药学分子生物学：第二章 DNA的复制、突变、损伤和修复

1、第二章 DNA的复制、突变、损伤和修复 第二章DNA的复制、突变、损伤和修复补充基础内容：DNA的结构1. DNA的一级结构：DNA分子中核苷酸的排列顺序。由于核苷酸之间的差异仅仅是碱基的不同，故可称为碱基顺序。从5到3端书写生物学意义：v DNA是巨大的生物高分子。v 生物世界里形形色色的遗传信息都包含在组成DNA的A, G ,C, T这四种核苷酸的排列顺序之中。DNA一级结构的不同是物种间差异的根本原因。v DNA分子中碱基顺序决定着蛋白质分子的氨基酸排列顺序。 2、双螺旋模型有以下特点(1) DNA分子由两条反向平行的多核苷酸链组成，形成右手双螺旋 (2) 两条链反向平行，即两条链的方向

2、相反(3) 糖一磷酸键是在双螺旋的外侧，碱基对与轴线垂直(4) 糖与附着在糖上的碱基近于垂直(5) 碱基配对时，必须一个是嘌呤，另一个是嘧啶(6) DNA双螺旋有大沟（major or wide groove）和小沟（minor or narrow groove）的存在3、DNA 的三级结构v 超螺旋结构(superhelix 或supercoil): DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构 正超螺旋(positive supercoil): 盘绕方向与DNA双螺旋方同相同 负超螺旋(negative supercoil): 盘绕方向与DNA双螺旋方向相反 v DNA超螺旋结构整体或局部的拓扑学

3、变化及其调控对于DNA复制和RNA转录过程具有关键作用。第一节 DNA复制一、DNA的一般复制特征DNA复制：亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分别以各单链DNA分子为模板 聚合与自身碱基可以互补配对的游离的dNTP，合成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代DNA分子的过程。复制子（Replicon）又称复制单位或复制元：DNA中含有一定复制起点和复制终点的复制单位（一） DNA的半保留复制（Semi-Conservation Replication）：复制过程中各以双螺旋DNA的其中一条链为模板合成其互补链，新生的互补链与母链构成子代DNA分子子代的DNA双链中，一条是原来的链，另一

4、条是新合成的链(二)复制起点、复制子、复制叉、复制终点、复制方向1、复制起点（origin of replication, ori or O）：复制开始处DNA分子的特定位置v 原核生物（Prokaryote）：单复制起点整个染色体只有一个复制单位 v 真核生物（Eukaryote） : 多复制起点一个genome中有多个复制单位复制起始区的结构特点是：（1）富含AT，这可能和双链易于解开起始复制有关（2）含有多个较保守的回文结构，8个GATC （914个GATC）, GATC中的“ A”已甲基化（3）具有 4个反向重复顺序，作为蛋白结合位2、复制子(replicon)：DNA复制从起点开始双

5、向进行直到终点为止，每一个这样的DNA单位称为复制子或复制单元v 在原核生物中，每个DNA分子上就有一个复制子;v 在真核生物中，细胞DNA的复制是由许多个复制子共同完成的。两个起始点之间的DNA片段，称为一个复制子。3、复制叉:DNA分子复制时，在复制起点两条链解开成单链状态，两条单链分别作为模板，各自合成其互补链，这种Y形的结构称为复制叉。4、复制方向（复制过程的顺序性）（1）双向复制:从固定的起始点开始，以双向等速复制方式进行复制，即从原点开始在两个方向各有一个复制叉在延伸。直至与邻近的复制叉会合，这种方式称为双向复制。大多数原核和真核生物及许多病毒DNA是进行双向复制。是最重要的复制方

6、式。（2）单向复制：从特定的位置开始，单向进行。如质粒ColE1（3）不对称的双向复制：如枯草杆菌的复制从原点开始双向复制，但两个复制叉的移动不对称，一个移动1/5的距离便停下来，然后另一个复制叉走完4/5的距离线粒体的复制也是不对称的，DNA链中的一条链复制67%，另一条链才开始复制。单双向复制取决于起点处有一个还是两个复制叉（三） DNA复制过程DNA复制的半不连续性 （Semi-Discontinuous Replication） 1、先导链（leading strand）：DNA复制时，与复制叉向前移动的方向一致，以35链为模板，按53方向连续合成的一条链（先导链按dUMP 片段连续复

