MICM检测在恶性血液病中运用

1、MICM检测在恶性血液病中的运用,背景介绍,血液病是原发于造血系统的疾病，或影响造血系统伴发血液异常改变，以贫血、出血、发热为特征的疾病,出血性疾病,贫血症,白细胞疾病,常见血液病,造血系统恶性肿瘤,恶性血液病类型,MICM FAB形态学诊断(Morphology)：包括血液和骨髓形态学及组织化学染色。 免疫学检查(Immunology ) 遗传学检查(Cytogenetics) 分子生物学检查(Molecular,检测方法,一、形态学,是诊断的基础，任何淋巴造血系统增生性疾病的诊断都离不开形态学诊断。形态学诊断技术包括 细胞学：外周血、骨髓涂片 组织学：骨髓活检、血凝块,外周血涂片检测（血液

2、病血常规）：用来观察外周血细胞形态、数量。是对血液分析仪检测的血常规的镜下检测补充。 检测内容包括：白细胞如粒细胞、单核细胞、淋巴细胞；红细胞；血小板,骨髓涂片检测： 1、骨髓增生程度，G:E，骨髓小粒及脂肪油滴有无及分度。 2、粒细胞系统、红细胞系统、淋巴细胞系统、单核细胞系统、巨核细胞系统、浆细胞系统以及其他细胞（网状细胞、内皮细胞、纤维细胞、成骨细胞、破骨细胞、组织嗜碱细胞、退化细胞等）的形态及比例。血小板的情况。 3、骨髓小粒 4、有无转移瘤和寄生虫,骨髓病理检测：在高倍镜下观察骨髓的组织结构和各成分的分布及相互关系,骨髓活检和骨髓/血涂片,骨髓/血涂片,骨髓涂片细胞细微结构清楚评估红

3、系、粒系增生情况及幼稚细胞比例具有优势 骨髓纤维化、细胞致密可干抽 可做组织化学染色（如铁染） 对缺铁性贫血、慢性疾病引起的贫血、巨幼细胞性贫血、和急性白血病的诊断尤其有帮助,骨髓活检,骨髓活检显示骨髓的组织结构和各成分的分布及相互关系，对巨核细胞的评估具有优势 不存在干抽和骨髓稀释 可做免疫组织化学染色 对再生障碍性贫血、低增生性白血病、淋巴瘤、转移癌、骨髓增生性肿瘤的诊断具有重要价值,骨髓涂片看细胞、骨髓活检看结构，相互补充相互验证不能相互替代,血凝块：废物利用、骨髓活检的补充,骨髓活检常见问题,标本取材条件：要求穿刺1 cm以上骨髓组织 诊断不明确：取材部位是否有病灶 保存液：10%福尔

4、马林固定,二、细胞组织化学染色,以形态学为基础，运用化学或生物化学技术研究细胞内化学成分的分布及变化的检测方法。对某些血液病的诊断、鉴别诊断、疗效、判断预后有一定的意义,常用的细胞化学染色有： 1、过氧化酶又称髓过氧化酶(Myeloperoxidase，MPO或POX) ：阳性为棕黑色。用于急性白血病的鉴别：急性粒细胞白血病为阳性，其中M3为强阳性，急性单核细胞白血病为弱阳性，急性淋巴细胞白血病为阴性,2、非特异性酯酶（NSE）：包括中性非特异性酯酶（-NAE，棕黑色）、酸性非特异性酯酶（A-NAE，棕红色），碱性非特异性酯酶（ -NBE，棕红色） 。 意义：急性单核细胞白血病强阳性，且能被氟

5、化钠抑制。急性粒细胞白血病弱阳性或阴性，不被氟化钠抑制,3、特异性酯酶（SE）：阳性红宝石色颗粒。 意义：急性粒细胞白血病阳性或强阳性。急性单核细胞白血病阴性。慢粒急粒变阳性增强,4、苏丹黑B染色（SBB）：阳性为黑色。 意义：和POX基本一样,5、中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）：阳性为灰黑色或黑色。计算阳性率和积分值： 阳性率：计数100个中性杆状核和分叶核粒细胞，观察其阳性细胞的个数，即为阳性率。(正常值40%) 阳性指数：（+）1 +（+）2 +（+）3 +（+）4 的总和。（正常值40-80分） 意义：升高见于严重感染，类白，急淋，骨纤，真 红，再障，ITP,淋巴瘤等。 降低见于慢粒，

