免疫学 酶免疫技术

1、酶免疫技术,Enzyme Immunoassay,酶免疫技术,是用酶作标记物标记抗原或抗体，将抗,原抗体反应的特异性和酶高效催化反应的专,一性结合在一起的一种免疫检测技术,本章主要内容,1,酶,标记物的制备,2,酶联免疫吸附试验,3,酶免疫印迹试验,4,生物素放大酶免疫技术,第一节,概述,一、技术原理,二、酶免疫技术的类型,一、技术,原理,酶免疫技术是用,酶,作标记物标记抗原或抗体,将抗原抗体反应的,特异性,和酶高效催化反应的,专一,性,结合在一起的一种免疫检测技术,抗原抗体反应完成后，加入,酶,相应的底物,通过酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位,定性或定量分析,特点,敏感性高,操作简单,

2、安全环保,对抗体（抗原）分子天然结构和一定影响,二、技术类型,一）酶免疫测定技术与酶免疫组化技术,1,酶免疫组织化学技术,酶标抗体,测组织抗原,2,酶免疫测定技术,酶标抗原或抗体,测体液标本中抗体或抗原,疫技术分为,酶免疫测定法,enzyme immunoassay,酶免疫组织化学技术,enzyme immunohistochemistry technique,EIHCT,酶免疫技术,均相,EIA,EIA,固相,EIA,异相,EIA,液相,EIA,抗原抗体反应完毕后,检测酶活性时是否需,要将游离的和结合的酶标记物进行分离,将酶,免疫测定技术分为,均相,EIA,和异相,EIA,第二节,酶标记物的

3、制备,一、酶及底物,一,酶的选择要求,1,酶活性高,2,稳定,标记后不影响酶活性及抗原、抗体的免疫反应性,3,操作易行,酶反应后产物的信号易于判定或测量，其方法简,单、敏感、重复性好,4,专一性好：酶活性不受样品中其它成分影响,5,酶及底物对人无危害，价廉,二,常用的酶,1,辣根过氧化物酶,horseradish peroxidase,HRP,优点,分子量小，标记方法简单,标记物稳定，价廉,2,碱性磷酸酶,alkaline phosphatase,AP,特点,分子量较大，不易透入细胞，敏感性较高,3 .,半乳糖苷酶,galactosidase,Gal,特点,不易受内源性酶的影响，常用于均相免疫

4、,测定,三,常用的底物,1. HRP,的底物,1,常用的过氧化物为,H,2,O,2,2,常用的,供氢,体为,二氨基联苯胺,DAB,产物不溶,邻苯二胺,OPD,产物可溶,波长,492nm,四甲联苯胺,TMB,产物可溶,波长,450nm,等,邻苯二胺,OPD,产物黄色，不稳定,四甲联苯胺,TMB,产物蓝色，加酸后变黄色,通常配制成,A,B,液,A,H,2,O,2,B,TMB,黑色瓶,2. AP,的常用底物,对硝基苯磷酸酯,PNP,产物黄色,敏感性较高，本底较低，但分子量较大,3.,Gal,的常用底物,为,4-MUG,常用于化学发光测定,二、酶标抗体的制备,酶标记物：将酶与抗体或抗原形成的结合物,如

5、何连接,方法选择要求,方法简单,不影响酶和抗原（抗体）的生物活性,所得标记物稳定，不易解离,常见的标记方法,1,戊二醛交联法,2,过碘酸钠标记法,过碘酸钠标记法,仅用于,HRP,的标记,过碘酸钠将与酶活性无关的多糖羟基氧化,为醛基，后者再与抗体蛋白的游离氨基结合,形成,HRP-CH,2,NH-IgG,1,戊二醛交联法,以戊二,醛,为桥将酶与抗体（抗原）结合,1,一步法,抗原,抗体,酶和戊二醛同时混合,2,二步法：均一，无自身聚合,先用过量的戊二醛与酶,反应,再加抗原（抗体,形成：戊二醛,酶,抗体,三、酶标记物的纯化及鉴定,纯化目的,除去游离的酶、抗体（抗原）、酶聚合物,和抗体（抗原）聚合物,避

