果在低浓度酒精里充分脱水，在高浓度酒精里只需脱去从低浓度到高浓度之间的水份，因此，仅需短时间就可完成，如果这时不缩短纯酒精的时间，便会引起组织发脆 ; 如果脱水时加温，使用丙酮，还可引起组织收缩，并影响免疫组织化学的标记。为了使石蜡浸入到组织块内，必须经过一种既能与脱水剂混合，又能与石蜡相溶的媒介物质，这个过程称透明。目前最好的透明剂是二甲苯。很多人认为二甲苯极容易使组织发脆,这个观点很片面,在常温下,如果不是时间过长（超过,4 小时以上 ）二甲苯并不会引起组织过份发脆,相反会使某些组织结构比较质韧的组织 : 比如子宫肌瘤等相当

14、好切 ） ，但是当二甲苯温度超过 35?以后，极易引起组织发脆。所以本人认为,大小标本最好分开脱水,一般情况下,大标本脱水时间（室温 18?）以 80,酒精 2小时、 95,酒精（2 道）各 1个半小时至 2小时、纯酒精 （3 道）各 1个半小时至2小时，二甲苯 （2 道）各30-60 分钟为宜;小标本脱水时间应相应缩短。脱水时间长短,与室温高低有密切的相关。我们在实践中发现,室温在 12,15? 时,可作为一个临界温度范围。当室温高于此温度范围时，组织容易脱水，可适当缩短脱水时间而室温低于该温度范围时，应适当延长脱水时间 （ 如能保证在一个恒定的温度下最佳） 。更换试剂，应以量为基础，定量更

15、换，不能等到切片不好时再去更换。否则，至少会有 2,3 批组织切片不好。根据我科经验，如试剂用量为500ml,每 500个蜡块更换一次为宜。5. 浸蜡组织透明后,在熔化的石蜡内浸渍的过程称为浸蜡。用其他浸透剂（ 如火棉胶、明胶等 ） 渗入组织内部的过程可称为浸透或透入。浸蜡温度过高（ 超过 60?） ,在蜡内加入二甲苯蜡或由于透明时带进的二甲苯过多,都会导致组织发硬,还会使组织内的抗原受到破坏 ; 所以作者主张浸蜡用的石蜡熔点在 56?（三道） ,第一道 : 石蜡30分钟;第二道:石蜡 90分钟;第三道:石蜡， 90分钟。浸蜡温度控制在 56,58?左右。 (第一道也可用硬脂酸石蜡 1:3 混

16、合浸蜡，不仅可软化组织，特别适用于比 较韧、硬的组织，而且由于硬脂酸是弱酸性的，对细胞核有媒染作用，核浆比鲜 明，但容易脱片 ; 同时对疏松组织容易散片 ) 。有条件的可以每天打开第一道石蜡的 盖子，让二甲苯挥发。浸蜡所用的石蜡如有杂质尽可能过滤，以防附在组织上，造 成切片刀刀口受损，或切片破碎和划痕增多。6. 包埋用包埋剂来支持组织的过程称包埋。最常用的是石蜡包埋法。包埋的关键一是 平整，二是方位。要求在包埋时，应采用镊子轻压组织块拱起部份，使之平贴于底 部，通常采用组织的最大面包埋。囊壁、管腔组织应竖直包埋。小块多颗组织，应 尽量放在一起，并保证在一个平面上。修去两边的余蜡 ( 所谓的两边

17、，指切片时与 切片刀垂直的两侧 ) 。包埋时还应注意有无缝线，纸絮，如有一定要去除。胃黏膜活检标本，不能按 一般的规律取最大包埋面，应采取窄面竖起包埋。包埋的蜡更应过滤，留有杂质的 石蜡，容易造成污染或刀口受损。蜡的熔点应在 56,58? 之间选择，不提倡在冬天 使用软蜡。因为用软蜡包埋的蜡块，到了夏天，会粘在一起，不利于资料的保存， 而且即使在冬天，用硬蜡包埋的蜡块也比用软蜡包埋的蜡块要好切。7. 磨刀要想切好一张切片，首先要有一把锋利的切片刀。磨刀是从事切片技术人员的 一项最基本技术，刀磨的好坏，直接关系到切片的质量。磨刀的手法各人不同，但 都要求用力均匀，使刀口和磨刀石全面接触，两手的用

