第二章 天然药物化学成分的提取,分离和鉴定方法

1、Natural Products Chemistry,第二章,天然药物化学成分的提取、分离和鉴定,基本内容 中药有效成分的提取分离方法 1H-NMR、 13C-NMR在结构研究中的的作用及解析方法;质谱的类型及其应用,本 章 内 容,第一节 提取方法 第二节 分离方法 第三节 结构研究方法,第一节 提取方法,1.溶剂提取法 2.水蒸气蒸馏法 3.升华法 4.超临界流体萃取法 5.超声波提取法 6. 微波提取法,第一节 提取方法,1.溶剂提取法（extraction with solvent） 原理：相似相溶 理想溶剂（ideal solvents ）有如下特点 （1）对有效成分溶解度大； （2

2、）对无效成分溶解度小； （3）与有效成分不起化学反应； （4）安全，成本低，易得。 溶剂的极性由弱至强的顺序：石油醚氯仿乙酸乙酯正丁醇丙酮甲醇水,第一节 提取方法,一、提取法： 1.溶剂提取法（extraction with solvent） 影响提取的因素： 药材的粉碎度：一般以20-60目为度。 温度：对热不稳定的温度不宜过高。 浓度差：搅拌、换溶剂、渗漉。 提取时间：水加热提取1-2小时，乙醇加热1小时为宜,Simple percolate assembly,1)冷提取法：适用于受热不稳定的成分。 浸渍 (Maceration) 渗漉（Percolation,第一节 提取方法,工业生产用

3、的渗漉装置,第一节 提取方法,2)热提取法：煎煮法（Decoction） 回流（Refluxing） 连续回流（Continuous Refluxing,Simple refluxing assembly,Assembly of Soxhlet extractor,第一节 提取方法,2.水蒸气蒸馏法（water-steam distillation ） 提取具有挥发性，能随水蒸气 蒸馏而不被破坏的成分，如挥发油,Simple water-steam distillation refluxing assembly,第一节 提取方法,3.升华法（ sublimation ） 用于具有升华性的成分提

4、取，如香豆素，蒽醌，樟脑等,第一节 提取方法,超临界流体的密度与液体很接近，而它又具有气体扩散性能 常用的临界流体有CO2、N2O、 乙烷、丙烷等,4.超临界流体提取法（supercritical fluid extraction SFE) 利用溶剂在超临界条件下特殊的流体性能对样品进行提取，为20世纪80年代迅速发展起来的一种提取方法,第一节 提取方法,控温面板,高压泵,超临界CO2萃取实验装置示意图,原 料,超临界萃取实验装置与实验方法,小试实验装置图,实验装置小型实验装置,上世纪50年代初进入试验阶段，如从石油中脱沥青 70、80年代，SFE越来越多的用于食品、香料的提取 90年代，开始

5、从植物药中提取目标成分，如从蛇床子、茵陈蒿、桑白皮中提取活性成分,中小型SFE装置图,为物理过程，无化学反应，生物活性不减。大能量的超声波产生的极大压力造成植物细胞壁及整个生物体破裂，胞内物质的释放、扩散及溶解,5.超声提取法（ultrasonic extraction,实验室用小型超声仪,第一节 提取方法,工业生产用超声仪,6.微波提取法（microwave extraction,具有穿透力强、选择性高、加热效率高等显著特点，而且其操作简便、快速、节能、高效。 缺点：工业化设备少、成分变化、生物活性变化,工业生产用微波提取罐,第一节 提取方法,本 章 内 容,第一节 提取方法 第二节 分离方

6、法 第三节 结构研究方法,第二节 分离方法,根据溶解度差别进行分离 2. 根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离 3. 根据物质的吸附性差别进行分离吸附色谱法 4. 根据物质离解程度不同进行分离离子交换法 5. 根据物质分子大小差别进行分离凝胶滤过法,第二节 分离方法,1. 根据溶解度差别进行分离 1.1 结晶法（纯化时常用） 条件：浓度；合适的溶剂；温度 1.2 沉淀法 a 分级沉淀法：改变极性，如水提醇沉法 b 酸碱沉淀法：改变pH，处理酸、碱、两性成分； c 专属试剂沉淀法：如铅盐沉淀法，酸性、酚性成分加中性PbAc2，形成沉淀。 d 盐析法：水溶液中加入无机盐,第二节 分离方法,1.