6、急性粒细胞白血病，PNH。 故可用于慢粒和类白、骨纤；再障和PNH；急粒和急淋的鉴别,6、糖原染色（PAS）： 阳性为红色。可以计算阳性率和阳性指数。 意义：（1）正常情况下，红细胞系统的原、 幼红细胞和成熟红细胞；粒细胞系统的原粒细胞、 原单核细胞和大多数淋巴细胞为阴性反应。自早幼粒 阶段以后的粒细胞和幼单核细胞可呈弱阳性反应。 （2）急淋、红白血病、戈谢病的原始细胞呈强阳性反应或阳性反应；缺铁性贫血、珠蛋白生成障碍、MDS亦可呈阳性反应；急性粒细胞白血病、急性单核细胞白血病、良性淋巴细胞增多症、尼曼-皮克细胞呈阴性反应或弱阳性反应。巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、再生障碍性贫血等幼红细胞为阴性

7、反应。偶有个别幼红细胞呈阳性反应。 （3）帮助鉴别不典型巨核细胞和霍奇金细胞，巨核细胞呈强阳性反应；霍奇金细胞呈弱阳性或阴性反应。 （4）帮助鉴别白血病细胞和腺癌骨髓转移的腺癌细胞，腺癌细胞呈阳性反应,7、酸性磷酸酶染色（ACP）：阳性酶活性部位出现红色沉淀，胞核为蓝色。 意义：1、鉴别戈谢细胞和尼曼-匹克细胞，前者阳性，后者为阴性。 2、多毛细胞白血病为阳性反应，且耐L-酒石酸的抑制作用。淋巴肉瘤细胞和慢性淋巴细胞白血病的淋巴细胞，酸性磷酸酶染色也呈阳性反应，但此酸可被L-酒石酸抑制。 3、T淋巴细胞呈阳性反应，而B淋巴细胞为阴性反应,8、铁染色（Fe染色）：阳性为淡绿色。 细胞内铁观察有核

8、红细胞； 细胞外铁观察骨髓小粒及网状细胞。 意义： （1）铁低见于缺铁性贫血； （2）铁高见于再生障碍性贫血、巨幼红细胞性贫血、白血病、感染和多次输血病人 ； （3）环形铁粒幼细胞（RS），环铁大于15%， 见于RAS,铁粒幼红细胞定义,三、免疫分型,应用：1、确定系来源：利用不同系有特定的抗原表达可以确定髓系/B系/T/NK系/组织细胞和树突状细胞。 2、确定细胞分化阶段：不同发育阶段细胞，其抗原表达不同。 3、预后判断：有些抗原表达和淋巴瘤/白血病预后相关，如白血病患者有CD7+与CD34+共表达，示预后不好。 4、治疗方法选择-治疗靶向 5、疗效判断、复发监测 所以我们可以用于血液疾病的

9、诊断如白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、MDS等；以及一些疾病的鉴别诊断如再障、ITP、MPD。运用于微小残留病灶的监测等,常用的方法：流式细胞术和细胞免疫组织化学染色法,白血病分类中免疫分型的应用与意义,常用的抗原： 1、白血病系列分化抗原 T淋巴细胞白血病：CD3、CD5、CD7。 B淋巴细胞白血病：CD10、CD19、CD22。 NK淋巴细胞白血病：CD16、CD56、CD57。 髓系白血病：CD13、CD14、CD33、MPO（髓过氧化物酶）。 红白血病：GlyA（血型糖蛋白A）。 巨核细胞白血病：CD41、CD42、CD61,2.白血病系列非特异性抗原 CD34、HLADR为早期细胞抗原

10、，无系列特异性，可与CD38联合运用于免疫分型。一般而言，干/祖细胞CD34、HLADR、CD38，原始细胞CD34、HLADR、CD38，而幼稚细胞（如早幼粒细胞）CD34、HLADR、CD38,3、白细胞共同抗原 CD45为白细胞共同抗原，其表达量在淋巴细胞最高，单核细胞，成熟粒细胞，早期造血细胞（blasts）依次减弱。红细胞（中，晚幼红细胞，成熟红细胞）不表达CD45。用SSC/CD45 PerCP双参数分析可十分容易鉴别骨髓和血液中的原始或成熟细胞,AML,1、M0：其特征为T、B细胞标记的阴性（即CD19、CD20、CD22与CD3、CD5、CD7、CD10）。作为干、祖细胞标记的