6、免游离酶增加非特异性显色，游离抗体（抗原,竟争作用而降低特异性染色强度,常用纯化方法,Sephadex G-200/G-150,柱层析,硫酸铵盐析沉淀法,酶标记物的鉴定,标记率,酶结合率,酶活性和抗体活性,酶标记率的测定,酶标记率,结合物中酶量,标记酶量总量,100,或,A403/A280 (30,以上,免疫活性鉴定,常用免疫电泳、双扩散法或,ELISA,法进行,鉴定,第三节,酶联免疫吸附试验,ELISA,Enzyme Linked Immunosorbent Assay,一、基本原理,ELISA,基本原理,抗原或抗体预先结合到某种,固相载体,表,面，受检,样品和酶标抗原或抗体,按一定程序,与

7、结合在固相载体上的抗原或抗体起反应形,成抗原抗体,复合物,加入酶反应,底物,后，底,物被酶催化形成有色产物，通过定性或定量,分析,二要点,酶联,免疫吸附,Labeled,Ab,Ag in,Patients,sample,Ag,Immobilized,Solid,Phase,二、方法类型,一）双抗体夹心法,二）间接法,三）竞争法,四）捕获法,五）其他,ELISA,一）双抗体夹心法,常用于检测抗原,Ab,Ag,Ab1*-S,Ag-Ab,反应后形成固相,Ab-Ag-Ab1,加入底物后,在酶的作用下生成有色产物，其量与待检抗原的量成,正比,Sandwich ELISA,Substrate,Enzyme

8、,Anti-A,Product,A,Labeled,Ab,Ag in,Patients,sample,Ag,Immobilized,Solid,Phase,有一步法和两步法之分,二）间接法,常用于测定抗体,Ag,Ab,Ab1*-S,原理,将,Ag,联接到固相载体上，样品中待检,Ab,与之结合成,Ag-Ab,加,Ab1,形成,Ag,Ab,Ab1,加,底物显色,确定待检抗体含量,Indirect ELISA,Indirect ELISA,Anti-Antibody,Substrate,Enzyme,Anti-A,Product,A,三）竞争法,可用于测抗原或抗体,如测抗原,测定管中加有被检,Ag,

9、与,Ag,竞争结合固相,Ab,Ag,与,Ab,结合减少。加酶底物显色后，阴性对照管,显色深；测定管则由于被检抗原量的多少而显色深,浅不同,成反比,Ab+ Ag*,Ag,Ab,Ag,Ab-Ag,竞争法,四,捕获法,主要用于,IgM,抗体测定,先将针对,IgM,的第二抗体,Ab,结合于固相载体,加入样品，样品中所有,IgM,被捕获,洗涤后加入特异抗原与待检,IgM,结合,再加入抗原特异的酶标抗体,sAb,反应形成固相,酶标抗体复合物，加入底物显色后，即可对样品中待,检,IgM,的存在及其含量进行测定,Ab,IgM,Ag,sAb* -S,捕获法,三、技术要点,一）固相载体,二）免疫吸附（包被,三）最

10、佳工作浓度的选定,一）固相载体,1,固相载体要求,1,与抗原（抗体）结合量高,2,抗原（抗体）固化后仍保持活性,3,固化方法简便易行、快速经济,2,固相载体的种类,1,塑料制品,聚苯乙烯,制成的,微量反应板,2,微颗粒：系由高分子单体聚合成的微球或颗粒,其直径多为,m,级。磁性颗粒常见,3,膜载体：玻璃纤维素膜、尼龙膜、硝酸纤维素,膜,nitrocellulose,NC,等,二）免疫吸附,抗原或抗体固相化的过程称为包被,coating,条件：偏碱性缓冲液,4,过夜,方法：直接包被与间接包被,封闭,blocking,消除非特异性显色所致的本底偏高,常用,牛血清白蛋白或脱脂奶粉,等封闭,三）最佳工