7、1 结晶法 关键：选择合适的溶剂 对被溶解成分的溶解度随温度不同应有显著差别 与被结晶成分不应产生化学反应 沸点适中,第二节 分离方法,a 分级沉淀法：改变极性 水提醇沉法：含有糖类或蛋白质的水溶液中，分次加入乙醇，使含醇量逐步增高，逐级沉淀出分子量段由大到小的蛋白质、多糖、多肽等。 在含皂苷的乙醇溶液中分次加入乙醚或乙醚-丙酮混合液可使极性有差异的皂苷逐段沉淀出来,第二节 分离方法,b 酸碱沉淀法：改变pH，处理酸、碱、两性成分； 碱性成分：生物碱类与无机酸成盐溶于水，调节pH碱化后生物碱游离出来，在水溶液中沉淀析出。 酸性成分：对于具有羧基或酚羟基的酸性成分，与碱成盐而溶于水，酸化后游离出

8、来，在水溶液中沉淀析出。 注意：酸碱处理结构的变化,第二节 分离方法,c 专属试剂沉淀法： 雷氏铵盐用于分离生物碱与非生物碱类成分，以及水溶性生物碱与其他生物碱的分离； 胆甾醇能和甾体皂苷沉淀，可使其与三萜皂苷分离。明胶能沉淀鞣质，可用于分离或除去鞣质。 d 盐析法：水溶液中加入无机盐,2.1 影响分离的因素 分离因子，分配系数K = kA/ kB kAkB, k=CU/CL （CU, CL被分离物质在上相和下相中浓度） 根据值的大小可决定分离采用的方法: 100，简单的一次萃取，可基本分离. 10010，10-12次萃取，CCD法。 2，100次以上萃取，DCCC法，HSCCC法。 =1，不

9、能分离,第二节 分离方法,2. 根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,或用PC法求值，选择理想分离条件。 纸色谱（PC）也叫纸分配色谱（PPC， Paper Partition Chromatography,纸色谱定数,Rfa，Rfb为A，B两物质在PC上Rf值,第二节 分离方法,2.1 影响分离的因素 pH值 对于酸性、碱性、两性化合物，pH值可改变它们的存在状态（游离型和解离型），分配比受pH值的影响，因为,HA达到99%解离时，pH= pKa + 2 HA达到99%游离时，pH= pKa - 2,第二节 分离方法,第二节 提取分离方法,2.2 酸碱性成分的分离pH-梯度萃取法、酸碱溶

10、剂法 按酸碱性强弱不同分离酸性、碱性、中性物质，改变pH值使酸碱成分呈不同状态,pH-梯度萃取法,酸碱溶剂法,简单萃取 分离极性较大的成分：正丁醇-水 分离极性中等成分：乙酸乙酯-水 分离极性小的成分：氯仿(或乙醚)-水 石油醚脱脂,第二节 提取分离方法,2.3 溶剂分配法,第二节 提取分离方法,2.3 溶剂分配法,系统溶剂萃取法,第二节 分离方法,2.2 酸碱性成分的分离pH-梯度萃取法、酸碱溶剂法 按酸碱性强弱不同分离酸性、碱性、中性物质，改变pH值使酸碱成分呈不同状态,2.3 逆流分溶法、液滴逆流色谱、高速逆流色谱 逆流分溶法(CCD)： 多次连续液-液萃取分离过程。 特点：条件温和，样

11、品易回收，适用于中等极性、不稳定物质的分离,液滴逆流色谱(DCCC): 一种液-液分配色谱，流动相呈液滴形式垂直上升或下降，通过固定相的液柱，实现物质的逆流色谱分离。 特点：不易乳化，样品可定量回收，分离效果好，特别适合于分离皂苷等水溶性成分。 缺点：样品处理量小,第二节 分离方法,高速逆流色谱（HSCCC） 通过特定的高速行星式旋转所产生的离心力场 作用，使无载体支持的固定相稳定地保留在蛇形管 内，并使流动相单向、低速通过固定相，实现连续 逆流萃取分离物质的目的。 用于各种物质的分离，包括蛋白、酶、三萜、生 物碱、皂苷等,第二节 分离方法,2.4 液-液分配柱色谱 正相色谱： 固定相极性大，