7、制）2、后随链（lagging strand）：后随链按冈崎片段不连续复制冈崎片段(Okazaki fragment): DNA复制不连续合成链中形成的短DNA片段(四) DNA复制的酶学1、使DNA链解离的酶和蛋白质（1）解螺旋酶（helicase）:又称解旋酶单链结合蛋白（SSB single-strand binding protein）：可以促使DNA在复制叉处打开双链v 解旋酶可以和单链DNA结合，并且与ATP结合，利用ATP分解成ADP时产生的能量沿DNA链向前运动促使DNA双链打开v 解旋酶是一类解开氢键的酶，由水解ATP来供给能量，它们常常依赖于单链的存在，并能识别复制叉的单链

8、结构。（2）单链结合蛋白（SSB，single strand DNA-binding protein）：结合于螺旋酶沿复制叉方向向前推进产生的单链区，防止新形成的单链DNA重新配对形成双链DNA或被核酸酶降解的蛋白质。在原核中SSBP与DNA结合表现出协同效应（若第一个SSBP的结合能力为1，则第二个SSB的结合能力为103。这可能因为:SSBP之间的相互作用/第一个SSBP和DNA的结合改变了DNA的结构。）真核生物的SSBP则不表现协同效应。SSBP并不是酶，是由177个氨基酸组成的蛋白E.coli的SSBP以四聚存在，分子量为74KDa，结合在单链上，每个分子可以覆盖32Nt，使DNA受

9、到保护，不被酶水解，也不回复成双链。（3）DNA旋转酶（topoisomerase,又称拓扑异构酶）：消除复制叉前进过程中产生的正超螺旋，产生负超螺旋v 复制过程中，DNA双螺旋的解旋使复制叉前面产生正超螺旋，将妨碍复制叉的前进。DNA拓扑异构酶则可以使超螺旋分子松弛。v 大肠杆菌中起主要作用的是拓扑异构酶，它能够产生负超螺旋以抵消复制叉移动所产生的正超螺旋，防止正超螺旋的积累，使DNA片段以负超螺旋的形式存在。2、DNA聚合酶（DNA polymerase）：原核细胞中的DNA聚合酶/真核细胞中的DNA聚合酶此酶最早在大肠杆菌中发现，以后陆续在其他原核生物及微生物中找到。这类酶的共同性质是:

10、1 以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为前体催化合成DNA;2 需要模板和引物的存在;3 不能起始合成新的DNA链;4 催化dNTP加到生长中的DNA链的3-OH末端;5 催化DNA合成的方向是53。 原核细胞中的DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I（DNA pol.I）大肠杆菌DNA聚合酶II（DNA pol.II）大肠杆菌DNA聚合酶III（DNA pol.III）DNApolv DNA polymerase I只有一条多肽链，102KDav DNAPol在空间结构上近似球体，直径约65A。v 在酶的纵轴上有一个约20A的深沟(cleft)，带有正电荷，这是该酶的活性中心位置。v 聚合作用：在引

11、物RNA-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApol逐个将核苷酸加上去，就是DNApol的聚合作用。v 35外切酶活性校对作用： v 53外切酶活性切除修复作用，这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起着重要作用。每次能切除10个核苷酸，对冈崎片段5末端DNA引物的去除依赖此种外切酶活性。Klenow fragment：通过温和的蛋白水解反应，DNA pol. I的多肽链可被断裂成两部分： l 大片段: 保留了53DNA 聚合酶活性和 35酸外切酶活性；该特性在分子生物学技术中常被用于DNA合成，或切除一条亲本链和不需要的引物。l 小片段：具有53核酸外切酶活性DNApol和