11、CD34、CD38和HLA-DR均为阳性，具有特征性的TdT标记应有至少30%的原始细胞会呈阳性表达。而髓系特征不能过多，通常是CD13、CD33、CD117中的任何一项呈阳性表达；CD68、MPO大多阴性。若髓系有两个以上标记呈阳性，应考虑未成熟的急性髓细胞白血病,2、M1：M1与M0相似不易区分， M1一般CD13、CD33、 HLA-DR，但CD34表达少于M0， 可能表达部分CD15。 3、M2：M0与M1的主要区别是成熟度增加，CD15较M1较显著，CD34弱于M1，CD13有时表达强于CD33，多数病例HLADR（-）。 4、 M3：高颗粒性，多数情况HLADR（-）或表达减少，C

12、D34少于M2、一般CD13弱（），可有CD2表达,5、 M4与M5：两型表型相似，但M4较M5表达更多的CD34（），重要的表型为CD13、CD33、HLADR、CD14和CD15，CD33可表达强于CD13；CD33（）、CD13（）、CD34（）很可能为M5，但只出现在少数病人中，部分M5可见CD56（,6、 M6：M6较少见且特征不明显， 一般HLADR，CD34、CD13、 CD33阳性。 7、 M7：巨核细胞白血病，在AML中少于1。一般CD61（Gpa）和/或CD41（Gpb-a）阳性，而注意由于血小板粘附造成的假阳性以及一些不明原因出现的假阴性。这时候可以借助于小巨核酶标（CD

13、41免疫组织化学染色,ALL,WHO分型分为B祖细胞型，CD10或CD10，前B细胞型，B细胞型，T细胞型,1、B祖细胞型ALL：FAB标准的L1或L2，一般TdT(+)HLA-DR(+)，CD19(+)，此型又分为2个亚型，CD10和CD10，前者预后好，多数病例CD24，CD34，CD20表达随成熟度增加而增加,2、前B细胞型ALL：一般为CD19，CD24，HLADR，胞浆CD22，CD10，TdT随CD20变化，CD34多为阴性,3、B细胞型ALL：即成熟B细胞型ALL；即FAB标准的L3，表型为CD19、CD20、CD22、CD24且sIg（多数为IGM）阳性，多数病例CD10,4、

14、TALL：表达CD1、CD2、CD5、CD7、CD4/ CD8双阳与极少膜表面CD3、TdT多为阳性。另一常见亚型为皮质早期表达CD2、CD5、CD7、TdT强表达。髓质期亚型表达CD2、CD5、CD7、与CD3CD4/CD3+CD8+,很少见TdT表达,杂合型白血病,随着流式技术的广泛应用，我们发现许多病例并不能严格划分为淋系或髓系，真正的双表型病人多为t(9；22)或（11q23），现在杂合型的误诊率很高。最重要的系特异性抗原在B系、T系、髓系分别为CD22、CD3和MPO,即染色体异常 包括染色体的结构和数量异常 根据这些特征性的异常，对恶性血液病进行诊断和分类、预后分层及指导治疗,四、

15、细胞遗传学,核型描述,首先列出染色体总数，然后是性染色体组成，接着列出异常的染色体数目或形态。下列统一的命名符号： A-G 染色体组的名称 1-22 染色体编号 X,Y 性染色体 del 缺失 der 结构重排的染色体 dup 重复 inv 倒位 t 易位 +/- 在染色体符号前表示染色体增加或减少，在染色体符号后表示染色体多出或缺少一部分,人类23对染色体,上面的核型描述就是46，XY。 例如46，XY， t(8;21)(q22;q22,一）、染色体检测在白血病中的意义,1950,1960,1970,1980,1990,2000,2010,确定染,色体数 目=46,发现Ph,发现+21,各种

16、显带技术,出现；发现多 数AL患者伴 有染色体异常,FISH出现； 阐明某些染 色体异常的 分子学改变,SKY,CGH PCR技术 FLT3-ITD(1996) c-KIT突变（1993）,芯片技术：cDNA array Array-CGH、SNP-array、 测序技术的发展 大量基因突变的发现： JAK2、NPM、CEBPA、 PAX5、IKZF1、FLT3、 RUNX1、WT1、RAS、 NOTCH1,新一代高,通量测序 技术；各 种遗传学 改变间的 相互作用,血液肿瘤遗传学研究的历史,多数AML患者有非随机性染色体改变，包括易位,倒位、插入、缺失、扩增、等臂染色体等,染色体异常在AML