12、如氰基与氨基键和相、水、缓冲液等； 流动相极性小，如氯仿、乙酸乙酯等。 载体：硅胶（含水可达17%），硅藻土，纤维素等。 分离极性大或中等极性的成分。 洗脱顺序：极性小的物质先被洗脱出来,第二节 分离方法,2.4 液-液分配柱色谱 反相色谱：固定相极性小于流动相。如HPLC反相柱，反相板。 固定相：硅胶硅醇基结合烷基，如RP-2，RP-8， RP-18。亲脂性：RP-18 RP-8 RP-2。 流动相(洗脱剂)：MeOH-H2O，CH3CN-H2O 洗脱顺序：分离非极性及中等极性的成分，极性大者先洗脱下来,第二节 分离方法,3.1 吸附分类： 物理吸附：无选择性的吸附，吸附解析发生迅速。吸附剂

13、如硅胶、氧化铝、活性炭等； 化学吸附：不可逆性。如碱性氧化铝对酚酸性成分的吸附，硅胶对生物碱的吸附等。 半化学吸附：聚酰胺对酚酸类、醌类的氢键吸附,第二节 分离方法,3. 根据物质的吸附性差别进行分离吸附色谱法,吸附原理：相似相吸 影响吸附过程的三要素： 吸附剂（固定相）， 溶质（被分离物质）， 溶剂（洗脱剂，展开剂，流动相,第二节 分离方法,3.2 硅胶、氧化铝： 极性吸附剂：载样量大，吸 附力强 硅胶：应用最广，适用于各 类成分分离 氧化铝：有中性、酸性、碱 性氧化铝。碱性氧化铝不适合 于分离酸性成分，多用于分离 生物碱,第二节 分离方法,3.2 硅胶、氧化铝： 被分离物质吸附力与结构的关

14、系 被分离物质极性大，吸附力强，Rf值小，洗脱难， 后被洗脱下来。 官能团极性大小排列顺序： -COOH Ar-OH R-OH R-NH2, RNHR , RNR R R-CO-NRR RCHO RCOR RCOOR ROR RH,第二节 分离方法,3.2 硅胶、氧化铝： 溶剂(洗脱剂)的极性与洗脱力的关系 洗脱剂极性越大, 洗脱力越强. 石油醚-丙酮 石油醚-乙酸乙酯 氯仿-甲醇,第二节 分离方法,练习: 从黄花夹竹桃果仁中分离到七种强心苷成分, 比较极性大小和硅胶柱上洗脱顺序,单乙酰黄夹次苷B R”=COCH3, 其它R”=H,第二节 分离方法,第二节 分离方法,答案,1. 极性大 小：黄

15、夹苷A黄夹苷B 次苷D次苷C次苷A次苷B 单乙酰黄夹次苷B 2. 硅胶柱上的出柱顺序：后 先,3.2 活性炭非极性吸附剂 吸附力与结构的关系 分子量大者 分子量小者 芳香族 脂肪族 含OH, COOH, NH2多者 少者 洗脱力与溶剂的关系 吡啶 15%酚/醇 7%酚/H2O 醇 含水醇H2O 应用: 黄酮、生物碱的富集，糖的分离、脱色等,第二节 分离方法,3.4 聚酰胺(Polyamide) 是由己酰胺聚合成的一类高分子化合物,第二节 分离方法,分离原理：主要通过酰胺键与酚羟基、酸、醌等形成氢键，产生吸附作用。吸附力取决于形成氢键缔合的能力,3.4 聚酰胺 吸附力与结构的关系 a.形成氢键的

16、基团数目越多, 吸附力越强; b.形成分子内氢键者, 吸附力减少,第二节 分离方法,d.芳香苷苷元苷, 单糖苷双糖苷叁糖苷,c.芳香化程度越高或共轭键越多,吸附力越强,第二节 分离方法,3.4 聚酰胺 吸附力与结构的关系,溶剂的洗脱能力 水 含水醇醇 丙酮NaOH/H2O甲酰胺二甲基甲酰胺尿素/H2O,3.4 聚酰胺 常用溶剂： H2O ，EtOH/ H2O，EtOH 应用: 分离黄酮类;除鞣质,第二节 分离方法,练习: 某植物中分得3个黄酮化合物，结构如下, 比较它们的极性大小及在硅胶TLC和聚酰胺薄膜上Rf值大小顺序,A: R1 =R2= H B: R1 = H, R2= Rham C:

17、R1 = Glc, R2= Rham,极性大小: SiO2-TLC Rf: Polyamide TLC, Rf,第二节 分离方法,极性大小: C B A SiO2-TLC Rf: A B C Polyamide TLC, Rf: C B A,第二节 分离方法,答案,3.5 大孔吸附树脂(macro-reticular resin) 组成: 苯乙烯，二乙烯苯和致孔剂 分离原理:吸附(范德华力和氢键)和分子筛作用(多孔性结构) 树脂类型:非极性、中极性和极性三种。 非极性：由苯乙烯和二乙烯苯缩合而成，故又称 芳香吸附树脂。 中极性：含脂基的吸附树脂。 极 性：含酰氨基、氰基、酚羟基等含氮、氧、硫不

18、同极性功能的吸附树脂,第二节 分离方法,3.5 大孔吸附树脂 洗脱剂: H2O 及不同比例的含水醇。 洗脱分离: H2O 洗: 糖,水溶性色素 30% EtOH/ H2O: 极性大的成分 50-75% EtOH: 皂苷类 95% EtOH: 极性小成分 应用: 除多糖, 水溶性色素, 富集苷类成分,第二节 分离方法,4.根据物质离解程度不同进行分离离子交换法 固定相：离子交换树脂（聚苯乙烯高分子化合物，引 入交换基团） 分类： 阳离子交换树脂：强酸型 RSO3-H+ 弱酸型 RCOO-H+ 阴离子交换树脂：强碱型 RN+(CH3)3Cl- 弱碱型 RNH2, RNHR, RNRR,第二节 分离

19、方法,4.1交换原理: 阳离子交换树脂,阴离子交换树脂,4.2应用： 主要用于生物碱和有机酸的分离,第二节 分离方法,4.根据物质离解程度不同进行分离离子交换法,透析法: 半透膜, 分子筛滤过作用 超滤法: 分子大小不同, 扩散速度不同 超速离心法: 溶质在超速离心作用下具有不同的 沉降性或浮游性 凝胶滤过法: 分子筛的作用(凝胶渗透色谱,分子 筛滤过, 排阻色谱), 被分离物质按分子 由大到小的顺序流出色谱柱,5.根据物质分子大小差别进行分离凝胶滤过法,第二节 分离方法,5.1 主要的几种方法,5.2凝胶种类: 葡聚糖凝胶(Sephadex G): 只适于在水中应用, 分离多糖、 蛋白质等.

20、 羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)： 适用于各类化合物的分离，除具有分子筛的特性外，还起到反相分配色谱的效果。 常用溶剂有甲醇、氯仿-甲醇等,第二节 分离方法,5.根据物质分子大小差别进行分离凝胶滤过法,本 章 内 容,第一节 提取方法 第二节 分离方法 第三节 结构研究方法,一 化合物纯度的鉴定（Identification of Purity） 1. 测熔点: 看熔程 2. 外观结晶色泽与形状: 均一性 3. 色谱法: TLC 三种组成不同的溶剂系统, 单一斑点; HPLC 单一峰 GC 单一峰 4. 核磁法：不主张,第三节 结构研究方法,二、已知化合物鉴定（Known c

21、ompounds) 1. 有标准品(或对照品): Co-TLC (共薄层，三种系统) 测混合熔点(相同溶剂结晶); 测IR (考察是否重叠） 2. 无标准品: 与文献值对照(相同的溶剂条件下：m.p., IR, UV, 1H-NMR, 13C-NMR等,第三节 结构研究方法,三、未知化合物 程序 1.结构类型的确定 2. 分子式及不饱和度 的确定 3. 官能团和分子骨架的确定 4. 平面结构的确定 5. 立体结构的确定,第三节 结构研究方法,三、未知化合物 多种谱学结合的结构解析 1.紫外光谱(Ultraviolet spectra UV) 为结构解析提供的信息 用于判断结构中的共轭系统、结构