12、DNApol 的主要特性和功能 两者都有条件模板、引物 DNApol 主要用于DNA的修复和RNA引物的替换 DNApol DNA链的延长聚合方向： 53DNA pol ：为寡聚酶，由十个不同的亚基组成，核心酶部分,和，亚基有53聚合酶活性；亚基有35核酸外切酶活性，校对和编辑；亚基组建核心酶复合体（是原核生物体内真正起复制作用的酶）真核细胞中的DNA聚合酶v 聚合酶：参与DNA复制。合成先导链；v 聚合酶：参与DNA复制。唯一具有引物链活性，为引物酶合成后滞链；v 聚合酶：参与DNA 修复；v 聚合酶：线粒体DNA复制；v 聚合酶：功能不祥。3、DNA连接酶（DNA Ligase）：是一种封

13、闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5-PO4与另一DNA链的3-OH生成磷酸二酯键。 所需条件： a、切刻的 3OH 和 5P 相邻 b、切刻各自碱基处于配对状态 c、需要能量: 原核（ATP、NAD） 真核（ATP）小结：DNA复制的特征v 半保留复制v 半不连续复制-冈崎片段v 双向复制v DNA复制速度快 细菌104105核苷酸/分钟，真核细胞5005000核苷酸/分钟，多复制起点v DNA复制的准确性： -高度的忠实性和准确性？二、原核生物DNA复制 (DNA replication in Prokaryote)（一）大肠杆菌（E. coli）DNA复制

14、的起始大肠杆菌的复制起点为oriC，是由245个碱基对组成，这些序列在大多数细菌中是高度保守的，关键序列是3个13bp和4个9bp的重复序列。(1)复制的引发，起始复合体由六种蛋白组成：DnaA, DnaB, DnaC, 组蛋白样蛋白(HU)，旋转酶（拓扑酶），单链结合蛋白(SSB)起始复合物：20个各带1个ATP的DnaA蛋白结合于9bp顺序，使DNA围绕着复合物卷成一圈开放复合物：三个富含A=T的序列13bp重复序列被变性预引复合物：在DnaC蛋白的帮助下DnaB蛋白进一步使DNA解螺旋，以备引物和DNA的合成有9个蛋白和酶参与复制的起始v DnaA蛋白 识别原点顺序在特定位点上打开DNA

15、双链v DnaB蛋白 DNA解螺旋v DnaC蛋白 帮助DnaB蛋白与原点结合v HU 刺激复制起始v 引物酶、DnaG蛋白 合成RNA引物v SSB 结合单链DNAv RNA聚合酶 促进DnaA蛋白激活 v DNA旋转酶 释放解螺旋时产生的张力v Dam甲基化酶 甲基化原点的5GATC序列(二）复制的延伸（elongation）在引发体（引物酶、DnaG的作用下）在原点处合成一小段RNA引物（10-60个碱基），然后由DNA聚合酶合成DNA链。前导链合成一个引物，滞后链断续合成多个引物。位于复制叉处的多酶复合体（引发体）必须快速从一个冈崎片段移到另一冈崎片段复制体使先导链和后随链几乎同时复制

16、（三）复制终止1、环形DNA复制的终止 a、终止序列E.coli 有两个终止区域，分别结合专一性的终止蛋白 序列一：terE terD terA 序列二：terF terB terC 每个区域只对一个方向的复制叉起作用 b、专一性终止蛋白 E.coli 中由 tus gene 编码（terminus utilization substance）通过抑制DNA螺旋酶而发挥终止作用；每次复制时只使用一个终止位点三、真核生物DNA复制 (DNA replication in Eukaryote)复制概况 a、多个复制元（multiple replicon ），双向复制 b、复制元相对较小(13-90

17、0kb),复制速度较慢,大约5005000bp/min（3000bp/min） 冈崎片段100200NTc、复制终止通过复制叉的相遇而终止端粒DNA (Telomer) ：TTGGGG(T2G4)序列高度重复的末端 原核生物和真核生物DNA复制的比较 相同点：1. Semi-conservative replication2. Semi-discontinuous repliction3. DNA helicase, Ssb4. RNA priming5. 校正阅读（Proofreading）不同点：1. 复制起点（单、多）2. 复制子（原核生物远远大于真核生物、多少）3. 复制起始的许可因子

