一代测序常见问题及解决策略知识分享

1、学习资料 测序常见问题及解决策略 一、 PCR常见问题 1. 假阴性，不出现扩增条带 PCR出现假阴性结果，可从以下几个方面来寻找原因： 1） 模板：模板中有杂蛋白；模板中有Taq酶抑制剂；在提取制备模板时丢失过多；模板核酸变性不彻底。 2） 酶：酶失活或反应时忘了加酶。 2+2+浓度过高可降低PCR浓度：Mg3） Mg扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 4） 反应条件：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。

2、5） 靶序列变异：靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。 2. 假阳性 假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。常见原因有： 1） 引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。 2） 靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离

3、心管外。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。 3. 出现非特异性扩增带 PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现 仅供学习与参考学习资料 特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。三是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计

4、引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法。 4. 出现片状拖带或涂抹带 PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板量，减少循环次数。 二、 一代测序结果常见问题及分析 原始数据图片为： 仅供学习与参考学习资料 图1 分析后无干扰峰的常规序列图为： 图2 常见问题有： 1. 钉子峰 图3 产生原因：样品或毛细管内有气泡或灰尘、结晶等固体

5、小颗粒反射激光，所 仅供学习与参考学习资料 以信号很高，而且所有波长（4色）都有。 解决办法：灌胶时不要产生气泡；使用过的毛细管在取下一段时间后，重新安装前要清洗；要经常擦去灰尘；样品纯化干净。 2. PCR产物测序时出现重叠峰 1） 单一位点（图4）或两个位点（图5）的碱基缺失导致测序结果移码 图4 图5 产生原因：碱基缺失常见在PCR产物中，特别是从基因组中扩增得到的PCR片段，如上图所示，单一位点或两个位点的缺失会导致测序结果移码，影响碱基的判读。 解决策略：将PCR产物克隆到质粒（如T载体）中挑单克隆测序，或将PCR产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序。或使

6、用反向引物继续测序，以矫正缺失位点并达到测通的目的。如果可以确定该PCR片段中不应该有缺失的位点，那么可以改变PCR反应条件，重新扩增。 2） 测序引物碱基缺失 仅供学习与参考学习资料 6 图 ，和模板的碱基端缺失）产生原因：测序引物有碱基缺失（一般是引物的5所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移缺失有些类似，表面在图形上便是一开则从测序一开始就出现移码，码，而引物碱基缺失的话， 始就是严重的峰形重叠。 PAGE解决策略：重新合成引物，或将引物进行纯化。 克隆测序时出现峰形重叠3. 7 图 产生原因：所挑选的重组子不是单克隆，所提供的测序用质粒中含有两种 以上插入片段不同的质

7、粒；或是送测序的菌液污染。，提质粒或送菌液再次 解决策略：重新挑单克隆的菌落（划线分离单菌落） 测序。 突变位点样品有杂合4. / 仅供学习与参考学习资料 8 图 或也就说范本本身在这个位点出现突变；产生原因：范本中有杂合型突变，那么测序图如果范本有杂合突变或缺失，者是从基因组中扩增出来的杂合位点。如图中形中其他的位点一般都是单一的峰形，然后突然在某一个点出现重叠峰( )。箭头所示 片段克隆到载体再测序。解决策略：建议将DNA 结构 Poly A/T5. 9 图 10 图 仅供学习与参考学习资料 产生原因：如图9、10所示，在Poly A/T结构出现后，测序酶容易在模板上滑动，导致Poly A

8、/T结构后的峰形变得杂乱，出现移码现象。 解决策略：使用反向引物对模板进行测序，测到该poly结构处，即可完成模板全长的拼接。 6. G/C特殊结构区 图11 产生原因：序列中存在一个GC特殊结构区，在该区域后，信号迅速减弱。 上图的下半部分是对测序反应进行优化后的测序结果，在GC特殊结构后，测序信号得到一定程度的改善，但是离一般的测序结果还是相差甚远。 解决策略：针对该类型的模板，一般应从反向进行测序，然后在该特殊结构区附近将两个方向的测序结果拼接起来，得到完整的序列。 7. 基因中含有重复序列 仅供学习与参考学习资料 12 图 的结果一样，Poly A/T产生原因：样品中含有重复序列导致的