22、骨架（如香 豆素、黄酮） UV谱一致，不一定是一个化合物。 应用：确定平面的结构骨架，立体结构的构型、 构象,第三节 结构研究方法,三、未知化合物 多种谱学结合的结构解析 1.紫外光谱(Ultraviolet spectra UV,第三节 结构研究方法,2. 红外光谱(Infrared spectra IR) 为结构解析提供的信息 提供各种官能团的信息 八大区（复习） 如：芳香环: 1600-1480cm-1， OH: 3000 cm-1, C=O : 1700 cm-1. IR相同者为同一化合物,第三节 结构研究方法,3425,缔合羟基,1769,酯羰基,IR,3.质谱(Mass spect

23、ra MS) 为结构解析提供的信息 给出分子量(M+), 给出基团或片段信息, HR-MS可计算分子式; MS图一致(同一型号仪器,同一条件)一般为同一化合物。 类型 EI-MS: 醇、糖苷不能给出分子离子峰; FD-MS、FAB-MS、ESI-MS ：用于糖苷,肽,核酸类,可确定分子量。 HR-MS：给处精确的分子量和分子式,第三节 结构研究方法,ESI-MS,HR-ESI-MS,C33H40O18 =12,M+Na,为结构解析提供的信息 化学位移: (用于判断H的化学环境 chemical shift); 偶合常数: J (Hz) 用于判断H与H的关系 coupling constant)

24、 积分强度(积分面积): 确定H的数目,4. 核磁共振谱（Nuclear magnetic resonance NMR） 4.1 质子谱（1H-NMR,第三节 结构研究方法,J8.0Hz 存在偶合,第三节 结构研究方法,4. 核磁共振谱（Nuclear magnetic resonance NMR） 4.1 质子谱（1H-NMR,常见基团的化学位移值: Ar-H ：6-8, -CHO ：9.8 -CH3 ：1-1.5, C=C-CH3, COCH3, ArCH3 ：1.9-2.5 -OCH3 ：3.5-4.0, -COOCH3与ArOCH3 ：3.7-4.0,第三节 结构研究方法,影响化学位移

25、因素 化学位移值与电子云密度有关。电子云密度降低, 去屏蔽作用增强,向低场位移, 增大。 1）诱导效应 2）共轭效应 3）磁各向异性效应 4）氢键缔合 5）范德华效应,4. 核磁共振谱（Nuclear magnetic resonance NMR） 4.1 质子谱（1H-NMR,偶合常数(J) a.偶合裂分是有原子核引起的,通过化学键传递; b.相互偶合的H核其J值相同; c.一级图谱峰的裂分遵循n+1规律; d.归属H核,判断排列情况. 偶合分类 偕偶(Jgem)又为同碳偶合 sp3 J=10-15Hz; sp2 C=CH2 J=0-2Hz, N=CH2 J=7.6-17Hz,第三节 结构研

26、究方法,4. 核磁共振谱（Nuclear magnetic resonance NMR） 4.1 氢谱（1H-NMR,邻偶(Jvic) 饱和型: 自由旋转J=7Hz 构象固定: 0-18Hz,与两面角有关,J90=0Hz, J180 Jo (7.5Hz); 烯型：Jcis =6-14Hz(10), Jtrans=11-18Hz(15) 芳环: Jo=6-9Hz,. 远程偶合: 如烯丙偶合 J4=0-3Hz，苯环的间位Jm=1-3Hz和对位偶合Jp=0-1Hz,第三节 结构研究方法,偶合分类,第三节 结构研究方法,4. 核磁共振谱（Nuclear magnetic resonance NMR）

27、4.2 碳谱（13C-NMR,为结构解析提供的信息,化学位移：碳处的化学环境 峰高或峰面积:一般不与碳数成正比,第三节 结构研究方法,4. 核磁共振谱（Nuclear magnetic resonance NMR） 4.2 碳谱（13C-NMR,常见一些基团的化学位移值: 脂肪C: 50 连杂原子C: C-O,C-N,C-S :50-100 C-OCH3 : 55; 糖端基C : 95-105 芳香碳,烯碳: 98-160 连氧芳碳 :140-165 C=O: 168-220,C=O: 168-220 醛CHO： 190205 酮： 195220 羧酸： 170185 酯及内酯： 165180