18、的控制 （复制周期的重叠与否）4. 复制叉移动的速度 (原核/真核=900/50 nt/S)5. 冈崎片段的大小（原核生物是真核的10倍）6. 端粒和端粒酶7. DNA聚合酶Polymerases四、线粒体DNA复制v 真核生物有两类细胞器能携带遗传物质，即线粒体(mitochondrion)和叶绿体(chloroplast)。植物细胞既有线粒体又有叶绿体，而大多数动物细胞只有线粒体。v 线粒体是细胞内一种重要的细胞器，具有复杂的亚显微结构和能量转换系统，它通过氧化磷酸化作用为细胞生命活动提供能量，因此线粒体被形象地比喻为细胞的“动力加工厂”。v 线粒体普遍存在于真核细胞（除了成熟的红细胞）。

19、mtDNA是裸露的双链分子，一般为闭合环状结构，也有线性的。与核DNA有明显的不同： mtDNA与原核生物的DNA一样，没有重复序列mtDNA的浮力密度比较低mtDNA的碱基成分中G、C的含量比A、T少mtDNA的两条单链的密度不同（重链，H链；轻链，L链)mtDNA单个拷贝非常小，是核DNA十万分之一线粒体基因组大小变化较大，从哺乳动物的约16kbp到高等植物的几百kbp线粒体DNA的结构：双链闭环结构；重链(H链)：含有大部分鸟嘌呤(G)的链,轻链(L链) ：含有大部分胞嘧啶(C)的链 , 有各自的复制起始区;人mtDNA长16569 nt；聚合酶负责复制线粒体DNA。mtDNA的复制-D

20、环(D-loop)复制方式1. 以H链为模版首先合成：v 在复制起点处以H链为模板，合成RNA引物，v 然后由DNA聚合酶催化合成一个500-600bp长的L链片段。v 该片段与H链以氢键结合，将亲代的L链置换出来，产生一种D环复制中间物。2. H链片段的继续合成：v 上述产生的H链片段由于太短而很容易被挤出去恢复线粒体DNA完整的双螺旋结构。v 但有时这个片段会继续合成，这需要依靠拓扑异构酶和螺旋酶的作用将双链打开。3. 以L链为模版合成开始：以被置换下来的亲代L链为模板，离L链合成起点30%基因组的位置开始合成H链DNA，合成也需要RNA引物。4. 复制的完成：v H链的合成提前完成，L链

21、的合成随后结束。v 线粒体DNA合成速度相当缓慢，约每秒10个核苷酸，整个复制过程需要1个小时。v 刚刚合成的线粒体DNA是松弛型的，需要40分钟将其变成超螺旋型。线粒体基因与疾病mtDNA的遗传特征： -比核DNA重复性小，信息密度高，不含内含子序列； -部分区域呈基因重叠，该区域内任何一种突变都将影响线粒体的功能； -突变频率高于核DNA，并缺乏修复功能。 mtDNA突变类型主要碱基替换突变和缺失及插入突变。mtDNA突变引起的疾病v 勒伯尔遗传性视神经病(LHON):视神经炎引起的视神经萎缩，mtDNA上9个位点的突变v 神经源性肌软弱：共济失调伴视网膜色素变性。mtDNA的第8993核

22、苷酸TG,使ATP酶第6亚单位的第156位亮氨酸精氨酸；v AD:老年性痴呆症。NADH脱氢酶基因第5460核苷酸GA突变v 帕金森病:脑组织，血小板及肌肉mtDNA中酶复合物I缺乏，另一些患者酶复合物的缺乏。复习要点基本概念v 半保留复制，半不连续复制，复制子，复制叉，SSB，冈崎片段，端粒，端粒酶简答：v DNA复制的一般特征v 参与DNA复制的酶类v 原核生物与真核生物DNA复制的区别v 线粒体DNA复制的特点第二节 DNA突变/损伤突变是遗传物质中非遗传重组产生的任何可遗传的改变。突变可能发生在染色体水平或基因水平，前者称为染色体畸变，后称为基因突变。基因突变分为自发突变和诱发突变两类