9、测序结果和而较长的重复序会导致复制框滑动，较短的重复序列会导致测序结果出现移码； 列会使信号衰减。但不是一定都能(解决策略：反向测序有时能够顺利的通过重复序列区域 ，通过多次的测序结果比对，拼接可以得到全序列结果。够) 背景峰杂8. 模板杂） 1 13 图 扩增产物PCR 产生原因：与目的片段条带大小只相差几个碱基的非特异性测序反应敏感而客观，可以直接反应出模板DNA是无法用肉眼区分开的。但是 本身的情况。如上图所示，该反应的背景信号较高，不利于碱基的判读。产物克隆到质粒或者可以将该PCR重新扩增。PCR解决策略： 改变条件， 中，初步筛选后进行单克隆测序。 仅供学习与参考学习资料 2） 引物

10、不纯 图14 产生原因：引物不纯造成移码现象，与模板杂在峰图上均表现为背景峰杂，但是引物不纯在峰图上表现的更有规律，一般在每一个主峰前都有一个同一碱基的小峰。 解决策略：重新合成引物，或者将引物进行PAGE纯化后再进行测序。 9. 模板不单一 1） 菌液为非单克隆 仅供学习与参考学习资料 15 图 位点处测序结果出现双在83载体测序的结果， 产生原因： 上图是pGEM-T这是由即测序结果在载体部分很准确，而进入插入片段后出现双峰的情况。峰，于在接种时没有挑单菌落导致的，当两个以上的正常的克隆（插入片段方向相鉴定很难看出异常，尤PCR反），或正常克隆与空载体混在一起，而通过酶切和 克隆时经常碰到

11、。其在T-A反应解决策略：重新涂平板挑单菌落测序。需要注意的是，重新进行PCR 或者酶切鉴定仅能证明该克隆含有插入片段，并不足以证明模板的单一。 产物不纯 2）PCR 仅供学习与参考学习资料 16 图 位置有197bp 197bp前测序峰表现为杂或有明显套峰，且在 产生原因：在左右产物中有一个片段大小为200bp这个A峰标志着此PCR一个高高的A峰， ）A高峰终止。PCR的小片段。（注：产物测序都是以 产物切胶纯化，再进行测序。解决策略：对 PCR 回文结构10. 仅供学习与参考学习资料 图17 产生原因：位点94至 137是一个回文结构，该结构导致后面的信号衰减，出现错误的判读。 解决策略：

12、使用反向引物对模板进行测序，测到该回文结构处，即可完成模板全长的拼接。 11. 酒精峰和染料峰 图18 产生原因：Big dye测序反应试剂盒（BDT）中的big dye mix稀释过度出现染料峰，纯化的酒精没有挥发干净则会出现酒精峰，一般情况下这样的峰形出现在前200bp的某部分，大部分情况下是不影响测序结果的。 解决策略：重新安排反应。 12. 测序一开始就出现双峰 仅供学习与参考学习资料 图19 产生原因：样品本身被污染，这常常发生在样品为质粒和菌液的情况中。 当使用通用引物测序时，如果刚好和样品中的几个质粒均能结合，那么就会出现这种情况，而且在同一位置上还可能有不止两个峰形。样品不是单

13、一模板，这常常发生在样品为PCR产物的情况中。通常PCR样品含非特异性扩增，存在两条分子量很接近，采用琼脂糖电泳无法分开的条带，在测序时容易发生这种情况。样品中存在两个引物结合位点，这常常发生在样品中存在重复序列的情况下。当引物恰好设计在重复序列中时，那么在重复序列以外的部分就会出现双峰的情况。 解决策略：划平板挑取单克隆测序；优化PCR体系或者克隆后测序；选用特异性引物。 13. PCR测序结果出现N值 图20 产生原因：该结果信号很强，峰型整齐，但是在该测序结果中有多个位置有重叠峰，出现N值。造成该情况的主要原因很可能是该PCR产物中有突变体的存在。在每个突变位点上有一个重叠的峰，由于仪器无法正确识别该处的碱基，就只能以N值代替。 解决策略：暂无较好地解决办法 14. 瀑布效应 仅供学习与参考学习资料 21 图 大分子荧光物质污染15. 仅