17、诊断、分型、预后评价、发病机,制研究及靶向治疗药物研发方面有重要价值,一些特殊的细胞遗传学异常在WHO分型建议中已被,列为特殊亚型,对不同细胞遗传学类型的血液肿瘤患者进行个体化治,疗可以获得更好的疗效,AML常见染色体异常,t(8;21) t(15;17,10% 8,inv(16)/t(16;16) 11q23异常,5-10% 3-5,30,20 45,单一异常：45% 2种异常：55,5/5q-；-7/7q-；8； -Y；+11；+13；+21; +22 3q26； del(9q) t(6;9)； t(9;22)等,AML的WHO分型,伴再现性遗传学异常的AML 伴多系发育异常的AML 继发

18、于MDS；无MDS病史,治疗相关性AML,烷化剂相关；拓扑异构酶抑制剂相关；其它,无法分类的AML 髓细胞肉瘤,Downs综合征相关AML,伴再现性遗传学异常的AML,AML with t(8;21)(q22;q22) AML with inv(16)(p13.1q22) or t(16;16) APL with t(15;17)(q22;q12) AML with t(9;11)(p22;q23) AML with t(6;9)(p23;q34) AML with inv(3)(q21q26.2) or t(3;3) AML -M7 with t(1;22)(p13;q13,RUNX1-RU

19、NX1T1 CBFB-MYH11 PML-RARA MLLT3-MLL DEK-NUP214 RPN1-EVI1 RBM15-MKL1, AML with mutated NPM1 ? AML with mutated CEBPA 通常AML的诊断标准，原始细胞比例为20%，但如果t(8;21)、t(15;17) 或inv(16)阳性，则不论原始细胞比例为多少，白血病诊断成立,AML染色体异常的预后分级,预后等级 好 中 差,核型类型 t(8;21)、 t(15;17)、 inv(16) 正常、+8、+21、+22、 del(9q)、del(7q) 、t(9;11)(p13;q23) -5、d

20、el(5q)、-7、inv(3)、复杂异常、t(8;16)(p11;p13) 、 inv(3)(q21q26) 、 11q23异常（t(9;11)除外）、 t(6;9)(p23;q34)等,二）、染色体在MDS中的意义。 已报道的MDS患者骨髓细胞染色体核型异常较多,其中以5、7、+8、5q、7q、11q、12q、20q较为多见。经过很多作者反复证实，MDS患者有无染色体异常以及异常的类型对于诊断分型、评估预后和治疗决策都具有极为重要的意义,因此，细胞遗传学检查必须列为MDS常规检测项目之一,MDS的重现染色体异常,非平衡异常：+8，-7或del(7q),-5或del(5q), del(20q

21、),-Y, i(17q)或t(17p),-13或del(13q),del(11q),del(12p)或t(12p),del(9q),idic(X)(q13) 其中+8，del(20q),和-Y，在不符合形态学标准的情况下不能作为MDS的确诊依据 平衡异常：t(11;16)(q23;p13.3), t(3;21) (q26.2; q22.1), t(1;3)(p36.3;q21.1),t(2;11)(p21;q23),inv(3)(q21q26.2), t(6;9)(p23;q34,MDS预后判断,MDS的国际预后积分系统（IPSS,五、分子生物学检测,分子诊断常用技术,核酸分子杂交技术 荧光原

22、位杂交（FISH） 聚合酶链反应（PCR）技术 实时荧光定量PCR、多重PCR技术 基因测序 Sanger 测序法、二代测序技术,荧光原位杂交 (FISH,生命科学中的“钓鱼” 技术 原理：通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交 目的：获得细胞内多条染色体或多种基因状态的信息,荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization, FISH,FISH检测BCR/ABL融合基因,BCR/ABL 基因正常,BCR/ABL基因融合,9号,22号,双色单融合探针，检测染色体易位,abl,bcr,聚合酶链反应PCR,按照上述步骤重复操作，PCR产物呈指数扩增

23、模板DNA 扩增倍数T=2n (n: 循环次数,Sanger 测序法,DNA双脱氧链终止法测序,各个平台的特点,血液病分子诊断的意义,CBFB/MYH11 AML1/ETO PML/RARa E2A/PBX1 MLL/AF4 BCR/ABL TEL/AML1 SIL/TAL1 EVI1 HOX11 MLL/AF10 MLL-AF9 MLL/ENL NPM1/ALK NPM/MLF1,MLL/ELL MLL/AFX MLL/AF1q MLL/AF1p PLZF/RARa MLL/AF6 MLL/MLL（dupMLL） TLS/ERG TEL/PDGFR TEL/ABL SET/CAN DEK/C