23、。基因突变可以由于碱基对的置换或者一个或多个碱基的增加和减少而引起。一. 突变概念和类型(一)突变的概念突变(mutation)是指DNA碱基序列发生可遗传的永久性的改变。 野生型(wild type)基因：没有发生突变的基因。 自发突变(spontaneous mutation):自然发生的突变。 诱发突变(induced mutation):由一些物理因素或化学试剂引起的突变。突变剂(mutagen):引起突变的物理因素(如X-ray)和化学因素(如亚硝酸等)。突变生成作用(mutagenesis):由于突变剂的作用而产生突变的过程或作用。突变基因(mutant gene):带有突变位点的

24、基因。突变体(mutant):带有突变基因的生物个体或群体。(二) 突变类型：1.根据使DNA碱基序列改变，可分为点突变、碱基插入、碱基缺失等。(1)点突变(point mutation)：由于DNA碱基对的改变引起的基因突变(单/多点突变)点突变通常指碱基替代，有很高的回复突变率。v 转换（transition）：是指嘌呤与嘌呤之间，或嘧啶与嘧啶之间的替换AG, GA 或 CT, TCv 颠换（transversion mutation）：指嘌呤变嘧啶，或嘧啶变嘌呤。(2)碱基插入(base insertion)：通常指较长的碱基序列的增加。(3)碱基缺失(base deletion)：通常

25、指较长的一段碱基序列的缺少；回复突变率很低。2.对阅读框架的影响，称为移框突变(frame shift): 插入、缺失一个或两个碱基都能引起移框突变。3.根据对遗传信息的改变情况分类，可分为：(1)同义突变(synonymous mutation)又称沉默突变(silent mutation): 单个碱基置换后，改变前后密码子所编码的氨基酸一样。(2)错义突变（Missense mutation）：DNA分子中的核苷酸置换导致合成的多肽链中一个氨基酸被另一氨基酸所取代。(3)无义突变（Non-sense mutation）：单个碱基置换导致终止密码子（UAG、UAA、UGA）提前出现。产生的蛋

26、白质（或酶）常常失去活性或丧失正常功能。如赖氨酸的密码子AAG突变为终止密码子TAG, 酪氨酸的TAC突变为TAA或TAG终止密码子。若无义突变的终止密码子使肽链合成过早终止, 因而蛋白质产物一般没有活性, 若是发生在基因DNA的3末端处, 它所表达产生的多肽常有一定活性或有部分活性, 这种突变又称为渗漏变型（leaky mutation）。4. 根据突变表型对外界环境的敏感性可分为： 非条件性突变: 对外界环境不敏感条件性突变：温度敏感突变5. 突变效应：正向突变：改变了野生型性状的突变。回复突变：突变体失去的野生型性状可以通过第二次突变得到恢复，这第二次突变称回复突变。6. 影响基因调控的

27、序列：突变位点位于基因调控的DNA序列中，如启动子区域，操纵子区域，调节基因等。二、突变的原因自发突变：自然条件下产生的突变，是生物进化发展的重要源泉，也是动植物和微生物育种的重要材料v 突变率（mutation rate）是指在单位时间内某种突变发生的概率。 1、DNA复制错误 2、互变异构体导致错误碱基配对 3、自发的化学变化: 脱嘌呤（depurination） 脱氨（基）(deamination)作用4、氧化作用损伤碱基（oxidatively damaged bases）v 过氧化物原子团（O2-）,（H2O2），（-OH）等需氧代谢的副产物都是有活性的氧化剂， v 它们可导致DNA

28、的氧化损伤，v T氧化后产生T乙二醇，v G氧化后产生8-氧-7,8二氢脱氧鸟嘌呤、8-氧鸟嘌呤(8-O-G)或“ GO”，v GO可和A错配，导致GT诱发突变:人工条件下生物体发生的突变，跟自发突变一样，都是遗传物质的化学变化，都是DNA双链分子中碱基的变化1、放射线: 紫外线、 X-射线、 射线、 宇宙射线紫外线诱发胸腺嘧啶二聚体，TT的紧密连接引起双螺旋变形，阻断转录，并暂时阻断DNA复制，引起细胞死亡，可被修复2、化学物质（1）碱基类似物5-溴尿嘧啶（5-bromouracil,5-BU）:和T很相似，仅在第5个碳元子上由Br取代了甲基 5-BU有，酮式，烯醇式两种异构体，可分别与A及