18、力点应在刀口上，而不是在 刀背上。切片刀应用一次磨一次，每次仅需 10,15 分钟，过长时间的磨刀，容易把 已经磨出的锋刃磨掉，检查切片刀是否锋利，用手试摸刀口的方法并不十分科学， 不仅不能证明切片刀是否真正锋利，而且容易损害刀口，最简单的办法是每次磨好后拿一个蜡块试切一下。每次磨好刀后，应将磨刀石用盖子盖好，以防灰尘掉在磨 刀石上，用有灰的磨刀石磨刀，会使切片刀产生许多细小的缺口。现在很多单位都 买了磨刀机，磨刀机用来开刀锋和磨缺口的确不错，但由于磨刀的角度和时间不易 精确掌握，故效果并不理想。根据我们的经验，真正的锋刃很难用机器磨出来。次性刀片在很大程度上解决了这个问题。如用一次性刀片，必

19、须及时更换刀口。个刀口切小标本不应超过 20,25 只蜡块，切大标本不应超过 10,15 只蜡块。8. 切片切片的第一步必需粗切。粗切的厚度大约在 ,0,100 微米左右，质地较硬的组织 或较小的组织应再薄一些，粗切致组织全部暴露后，才进行细切。细切至组织块表 面均匀一致，无白点后，再把切的蜡片放入温水中。切片时要求用力均匀、柔和， 摇速不易过快或过慢。过快会导致切片厚薄不均，机器磨损 ; 过慢会使切片增厚。切片厚度一般为 3,5 微米。切片的要求是完整、薄、均匀。切下的片膜其大小形状 应与组织块一致，切片的不完整，常会将重要病变遗漏，导致误诊、漏诊。在切片 放蜡块时，应注意组织包埋的方向，组

20、织的层次，纤维、肌肉等的走向应与切片刀 平行，较难切的部分应放在上面，如皮肤的表皮，肿块的包膜，胃肠道的浆膜等， 这样可以减少组织的断裂现象。操作切片机时应用力均匀，避免用力过重。对脱钙 组织、骨髓，以及已知的钙化组织，应选用固定的刀口，以减少其他部位出现缺口 的可能性。在使用毛笔展片时要防止笔丝进入刀口，因为每切到一根笔丝，就会增 加一个缺口。切片厚度一般为 4,6 微米，有人认为: 只要切片机刻度标着几个微米，切出来的片子就是几个微米。其实不 然，当切片刀不锋利，或切片时速度不匀，或切的较慢时，切的片子都会变厚，只 有在切片刀十分锋利、切片匀速的情况下，才能真正保证其厚度。下面是切片时碰

21、到的问题的原因及可能处理的方法 :(1) 组织发脆 :一般是脱水、透明、浸蜡时间过长、温度过高，并与组织本身质地也有关，在切片时，边切边用嘴向蜡片吹气，可能会好些。 (2) 切片卷起，可能是刀不锋利，或刀锋在另一面，或刀角度过大，切 片太厚等等。 (3) 蜡片弯曲 : 可能是刀锋不均，切片刀未磨直，切片刀与蜡块不平 行。(4) 透明、浸蜡时间过长、温度过高，并与组织本身质地也有关 (5) 厚薄不均 :可能是刀、刀座及蜡块未夹紧，组织太硬，或切片机主轴太向前，或切片机已磨 损。(6) 切片出现裂痕 : 可能是刀有缺口，石蜡内有杂质，组织内有钙化、骨片或有 线结 , 也可能会有棉纸纤维等。 (7)

22、 切片不连片，切不下片，切片很厚，或者切片 后蜡块发白，内陷 :组织脱水不佳。补救办法 : 可先将蜡块溶解，取出组织，放入加 热水浴的丙酮内 (80?) ，30,60 分钟，再进行透明浸蜡包埋切片，也许会好一点。9. 展片与捞片展片水温应在 42?至 47?之间，这主要和包埋蜡的熔点有关 , 水温过高，会引起 组织细胞散开，水温过低，切片皱摺无法摊平。包埋蜡中如有二甲苯，也会造成石 蜡溶解现象。而用一次性刀片切的片子，一碰到热水，片子上的皱摺就无法再展 开，这有二个方法可以解决 : 第一、可以在切片时边切边向蜡片吹气，这样的片子 就会非常平整，放到热水里就会自然展开，比较方便快捷，但这样的片子会略微厚 一点; 第二、在切完片子后，先把切片放在 30%酒精水溶液中，让酒精的张力自动把皱摺展开，然后再将切片移到热水，这样的片子会较薄 ; 如酒精浓度过高，容易 引起切片破碎，出现裂隙，像脂肪之类细