11、作浓度的选定,why,how,比例性,最佳工作浓度的选定方法,1,包被抗原浓度滴定,方阵法,2,酶标抗体工作浓度的选择,3,包被抗体和酶标抗体的工作浓度,方阵法,四）酶标仪,是一个多通道分光光度计，能提供单一波长,对,ELISA,结果进行比色，测定,OD,值,第四节,酶免疫印迹试验,酶免疫印迹试验,enzyme immunoblotting test,是一种以膜为载体的酶免疫技术，以膜为载,体吸附抗原，加入抗体和酶标二抗，反应后,在膜表面形成免疫复合物，加底物显色进行,检测,类型,斑点酶免疫试验,dot immunoenzyme filtration assay,免疫印迹试验,immuno-b

12、lotting test,一）斑点,酶联免疫吸附试验,斑点,酶联免疫吸附试验原理与常规,ELISA,相似,不同之处在于它以,NC,膜为载体，酶作用底物后形成,有色的沉淀物，可使,NC,膜染色,Ag,Ab,Ab1,E,二）免疫印迹法,western blot,由,SDS-PAGE,分离蛋白,蛋白质转移,酶免疫测定,免疫反应与显色,三项技术结合而成,Serum Electrophoresis,Western blot,基本原理,蛋白质样品经,SDS-PAGE,Ag,按分子量大小不同而被分离,Ag,通过转移电泳原位转印至固相介质上,酶免疫测定,优点,高分辨力、高特异性及敏感性等,Western Bl

13、ot,二、技术要点,膜载体：常用,NC,膜,包被与封闭,免疫反应,结果观察,第五节,与生物素亲和素系统相关的酶免疫技术,生物素亲和素系统酶联免疫吸附试验,Biotin-Avidin System ELISA,一、生物素,亲和素系统,生物素,Biotin,亲和素,Avidin,生物素,维生素,H,动、植物组织中广泛分布,卵黄和肝含量高,现可人工合成,MW 244.31kD,结构：咪唑酮环噻吩环,图,活化生物素,O,C,HN,CH,4,经化学修饰,NH,带不同化学活性基团,活化生物素,标记蛋白质,CH,2,4,COOH,生物素化标记物,Ag,Ab,酶等,1,3,CH,2,CH,H,2,5,C,生物

14、素结构示意图,S,咪唑酮环；：噻吩环,生物素标记蛋白质,特性：高比活性、多价性、多级放大,种类：生物素化抗体、抗原、酶等,注意：基团匹配、比例合适、无空间位阻,不影响标记物活性,亲合素、链霉亲合素,avidin,AV,和,streptavidin ( SA,能特异性结合生物素,均为大分子蛋白,几乎可同所有标记物结合,理,化,特,性,亲合素,A,链霉亲合素,SA,结构,四亚基糖蛋白,四肽链蛋白,无糖基,PI,10.5 6,结合位,色氨酸,色氨酸,可结合,B,4,个,4,个,15,15,Ka,10,10,活性,13,15 15,18,本底,较高,较低,生物素,亲合素系统的特点,1,多级放大、灵敏度

15、高,2,亲和力高、特异性强,3,稳定性强、不可逆结合,4,适用性广、易偶联,5,简易、快速、稳定,Ag-Ab-Ab,B,E,A,S,二、生物素,亲和素酶免疫技术,BAB,法,BA,法,ABC,法,PAP-ABC,法,1. BAB-ELISA,测未知,Ag,BAB,双,Ab,夹心法,固相,Ab,Ag,Ab,B,A+B,E,B,E,固相,Ab,B,E,Ag,Ab,A-B,S,E,B,显色，测,OD,值,BAB,法实验原理,2.BA-ELISA,测,Ag,BA,双,Ab,夹心法,固相,Ab,Ag,Ab,B,A,E,固相,Ab,Ag,Ab,B,A,E,S,显色，测,OD,值,BA,法实验原理,BA-ELISA,测,Ab,BA,间接法,固相,Ag,Ab,Ab,2,B,A,E,B,A,E,固相,Ag,Ab,Ab,2,S,显色，测,OD,值,3. ABC-ELISA