28、 酰胺及内酰胺: 165180,第三节 结构研究方法,a 全氢去偶谱(COM)或噪音去偶谱(PND)或质子宽带去偶谱(BBD) 特点: 图谱简化, 所有信号均呈单峰. b 偏共振去偶谱(OFR) 特点: 由于部分保留1H的偶合影响,可识别伯、仲、叔、季碳。 CH3, q， CH2, t， CH, d， C, s,第三节 结构研究方法,4. 核磁共振谱（Nuclear magnetic resonance NMR） 4.2 碳谱（13C-NMR,常见的13C-NMR谱的类型及二维谱,BBD,练习,一化合物，分子式为C6H14，高度对称，在噪音去偶谱（COM）上只有两个信号，在偏共振去偶谱（OFR

29、）上只有一个四重峰（q）及一个二重峰(d)，试写出其结构,第三节 结构研究方法,常见的13C-NMR谱的类型及二维谱 c. DEPT谱 特点：不同类型13C信号呈单峰分别朝上或向下,可识别CH3，CH2，CH，C. 脉冲系列 =135CH3, CH , CH2 （常用） =90CH , =45CH3, CH2 , CH , 季碳不出现,第三节 结构研究方法,4. 核磁共振谱（Nuclear magnetic resonance NMR） 4.2 碳谱（13C-NMR,DEPT谱,135 =135CH3, CH , CH2,90 CH,常见的13C-NMR谱的类型及二维谱 1H-1H COSY(

30、相互偶合的氢核给出交叉峰) NOESY(空间相近的氢核的关系) HMQC(13C-1H COSY) 13C,1H 直接相关谱1JCH HMBC(远程13C-1H COSY) 13C,1H 远程相关谱 2JCH, 3JCH,第三节 结构研究方法,HMBC,化合物 C-17 白色油状物（CHCl3-MeOH），氯仿，丙酮中溶解度好。 TLC: 石油醚:丙酮(3:1) , Rf值约为0.2；氯仿:甲醇(7:1), Rf值约为0.4；有强暗斑， 10硫酸-乙醇显棕色。 FeCl3-K3Fe(CN)6反应(,1550cm-1,1380cm-1,C-17,7.05 (2H, d, J = 8.1 Hz,6

31、.78(2H, d, J = 8.1 Hz,4.56 (2H, t, J = 7.5 Hz,3.21 (2H, t, J = 7.5 Hz,C-17,76.7,32.6,154.9,129.9,115.8,127.7,练习: 一天然产物A为淡黄色针状结晶,紫外灯下(254nm)呈暗斑, FeCl3显兰色. 1H-NMR (CDCl3, TMS): 9.83(1H,s), 7.43(1H, dd, J =8.5, 1.5Hz), 7.26(1H, d, J =1.5Hz), 7.04(1H, d, J = 8.5Hz), 3.97(3H, s, OCH3) 13C-NMR (CDCl3): 19

32、0.9, 151.6, 147.1, 129.9, 127.6, 114.3, 108.7, 56.1. HREIMS示分子式为C8H8O3. 推测结构,第三节 结构研究方法,第三节 结构研究方法,答案,5. 旋光谱和圆二色散光谱（ORD and CD） (Optical Rotatory Dispersion and Circular Dichroism,旋光谱(ORD)和圆二色谱(CD,需对紫外可见光有吸收)在解决手性中心附近有生色团(含通过化学转换可变成生色团的化合物，如-OH、C=O)的化合物的绝对构型或优势构象的。 当平面偏振光通过手性中心时，左旋圆偏光和右旋圆偏光的折射率、传播速度，当再合成平面偏振光时，偏振面就发生了旋转，这就是产生旋光的光学原理。随着波长变短，折射率差值增大，比旋度增大,第三节 结构研究方法,在不同波长下测定物质的比旋度，以比旋度为纵坐标，波长为横坐标做图，该图称为ORD谱。 ORD谱的分类 (1). 平坦谱线 无峰无谷，有旋光性，但手性中 心附近无生色团,正平坦曲线: 随波长