29、G配对结合2-氨基嘌呤(2-AP)也是碱基的类似物，有正常状态和稀有状态两种异构体，可分别与T和C配对结合。当2-AP掺入到 DNA复制中时，由于其异构体的变换而导致ATGC迭氮胸苷（AZT, azidothymidine） （2）碱基的修饰剂亚硝酸（introus acid, NA）有氧化脱氨作用，可使G第2个碳原子上的氨脱去，产生黄嘌呤（xanthine,x），次黄嘌呤 (H) 仍和C配对，故不产生转换突变。但C和A脱氨后分别产生U和次黄嘌呤H，产生了转换，使CG转换成AT，AT转换成GC羟胺只特异地和胞嘧啶起反应，在第4个C原子上加-OH，产生4-OH-C，此产物可以和A 配对，使CG转

30、换成TA烷化剂, 如甲基黄酸乙脂（EMS）,氮芥(NM),甲基黄酸甲脂（MMS）,亚硝基胍（NG）等 使碱基烷基化，EMS使G的第6位烷化，使T的第4位上烷化，结果产生的O-6-E-G和 O-4-E-T分别和T、G配对，导致GC对转换成AT对；TA对转换成CG（3）DNA插入剂原黄素（proflavin）；吖啶橙（acridine orange）溴化3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓（etnidium bramide）；ICR的复合物等DNA损伤三种效应： -使DNA链戊糖和磷酸组成的骨架被破坏，造成单链断裂； -双链解开； -核苷酸的碱基改变。三、突变体的分离与分析(一）突变体的分离v

31、 条件突变体温度敏感突变体v 突变常常是隐性的由于等位基因的补偿，突变体依然正常生长，可通过杂交、回交和自交，来观察基因突变的发生和效应。（二） 突变体的分析1. 遗传检测法（1）根据重组载体的抗药性标志筛选（2）-半乳糖苷酶法:凡是能生长并呈白色的菌落，其细胞中就含有插入目的的序列的重组质粒四、突变与人类疾病镰刀状红细胞贫血症；地中海贫血症；先天性缺陷型糖尿病；血友病； 苯丙酮尿症是一种常见的氨基酸代谢病，是由于苯丙氨酸代谢途径中的酶（苯丙氨酸羟化酶）缺陷，使得苯丙氨酸不能转变成为酪氨酸，导致苯丙氨酸和苯丙酮酸在体内堆积并从尿中大量排出。第三节 DNA修复一、复制修复自发性损伤(复制中的损伤

32、、碱基的自发性化学改变、自发脱碱基、 细胞的代谢产物对DNA的损伤)物理因素引起的损伤(电离辐射、紫外线)化学因素引起的损伤（烷化剂、碱基类似物） 引起损伤的类型：碱基脱落、碱基（或核苷）改变、错误碱基（碱基的取代）、碱基的插入或缺失、链的断裂、链交联（链内、链间）、嘧啶二聚体等等 DNA聚合酶的校对功能: 尿嘧啶-N-糖苷酶修复系统（复制时U的渗入、C脱氨氧化成U）（一） 尿嘧啶-N-糖苷酶系统 ( ung system )修复尿嘧啶的来源：dUTP的渗入，胞嘧啶的自发脱氨氧化（二）错配修复系统v 错配率：10-5/DNA分子v 99%：复制酶校正； v 10-7：错配修复系统修正 识别错配的碱基对对错配的一对碱基要能准确区别哪一个是错的，哪一个是对的切除错误的碱基，并进行修复合成（1）组成DNA腺嘌呤甲基化酶(m6A甲基化酶) dam geneDNA polymerase；Helicase；SSB；外切核酸酶 (和)； 连接酶MCE (mismatch correct enzyme): 3 subunits mutH, L, S 识别新生链中非 m6A 的GATC序列扫描新生链中错配碱基酶切含错配碱基的新生DNA区段 DNA合成过程中的甲基化变化（错配修复系统受甲基化的引导）DNA中的GATC(palindromic se