《产淀粉酶菌的分离纯化》实验方案设计

1、产淀粉酶菌株的分离纯化一、实验目的1. 掌握产淀粉酶菌种的分离纯化的原理和方法技术；2. 巩固十倍稀释法。二、实验原理土壤是微生物生活的大本营， 是寻找有重要应用潜力的微生物主 要的菌源。 因此本实验选择从土壤中分离出产淀粉酶菌种， 再进行纯 培养。主要运用富集培养技术， 稀释涂布平板法和平板划线分离法及 无菌操作技术获得我们所需要的产淀粉酶菌种。淀粉酶作用于淀粉时， 打开了淀粉分子的糖苷键， 从而使淀粉失 去粘性，同时使其失去了与碘的显色反应能力，不再与碘结合，从而 形成透明圈。 产淀粉酶菌株在选择培养基上培养后， 会水解淀粉形成 水解圈，加碘液染色后，水解圈尤为明显。三、实验材料1. 菌种

2、： 从自然界筛选获得的淀粉酶产生菌种2. 土壤样品： 从栽种土豆的菜园中采集土壤样品3. 培养基：淀粉液体培养基（50mL）:蛋白胨0.5g, NaCI 0.25g,牛肉膏 0.25g,可溶性淀粉0.1g,蒸溜水50mL。淀粉琼脂培养基（200mL）:蛋白胨2g, NaCI 1g,牛肉膏1g, 可溶性淀粉0.4g,蒸溜水200mL，琼脂3-4g。牛肉膏蛋白胨培养基 （200mL）:蛋白胨2g，牛肉膏0.6g, NaCI1g,琼脂 3-4g，蒸馏水 200mL，pH7.0-7.2。4. 其他用品 ：酒精灯、移液枪（20-200uL）、接种环、试管架、三角涂布棒（各 一个），电子天平、 三角烧瓶（

3、 5 个）、试管（ 10 支）、培养皿（ 15 个）、 1mL移液管（10支）、10mL移液管（1支）、无菌水（200mL）、微波 炉、卢戈氏碘液。四、试验方法1 样品采集 用无菌报纸，在栽有土豆的菜园里，从不同的采样点采取土样约15g。（注意应采取距地表2-3cm以下的土样）2富集培养取土样10g,放入盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中， 振动20min，使土样与水充分混合，使微生物分散开。用一支 1mL 的移液管移取 1mL 土样液，加入到盛有 50mL 淀粉液体培养基的三 角瓶中进行富集培养，摇床110r/min, 37C，培养24h。3涂布平板分离 倒平板将淀粉琼脂培养基融化后倒

4、平板（12个），每平板约15ml。（注 意平皿中的培养基厚度要均匀） 土壤稀释液的制备取富集培养液1mL，放入盛9mL无菌水的试管中，充分振匀， 此为10-1稀释液, 以此类推制成 10-2 , 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7和10-8 几种稀释度的土壤溶液。 涂布将上述培养基的平板底部用记号笔分别写上10-5, 10-6, 10-7和10-8四种稀释度字样,每种培养基每种稀释度标记 3皿,然后用移液 枪分别由 10-5, 10-6, 10-7和 1 0-8四种土样稀释液中吸取 0.1ml 菌液放 入写好稀释度的平板中央位置, 用无菌涂布棒在培养基表面轻轻地涂 满整个

5、平面,室温下静置 5-10min。 培养 将平板倒置在37C温箱中培养48h。4. 检测 观察细菌的生长情况,打开平板盖子,加入少量卢戈氏碘液于 平板中,轻轻旋转平板,使碘液铺满整个平板,观察是否有水解圈的 产生。5产淀粉酶菌株的纯化 倒平板将牛肉膏蛋白胨培养基融化后倒平板 （12个）,每平板约 15mL （注意平皿中的培养基厚度要均匀） 平板划线选择在 10-5, 10-6, 10-7和10-8四个稀释度下,每组淀粉琼脂培养 基中产生透明圈最大的 1个菌落,用无菌水将碘液冲洗掉,挑取远离 透明圈的少许菌苔,在 3个牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线接种。 培养将平板倒置在37C温箱中培养48h。6鉴定保存 观察细菌的生长情况,打开平板盖子,加入少量卢戈氏碘液于 平板种,轻轻旋转平板,使碘液铺满整个平板。观察能产生透明圈的 菌落特征,进行初步鉴定,并接种到牛肉膏斜面上保存。五、技术路线样品采集富集培养（110r/min, 37C, 24h）倒平板（淀粉琼脂培养基12个）土壤稀释液制备U涂布培养（37C, 48h）加碘液（观察是否有淀粉水解圈产生）U倒平板（牛肉膏蛋白胨培养基12个）平板划线（选取在淀粉琼脂培养基中产生透