人教版高中生物课件选修一血红蛋白的提取和分离

1、教学目标,1,理解色谱法、电泳法等分离大分子的基本原理,2,了解缓冲液的组成及其作用,3,血红蛋白的分离样品处理,教学重点,4,凝胶色谱法的原理,教学难点,5,电泳法分离大分子的原理,分离生物大分子的基本思路,选用一定的物理或化学的方法分离具有不,同物理或化学性质的生物大分子,凝胶色谱法（分配色谱法,凝胶,是由多糖类化合物分子（如葡聚糖或琼脂糖）在,一定的条件下互相交联在一起构成的多孔小球体,凝胶粒），内部有许多贯穿的通道,凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示,凝胶色谱法（分配色谱法,凝胶色谱法的原理,当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量,较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长,

2、移动速度较慢,而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通,道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较,快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离,依据的特性是：蛋白质分子量的大小,凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示,凝胶色谱法分离蛋白质的原理,洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲,液，促使蛋白质分子的差速流动,凝,胶,色,谱,柱,凝胶电泳法,电泳,带电粒子在电场作用下发生迁移的过程,类型,琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳,1,用鸡的红细胞提取,DNA,用哺乳动物的红细,胞提取血红蛋白的原因是什么,鸡的红细胞具有细胞核，含有,DNA,便于进行,DNA,的提,取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血

3、红蛋白含量丰富,便于提取血红蛋白,血,液,2,血液有哪些成分,水,分,血浆,其他物质,血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等,血细,胞,白细胞,两个肽链,血小板,血红蛋白,两个一肽链,红细胞,最多,90,四个亚铁红素基团,二、实验操作,一）蛋白质提取和分离步骤,样品处理粗分离纯化纯度鉴定,二）操作过程,本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎,1,样品处理,动物的血液来分离血红蛋白,1,红细胞的洗涤,去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的,洗涤目的,分离纯化,洗涤操作,1,采集血样。注意要加入柠檬酸钠防止血,液凝固,2,低速短时间离心（速度越高和时间越长,会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效,果,3,吸

4、取血浆：上层透明的黄色血浆,4,盐水,洗涤：用五倍体积的质量分数为,0.9,的氯化钠溶液,洗涤,5,低速离心（低速短时间,6,重复三次,直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净,二、实验操作,2,血红蛋白的释放,加蒸馏水到原血液体积，再加,40,体积,的甲苯,置于磁力搅拌器上充分搅拌,10,分钟（加速,细胞破裂,细胞破裂释放出血红蛋白,3,分离血红蛋白溶液,过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以,2000r/min,的速度离心,10 min,试管中溶液层次：第,1,层（最上层）：甲苯层（无色,透明）；第,2,层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白,色薄层固体）；第,3,层（中下层）：血红蛋白的水溶,液

5、层（红色透明液体）；第,4,层（最下层）：杂质沉,淀层（暗红色,分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏,斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体,实验操作,2,血红蛋白的粗分离,透析,过程：取,1ml,的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透,析袋放入盛有,300ml,的物质的量浓度为,20mmol/l,的,磷酸缓冲液中,pH,为,7.0,，透析,12,小时,透析目的：除去样品中分子量较小的杂质,原理：透析袋能使小分子自由进出，而大,分子保留在袋内,透析过程动画演示,3,分离纯化血红蛋白,凝胶色谱操作,1,凝胶色谱柱的制作,2,凝胶色谱柱的装填,凝胶的选择,A,材料：交联葡聚糖凝胶,G,75,B,

6、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度,膨胀程度及分离范围,75,表示凝胶的得水值，即每克,凝胶膨胀时吸水,7.5,克,凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取,一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后,配成凝胶悬浮液,凝胶色谱柱的装填方法,A,固定：将色谱柱装,置固定在支架上,B,装填：将凝胶悬浮液一次性的,装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填,装均匀。注意,1,凝胶装填时尽量紧密，以降低凝,胶颗粒之间的空隙,2,装填凝胶柱时不得有气泡存,在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降,低分离效果,2,凝胶色谱柱的装填,洗涤平衡：装填完毕后,立即用缓冲液洗脱瓶，在,50cm,高的操

7、作压下，用,300ml,的,20mmol/l,的磷酸缓,冲液,pH,为,7.0,充分洗涤平,衡,12,小时。注意,1,液面不,要低于凝胶表面，否则可能有,气泡混入，影响液体在柱内的,流动与最终生物大分子物质的,分离效果,2,不能发生洗脱,液流干，露出凝胶颗粒的现象,50cm,高,装配好的凝胶柱,3,样品加入与洗脱,调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液,缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口,滴加透析样品：吸管吸,1ml,样品加到色谱柱的,顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加,样，同时注意不要破坏凝胶面,样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样,品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭,