枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备和转化

1、 枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备和转化 法进行，详述如下：采用改进的Spizizen ，试剂A SPI-A Salts Solution：132 ）SO0.4% 硫酸铵（NH 4 4 2228 2.8% KHPO3HO 242136 1.2% KHPO 42210 水）即二水合柠檬酸三钠 0.2% Trisodium Citrate Dihydrate（柠檬酸三钠-2- 20min灭菌（每次用完要灭菌）121 SPI-B Salts Solution：0.04%MgSO7HO 120 24*121 20min灭菌（每次用完要灭菌） 100CAYE solution : 2% Casamino a

2、cid（酪蛋白水解物） 10% Yeast Extract 121 20min灭菌（灭菌一次，每次在超净台取样） 100EGTA solution：10mMol/L EGTA (NaOH调pH 至8.0) SPI Medium（20ml） SPII Medium（6 ml） 9.8 ml SPI-A Salts Solution 5.88ml SPI Medium 9.8 ml SPI-B Salts Solution 60ul 50mM CaCl2 200ul 50% Glucose（0.1g） 60ul 250mM MgCl2 CAYE solution 200ul 100 注：SPI、S

3、PII 量比较少，容易干，确保大肠转化成功再配。 B 感受态细胞的制备和转化 1.前一天晚上挑取宿主菌（单菌落）接种于一支5mlLB液体摇瓶，37摇床过夜 2. 第二天早上取100ul过夜培养的菌液，接种于50ml离心管配好的5ml SPI Medium中，37摇床培养，3h后开始测OD600（一般不用测），当培养物声场到对数末期时，快速取200ul接种到2ml SPII Medium中， 37100rpm 1.5h 3. 加20ul100EGTA溶液，37100rpm 10min， 用1.5ml离心管分装成500ul每管 4. 向管中加入适当的质粒，5-10ul，轻轻混匀与37100rpm

4、30min 5. 将离心管转移到250rpm，37，1.5h 6. 以4000rpm离心收集菌体。弃部分上清，留100ul重悬菌体，涂布于响应的抗性平板。37过夜。 离心管选用10ml或者50ml带螺帽的底部尖的离心管。 感受态细胞不能保存，因此，需要现做现用 大肠的抗性（Amp），枯草的（Kan） 枯草芽孢杆菌感受态的制备与转化 过夜培养LB培养基中，371）挑取枯草芽孢杆菌168单菌落与3mL液体（5 ml SPI培养基中，37，200rpm（2）取100ul过夜培养物，接种于震荡培养，当培养至对数期末期，快速取200ul接种于2ml的spII培养基， 37，100rpm震荡培养，培养1.

5、5h （3）加入20ul100EGTA溶液，37，100r/min震荡10min（分500ul/管） （4）向管中加入适量质粒1-5ul，混匀，37，100r/min，震荡30min。 （5）调整摇床转速，250r/min继续培养1-2h （6）取适量体积的细胞，涂布在含有相应 抗生素的LB平板上，过夜培养 枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备（可保存的） 1. LB平板上，37过夜培养 挑单菌落，接种于5 ml GM 溶液，302. 125rpm，摇床过夜培养 次日，取2ml转接到18ml GM 中，3. 37， 250rpm， 3.5h 再取10mL4. 上一步骤的培养液转接到90mL GM 中，

6、37，125rpm，1.5h， 5000rpm 10min 5. 用10mL原培养液上清液轻轻旋复浮菌体，即为感受态细胞 6. 加30% 的灭菌甘油至终浓度10%（500ul/管） 10最低盐溶液（100mL） KHPO 14g 42KHPO 6g 42（NH4）SO 2g 42NaCHO2HO 1g（二水合柠檬酸三钠） 25376MgSO7H2O 0.2g 4氨基酸溶液 2mg/ml，贮存于棕色瓶内，113灭菌30min，用黑纸包裹 GM GM 95mL 1最低盐溶液 1最低盐溶液 97.5mL 1mL 葡萄糖50% 50% 葡萄糖 1mL 5% 0.4ml 水解酪蛋白 5% 水解酪蛋白 0

7、.08ml 酵母汁10% 1mL 10% 酵母汁 0.04mL 2.5ml 氨基酸溶液2mg/mL 0.5M MgCl2 0.5mL 0.1M CaCl2 0.5ml 0.5ml 氨基酸溶液2mg/mL 枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及转化方法LBgrowth medium（37过夜培养；接种量1%至液体培养基中，1. 挑取单菌落接种于LB 0.85-0.95；37培养至OD为含有0.5M山梨醇），600nmEM5min；用冰冷的，5000rpm 离心2.冰上预冷10min后，转至预冷的50ml离心管，4，洗四次，将培甘油）36.434g；10%medium, 0.5M 山梨醇；0.5M甘露醇 （electroporation 养液中的成分全部去除；10，即得到感受态细10cfu/ul体积冰冷的EM中，使细胞终浓度为1-1.33.将沉淀悬于1/40 ）胞（无需液氮处理，可直接存储于-70以不加质粒的感受态细胞作为阴性对），1ul整合质粒（浓度1-5ug/ul4.将80ul感受态细胞与 照。5min 5.转至预冷的电转杯中，冰上放置4.0-5.9ms，采用2500V/mm电转杯，采用2000v/mm，4.5-5.9ms电击；2mm6. 1mm电转化杯， 电击一次) 0.38M甘露醇含有 0.5M山梨醇，立即加入7.