24、AN MLL/AF17 E2A/HLF NPM/RARa AML1/MDS1,CBFB/MYH11：Inv(16)(p13q22)是急性髓系白血病(AML)特征性染色体异常，通常见于AML-M4Eo亚型，占总AML患者的10%，其中50发生在AML-M4Eo中。 带有Inv(16)(p13q22)的病人通常有较好的预后。该基因阳性的病人，可用于疗效监测和微小残留的检测,AML1/ETO：出现在所有的t(8,21)阳性的AML中， 同时也出现在具有复杂移位的t(8,21)阴性的AML病例中。 其主要出现在AML-M2这一亚型中，大约有20-40%病例具有t(8,21)。在非常少见的AML-M1，

25、AML-M4和t-AML中也有报道。 t(8,21)异位是一个较好的标志，它的存在使这类病例对一些药物有较好的反应。因此基于细胞遗传学和分子遗传学的检测结果，可以为病人选择风险低的较好的治疗方案。该基因阳性的病人，可用于疗效监测和微小残留的检测,PML/RARa：t(15,17)易位是APL的一个典型标志，其易位造成了15号染色体上的PML基因和17号染色体上的RARa基因的融合，产生了一个融合基因PML/RARa。 检测PML/RARa融合基因的存在与否，对APL的诊断，判断ATRA的疗效和预后复发都非常重要。PML/RARa阳性强烈预示着复发的可能，而其持续性阴性则预示病人有更长的生存期。

26、该基因阳性的病人，可用于疗效监测和微小残留的检测,PLZF/RARa：t(11;17)(q23;q21)易位，特定的在急性早幼粒白血病或急性非淋巴细胞白血病M3型中发现。功能尚不明确。 预后明显差与有t(15;17)易位的ANLL M3型，其对ATRA的化疗无反应。 NPM/RARa:t(5;17)(q35;q22)易位发生于急性非淋巴细胞白血病，见于M3，即急性早幼粒细胞白血病。 病例少，有记载的只有2例儿童病例，2例的复发时间都短，预后可能不乐观,BCR/ABL：在超过95%的CML病人的白血病细胞中，30%（20-50%）的成人ALL和2-10%的儿童ALL中，以及小于2%的淋巴瘤和骨髓

27、瘤的病例中有BCR/ABL融合基因。在CML中BCR/ABL大部分是p210型的，少许p190，极少数p230。ALL患者的BCR/ABL融合基因是p190型（60%） 。 在ALL中，Ph阳性和随之出现的BCR/ABL融合基因是一个非常不好的标志，它影响着病人血相的完全缓解率和可能的生成率。该基因阳性的病人，可用格列卫进行治疗，并可进行疗效监测和微小残留的检测,E2A/PBX1：t(1:19) 的ALL中检测到，尤其是前B-ALL病例中。临床症状都比较凶险。该基因阳性的病人，可用于疗效监测和微小残留的检测。 MLL/AF4：见于与t(4;11)相关的前BALL。预后不良但该融合基因的存在似乎

28、能增强高剂量的Ara-C的疗效。可用于疗效监测和微小残留的检测。 TEL/AML1：见于t(12;21)(p13;q22) 儿童ALL。都是前B细胞ALL。其白细胞比较低。预后较好，复发较迟。可用于疗效监测和微小残留的检测。 EVI1：定位于染色体3q26。见于MDS和CML。预后不良,MLL/ELL: t(11;19)(q23;p13.1)占11q23异常的3.8%，为AML特征性异常，年龄以成人为主。白细胞 20109/L，FAB分型M4或M5，预后不良，2年无病生存率50%。 NPM/MLF1： t(3;5)(q25.1;q34)易位，在MPS,MDS,ANLL（M2,M4,M6）中有发现。 预后非常差1，中位生存期少于1年,FLT3-ITD，Fms样酪氨酸激酶3-内服串联重复序列，13q13.1 NPM1，核仁磷酸蛋白1，5q35,急性髓系白血病,急髓相关突变检测,FLT3-TKD，Fms样酪氨酸激酶3-TK区域点突变，13q12，预后不良,CEBPA基因位于19q13.11，CCAAT盒/增强子结合蛋白，粒细胞分化过程中起重要作用